Transplante de células olfativas Ensheathing para avaliar a recuperação funcional após a lesão do nervo periférico

Resumo

Células olfativas ensheathing (OECO) são células da crista neural que permitem o crescimento dos neurônios olfativos primários. Esta propriedade específica pode ser utilizado para transplantação celular. Apresentamos aqui um modelo de transplante celular baseado na utilização de OECs em um modelo de lesão do nervo laríngeo.

Resumo

Células olfativas ensheathing (OECO) são células da crista neural que permitem o crescimento e rebrota dos neurônios olfativos primários. Com efeito, o sistema olfactivo principal é caracterizado pela sua capacidade de dar origem a novos neurónios, mesmo em animais adultos. Esta capacidade particular, é, em parte, devido à presença de OECs que criam um microambiente favorável neurogenesis. Esta propriedade de OECs foi utilizado para transplantação celular, tal como nos modelos de lesão da espinal-medula. Embora o sistema nervoso periférico tem uma maior capacidade de regeneração após lesão nervosa do que o sistema nervoso central, seções completas induzir misrouting durante rebrota axonal em particular após facial da secção do nervo laríngeo. Especificamente, o corte total do nervo laríngeo recorrente (NLR) induz rebrota axonal aberrante resultando em sincinesias das cordas vocais. Neste modelo específico, nós mostramos que o transplante OECs aumenta eficiência axonal rebrota. ve_content "> OECs são constituídas de várias subpopulações presentes tanto na mucosa olfactiva (OM-OECO) e os bulbos olfativos (OB-OECO). Apresentamos aqui um modelo de transplante celular baseado na utilização destas diferentes subpopulações de OECs numa modelo de lesão do NLR. Usando este paradigma, culturas primárias de OB-OECs e OM-OECs foram transplantadas em Matrigel após secção e anastomose do NLR. Dois meses após a cirurgia, foi avaliada animais transplantados por análises complementares com base na videolaringoscopia, eletromiografia (EMG) e estudos histológicos. Primeiro, videolaringoscopia nos permitiu avaliar as funções laríngeas, em particular co-contrações musculares fenômenos. Então, EMG analisa riqueza demonstrada e sincronização de atividades musculares. Finalmente, estudos histológicos com base em azul de toluidina permitiu a quantificação do número e perfil de fibras mielinizadas.

Todos juntos, vamos descrever aqui como isolar, cultura, identify e transplante OECs da OM e OB após NLR seção-anastomose e como avaliar e analisar a eficiência dessas células transplantadas sobre as funções de rebrota e laringe axonal.

Introdução

O sistema olfactivo principal é composto de duas partes distintas: a mucosa olfactiva (OM) no sistema nervoso periférico e o bolbo olfactivo (OB), no sistema nervoso central. O sistema olfactivo principal é caracterizado pela capacidade de os neurónios olfactivos primárias (PON) para a auto-renovação ao longo da vida em espécies de mamíferos. Esta capacidade torna-se possível devido à presença de células estaminais neurais na OM. PON crescimento e rebrota da OM para OB é facilitada pelas células gliais especializadas chamadas células olfativas ensheathing (OECO). OECs são células da crista neural que criam um microambiente favorável para a neurogênese do PON da OM pa....

Protocolo

1. Culturas primárias de Mucosa olfativa e olfativo Lâmpadas

1. Antes de dissecção
   1. Adicione médio, para 50 ml, por adição de 44 ml de livre de cálcio de Dulbecco Modificado de Eagle / meio de Ham F12 (DMEM/F12), suplementado com 5 ml de soro fetal de bovino (FBS) e 1 ml de penicilina / estreptomicina.
   2. Bata de 75 centímetros ² frascos com poli-L-lisina (50 ug / ml, 1,5 ug / cm ^2), 1 h à temperatura ambiente.
   3. Lavar frascos com PBS 1x.
   4. Armazene os frascos revestidos na geladeira por até 1 semana.
2. Dissecação
   1. Qualquer método de eutanásia deve ser previamente aprovado pelo cui....

Resultados

Ilustrações com controle e reinervadas (/ anastomosados ​​seção) animais foram escolhidos como os resultados podem variar de acordo com os transplantes celulares realizados (OM, OB ou OM + OB).

Cultura celular
As células aderem rapidamente à superfície do plástico e tornou-se agrupadas em faixas paralelas de células que são alongadas ou afilada, triangular, multipolar, ou em forma de fuso (Figuras 1A e 1B). Após 8 dias de fluxo in .......

Discussão

As técnicas apresentadas aqui fazer OECs um modelo útil para estudar transplantes celulares em modelos de lesão de nervos periféricos. O protocolo de cultura de células é relativamente simples e pode ser facilmente levada a cabo. Por outro lado, os procedimentos cirúrgicos, em particular o capítulo / anastomose da NLR, exigem experiência e devem ser realizadas por pessoal qualificado.

Os procedimentos descritos neste protocolo destacar fatores importantes para focar de forma a obter os melho.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM/F12	Invitrogen	E3521T
FBS	Invitrogen	E3387M
Penicilina/estreptomicina	Invitrogen	1152-8876
HBSS	Invitrogen	M3467Y
Tripsina-EDTA	Invitrogen	M3513P
Cacodilato	Merck	1.03256.0100
DDSA	Biovalley	00563-450
MNA	Biovalley	00886-450
BDMA	Biovalley	00141-100
Polybed 812	Biovalley	08791-500
PE anti-mouse	BD Bioscience	550589
Matrigel GFR	BD Bioscience	356231
Collagenase A	Roche	10103586001
Mouse anti P75	Chemicon	MAB 365
11.0 Wire	Ethicon	FG 2881
Toluidine Blue	Ral Diagnostics	361590-0025
Centrífuga	Sigma Sigma	2-16PK
Incubadora	Thermo Scientific
Capa de fluxo laminar	Faster	BH-EN 2003 S
Citômetro de fluxo	BD Bioscience	FACSCalibur
Microscópio	Zeiss
Videolaringoscópio	Karl Storz Endoskope	Telecam SL NLSC Sistema de aquisição de 20212120
	AD Instruments	Sistema
Sistema de Ultramicrotomia Pyramitome	Leica	Ultracut S
Sistema de análise de imagem	Explora Nova	Mercator

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