Controle quantitativo e temporal de oxigênio Microenvironment no Ilhéu Individual

Summary

O controle microfluídico de oxigênio confere mais do que apenas conveniência e velocidade em relação às câmaras hipóxicas para experimentos biológicos. Especialmente quando implementado por difusão através de uma membrana, o oxigênio microfluídico pode fornecer modulações simultâneas de fase líquida e gasosa no nível de microescala. Esta técnica permite experimentos multiparamétricos dinâmicos críticos para o estudo da fisiopatologia das ilhotas.

Abstract

Oxigenação simultânea e monitoramento de fatores de glicose no acoplamento estímulo-secreção em uma única técnica é fundamental para a modelagem de estados fisiopatológicos da ilhota hipóxia, especialmente em ambientes de transplantes. Técnicas de câmara de hipóxia padrão não pode modular os estímulos, ao mesmo tempo, nem fornecer monitoramento em tempo real dos fatores de glicose no acoplamento estímulo-secreção. Para superar estas dificuldades, aplicamos uma técnica de micro várias camadas de integrar tanto aquosa e modulações de fase gasosa através de uma membrana de difusão. Isto cria uma sanduíche estimulação em torno das ilhotas microscaled dentro do polidimetilsiloxano transparente dispositivo (PDMS), que permita o controlo dos factores de acoplamento acima mencionadas, através de microscopia de fluorescência. Além disso, a entrada de gás é controlado por um par de microdispensers, proporcionando, modulações quantitativos sub-hora de oxigénio entre 0-21%. Esta hipóxia intermitente é aplicada para investigar um novo fenômeno da ilhat pré-condicionamento. Além disso, armado com microscopia multimodal, fomos capazes de olhar para o cálcio detalhada e dinâmica do canal K _ATP durante esses eventos hipóxicos. Nós encaramos hipóxia microfluídica, especialmente a técnica de dupla fase simultânea, como uma valiosa ferramenta no estudo de ilhotas, assim como muitos ex vivo tecidos.

Introduction

A hipóxia dinâmica é importante em biologia, especificamente para transplantes de ilhotas

A hipóxia dinâmica é um importante parâmetro fisiológico e fisiopatológico em muitos tecidos biológicos. A mudança no oxigênio, por exemplo, é um potente sinal de desenvolvimento na angiogênese. Além disso, os padrões espaciais e temporais na hipóxia modulam o HIF1-alfa e desempenham papéis em doenças como o câncer de pâncreas. A hipóxia também é um fator de confusão que afeta os resultados do transplante de ilhotas. Recentemente, oscilações temporais de hipóxia, ou hipóxia intermitente (HI) demonstraram benefícios no "pré-condicionamento" das ilhotas¹. No entanto, os efeitos da hipóxia estática e transitória na fisiologia das ilhotas ainda não foram bem compreendidos ou estudados, principalmente devido à falta de ferramentas apropriadas para controlar o microambiente das ilhotas.

As ilhotas são bem vascularizadas in vivo

As ilhotas pancreáticas são agregados esferoidais de 50-400 μm de células endócrinas, incluindo células beta e células alfa responsáveis pela homeostase da glicose. Quando as ilhotas são expostas à glicose estimuladora no sangue, a captação e a glicólise levam à produção de ATP, que abre os canais de potássio sensível ao ATP (K_ATP) e resulta no influxo de cálcio que desencadeia a exocitose dos grânulos de insulina. O oxigênio é importante para conduzir esse processo altamente metabólico e a secreção de insulina é significativamente influenciada pela dinâmica do fluxo sanguíneo e do suprimento de oxigênio, além dos gradientes de glicose. As ilhotas executam prontamente essa resposta glicose-insulina in vivo, pois são altamente perfundidas no pâncreas, cada uma dentro de um comprimento de célula de um vaso capilar. No entanto, a densa rede de capilares intrailhéus é removida pela colagenase durante o isolamento das ilhotas^2,3. Consequentemente, os suprimentos de oxigênio e nutrientes são restritos a um perímetro de 100 μm devido a limitações de difusão.

As técnicas atuais têm sucesso limitado na recriação do microambiente das ilhotas

Recriar a dinâmica nativa de oxigênio e glicose das ilhotas, fundamental para modelar as condições fisiológicas e fisiopatológicas, é difícil de alcançar com câmaras hipóxicas padrão que requerem fluxo elaborado e carecem de monitoramento contínuo das funções das ilhotas. Além disso, as terapias de transplante para diabetes tipo I expõem ilhotas isoladas à hipóxia no sistema porta hepático⁴, que tem pO₂ muito menor (<2%, 5-15 mmHg) em comparação com o pâncreas fisiológico (5,6%, 40 mmHg). Após o transplante, os enxertos de ilhotas levam duas semanas ou mais para serem revascularizados. Foi demonstrado que a exposição hipóxica prejudica o mecanismo de acoplamento glicose-insulina das ilhotas. Entre os fatores de acoplamento estímulo-secreção, a sinalização de cálcio, os potenciais mitocondriais e a cinética da insulina podem ser facilmente monitorados usando microfluídica. Nossa técnica microfluídica anterior demonstrou esse monitoramento em tempo real com modulação precisa do microambiente aquoso em torno de uma única ilhota^5,6. No entanto, a quantificação do comprometimento hipóxico das ilhotas é frustrada pela falta de técnicas simultâneas de estimulação e monitoramento. Portanto, a combinação do controle microfluídico do oxigênio e do monitoramento das ilhotas pode melhorar os estudos de hipóxia das ilhotas.

A microfluídica pode recriar e modular o microambiente aquoso e de oxigênio

A técnica padrão para estudos de hipóxia de tecidos e cultura tem sido baseada em câmaras hipóxicas. Em geral, as câmaras hipóxicas fornecem concentrações únicas de oxigênio com tempos de equilíbrio em ~ 10-30 min, incompatíveis com a hipóxia dinâmica em escala de minutos. Dois estudos recentes usaram pequenas câmaras personalizadas para exposição intermitente à hipóxia em camundongos inteiros, com resultados conflitantes sobre a resposta à insulina induzida por glicose^7,8. Tenha em mente que, no nível de todo o animal, o oxigênio respirado não é traduzido diretamente para o pO₂ capilar das ilhotas, devido aos controles no sistema respiratório. Além disso, esses estudos não têm níveis padronizados de oxigênio, nem fornecem medidas em tempo real no nível do tecido das ilhotas.

Por outro lado, a microfluídica de oxigênio pode superar essas limitações controlando o oxigênio por meio de redes de canais de gás. Além disso, a microfluídica é compatível com imagens ao vivo durante a modulação do oxigênio, um feito atualmente não possível com câmaras hipóxicas padrão. Várias dessas novas abordagens microfluídicas utilizam a permeabilidade ao gás do polidimetilsiloxano para dissolver as concentrações de oxigênio em microcanais que fluem o meio sobre as^{células-alvo 9-14}. Esses dispositivos também integraram várias concentrações discretas de oxigênio, sensores de oxigênio baseados em fluorescência e até geração química de oxigênio no chip.

A microfluídica baseada em solvatação líquida tem dificuldade em manter gradientes estáveis e contínuos, pois depende da mistura convectiva, que é sensível às condições de fluxo. Em comparação, a técnica que usamos aqui se concentra em diminuir o caminho de difusão do fornecimento de oxigênio. A solvatação do gás e o fluxo de cisalhamento são eliminados pela difusão direta de oxigênio através de uma membrana semeada com células ou tecidos de ilhotas. Isso remove a microfluídica extra necessária para controlar a solvatação e evita tensão de cisalhamento desnecessária nas ilhotas, que por si só pode desencadear a liberação de insulina. Esta plataforma tem sido usada para demonstrar a regulação positiva de espécies reativas de oxigênio (ROS) em extremos hiperóxicos e hipóxicos (2-97% O₂) em cultura de células^1,15. Devido ao fornecimento direto de oxigênio e à remoção do fluxo de cisalhamento, nossa plataforma baseada em difusão fornece a solução microfluídica ideal para estudar a hipóxia das ilhotas.

Estimulação e monitoramento multimodal

A microfluídica baseada em difusão também traz benefícios adicionais quando adaptada para estudar a microfisiologia das ilhotas. Ao usar uma membrana como barreira de difusão, o líquido pode ser isolado das modulações de oxigênio, permitindo o controle de estímulos aquosos de glicose independentemente dos estímulos hipóxicos. Isso cria uma estimulação simultânea semelhante a um sanduíche que aponta espacialmente a entrega às ilhotas. Além disso, como o gás é modulado temporalmente por meio de microinjetores computadorizados, podemos modular a concentração de oxigênio de 21-0% digitalmente com tempo transitório inferior a 60 segundos. Os controles dinâmicos do microambiente de oxigênio e glicose no microscópio permitem um protocolo multimodal em tempo real que não seria possível ou extraordinariamente complicado usando câmaras hipóxicas padrão. Usando este dispositivo, a sinalização de cálcio (Fura-AM), os potenciais mitocondriais (Rodamina 123) e a cinética da insulina (ELISA) foram monitorados para fornecer uma imagem completa da resposta dinâmica glicose-insulina sob hipóxia.

Protocol

1. Preparando as ilhotas do rato

1. Dissecar camundongos C57BL / 6 e isolar ilhotas por digestão de colagenase e separação de gradiente de densidade de Ficoll. (Consulte os artigos JOVE referenciados em^2,3).
2. Incubar ilhotas em meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina e 20 mM de HEPES em placas de Petri (37 °C, 5% de CO₂). Pós-isolamento, ilhotas de cultura por 24 horas antes do uso em experimentos. Use as ilhotas dentro de 1-2 dias para garantir resultados consistentes.

2. Fazendo a plataforma microfluídica

1. Gere as geometrias da microestrutura em fotomáscaras de transparência para cada camada do dispositivo: 1) entrada e saída, 2) camada microfluídica de glicose com câmara de perifusão (8 mm de diâmetro x 3 mm, 150 μl), 3) membrana de 200 μm com micropoços (500 μm de diâmetro, 100 μm de profundidade) e 4) camadas microfluídicas de gás.
2. Para fabricar a camada de entrada e saída, despeje PDMS desgaseificado e pré-misturado a uma altura de 1,5 mm em uma placa de Petri em branco e cure a 80 ° C por 2 horas. Perfure as portas de entrada / saída de 2 mm de diâmetro.
3. Para fabricar a camada microfluídica de glicose, gire duas camadas de 350 μm de SU8-2150 para formar uma única camada de 700 μm em um wafer de silício de 4 pol.
   1. Exponha a luz UV através da fotomáscara apropriada para transferir o padrão de microcanal para o SU8 após o desenvolvimento, produzindo um mestre de 700 μm de altura.
   2. Despeje o PDMS desgaseificado e pré-misturado neste mestre a uma altura de 3 mm e catalise a 80 °C por 2 horas. Corte este PDMS para moldar com uma lâmina de barbear.
   3. Perfure portas de entrada/saída de 2 mm de diâmetro, bem como a câmara de 8 mm de diâmetro.
4. Para fabricar a membrana de 200 μm com micropoços, gire SU8-2100 para 100 μm. Aplique a mesma litografia UV para transferir padrões de micropoços para este mestre de 100 μm de altura.
   1. Gire o PDMS desgaseificado e pré-misturado neste mestre a 900 rpm por 30 segundos e cure a 80 ° C por 10 min. Gire uma segunda camada sobre a primeira usando as mesmas condições, resultando em uma membrana PDMS de 200 μm contendo padrões de micropoços.
   2. Perfure portas de entrada/saída de 2 mm de diâmetro através desta membrana
5. Para fabricar a camada microfluídica de gás, gire SU8-2100 para 100 μm. Aplique a mesma litografia UV para transferir padrões microfluídicos de gás para este mestre de 100 μm de altura.
   1. Despeje o PDMS desgaseificado e pré-misturado neste mestre a uma altura de 1.5 mm e catalise a 80 °C por 2 horas. Corte o PDMS no formato com uma lâmina de barbear.
   2. Perfure portas de entrada/saída de 2 mm de diâmetro através desta camada
6. Para unir as várias camadas, prepare-as limpando com fita adesiva, expondo ao arco corona e, em seguida, alinhando-as manualmente na seguinte ordem.
   1. Cole a membrana à camada de gás inferior com os micropoços voltados para cima.
   2. Cole a glicose microfluídica no topo da membrana do micropoço.
   3. Cole a camada de entrada e saída na parte superior, encapsulando todo o conjunto.
   4. Reforce a colagem adicionando 1 kg de peso por cima e assando a 100 °C por 3 horas.
7. Teste o dispositivo completo carregando água na camada aquosa e, em seguida, submergindo todo o dispositivo na água. Em seguida, flua o ar através da camada de gás com uma seringa vazia.
8. Esterilizar os dispositivos sem fugas com etanol a 70% através da camada aquosa e, em seguida, lavar com tampão PBS, no qual o dispositivo é armazenado a 4 °C até à utilização.

3. Configuração do microdispensador

1. Obtenha 2 microdispensadores, fontes de alimentação de 5 V e 20 V DC e uma placa de E/S digital para construir a configuração de mistura e entrega de oxigênio.
   1. Conecte os cabos de controle dos microdispensadores às unidades de acionamento incluídas.
   2. Conecte os drivers à placa de E/S digital nas portas correspondentes aos controles do Labview.
   3. Conecte as fontes de alimentação de 5 V e 20 V aos contatos correspondentes nas unidades de acionamento.
   4. Conecte a E/S digital a um laptop para executar códigos Labview para controle de gás (Apêndice).
2. Conecte um microdispensador ao nitrogênio enquanto outro ao ar comprimido, ambos com 5% de CO₂. Defina ambos os gases para 2 psi. Conecte as saídas dos dispensadores em uma junção em T antes de entrar no dispositivo microfluídico.
3. Usando um dispositivo testado contra vazamentos, caracterize a resposta transitória da modulação de oxigênio alternando os microdispensadores entre 5-21% de oxigênio, enquanto mede o oxigênio dissolvido na água com um sensor de oxigênio de fibra óptica (consulte a lista de equipamentos e os resultados representativos).

4. Configurando na microscopia

1. Monte o dispositivo no aquecido stage no microscópio invertido.
2. Conecte os gases 0% e 21% O₂ ao dispositivo e calibre com o sensor de oxigênio.
3. Conecte a porta de saída da microfluídica de glicose a um coletor de frações.
4. Prepare o tampão de bicarbonato Krebs Ringer (KRB): 129 mM NaCl, 5 mM NaHCO₃, 4.7 mM KCl, 1.2 mM KH₂PO₄, 1 mM CaCl₂ · 2H₂O, 1.2 mM MgSO₄ · 7H₂O, 10 mM HEPES pH 7.35-7.40, 2 mM de glicose basal e 5% de FBS.
5. Preparar duas soluções-tampão contendo, respectivamente, 2 mM e 14 mM de glicose, em tubos cónicos de 50 ml, banhados em banho-maria a 37 °C.
6. Conecte uma bomba peristáltica para extrair o tampão a 250 μl/min na tubulação. Flua a tubulação sobre uma placa de aquecimento a 37 °C antes de entrar no dispositivo microfluídico.
7. Para corar as ilhotas, adicione Fura-2 AM em DMSO e Rh123 em etanol 100% a 2 ml de KRB para atingir concentrações finais de corante de 5 μM e 2,5 μM, respectivamente.
8. Pegue ilhotas com uma pipeta de 10 μl e incube em corantes por 30 min a 37 ° C.
9. Carregue aproximadamente 20 ilhotas no dispositivo através da entrada do microcanal de glicose. Direcione as ilhotas para a câmara preparando o tampão da saída de volta para a entrada.
10. Perfunda as ilhotas em tampão por 10 min para lavar o excesso de corantes.

5. Executando a estimulação simultânea de oxigênio e glicose

1. Forneça um pulso de estimulação de glicose com 5 min de linha de base estabelecida por KRB2, seguido por 15 min de estimulação de 14 mM e, em seguida, lave por 15 min em KRB2.
2. Recorde o comprimento de onda de excitação de 340/380 nm para Fura-2 e 534 emissão para Rh123.
3. Fazer medições de um pulso normal (14 mM normóxico) antes de cada experimento.
4. Para modulação de oxigênio (hipóxia/hipóxia intermitente), aplique apenas fluxo tampão durante as etapas de estimulação e lavagem e nenhum fluxo em outras etapas, para minimizar distúrbios convectivos.
5. Colete efluentes da saída de glicose em intervalos de 1 minuto para o ensaio de insulina ELISA.

Results

Central para esta técnica de hipóxia de ilhotas é a capacidade de modular a estimulação da fase aquosa e gasosa na mesma câmara microfluídica com transientes em escala de minutos. A Figura 1 é um resultado representativo das a) estimulações duplas e b) modulações rápidas medidas dentro da câmara das ilhotas. A modulação aquosa, mostrada pela introdução de fluoresceína na câmara, atinge o equilíbrio em três a quatro minutos de mistura. Além disso, o oxigênio pode ser escalonado de 5 a 21% com transientes ...

Discussion

As múltiplas modalidades integradas nesta técnica de hipóxia de ilhotas apresentam vários pontos observados aqui para solução de problemas. Primeiro, as ilhotas isoladas continuam a se degradar e se desintegrar em cultura devido às enzimas digestivas das células acinares. Padronizar experimentos para 1-2 dias após o isolamento das ilhotas é, portanto, fundamental para obter resultados consistentes. Em segundo lugar, o fluxo aquoso foi interrompido durante a hipóxia e a hipóxia intermitente para evitar a depuração convect...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
< forte > reagente / material< / forte >
Spinner	Laurell	WS-400
SU8	MicroChem	SU8-2150 / SU8-2100
Placa de aquecimento digital	PMC Dataplate	722A
Lâmpada de cura UV	OmniCure	S1000
PMDS	Dow Chemical	Sylgard 184
Câmara	Corona Wand ETP	BD-20AC
	Bel-Art	420220000
Microdispensadores	The Lee Company	IKTX0322000A
Energia 5 V e 20 V DC	Shack
NI USB	National Instrument	NI USB-6501
Termômetro	Omega Engineering, Inc.
Bomba Peristáltica	Gilson	Minipulse 2
Sensor de Oxigênio	Ocean Optics	NeoFox
Fraction Collector	Gilson	203
Pippette	Fisher Scientific	Finnpipette II 100μ l
Microscópio de Epifluorescência Invertida	Leica	DMI 4000B
Tubos Cônicos de 50 ml	da Fisher Scientific
Sondas Moleculares	Corante de Fluorescência Rodamina 123
HEPES	Sigma-Aldrich Glucose Sigma-Aldrich
Soro Bovino Albumina	Sigma-Aldrich
30 in Tubos de Silicone	Cole-Parmer		1/16 in x 1/8 in 1.5 ml
Eppendorf Tubes	Fisher Scientific
Y-connectors	Cole-Parmer		Conectores de Seringa de 1/16 in e 4 mm
	Cole-Parmer		1/16 in
de	cotovelo Cole-Parmer
			1/16 in