Descreve-se a utilização de dois raciométrica, biossensores codificados geneticamente, que são baseados em GFP, para monitorar estado redox mitocondrial e os níveis de ATP na resolução subcelular em células vivas.
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Artigo de método
Biossensores raciométrica que medem estado redox mitocondrial e ATP em células vivas de levedura
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
As mitocôndrias têm um papel em muitos processos celulares, a partir do metabolismo da energia e homeostase do cálcio para controlar o tempo de vida de celular e morte celular programada. Esses processos afetam e são afetados pelo estado redox e de produção de ATP pela mitocôndria. Aqui, descrevemos o uso de dois, biossensores geneticamente codificados raciométrica que podem detectar estado redox mitocondrial e os níveis de ATP em resolução subcelular em células de levedura viva. Estado redox mitocondrial é medida usando Proteína Fluorescente Verde redox-sensível (roGFP) que é direcionado para a matriz mitocondrial. Mito-roGFP contém cisteínas nas posições 147 e 204 da GFP, que sofrem oxidação e redução reversível e dependente do ambiente, que por sua vez altera o espectro de excitação da proteína. MitGO-ATeam é uma transferência de energia de ressonância Förster (FRET) sonda em que a subunidade ε da F o F 1 ATP sintase é imprensada entre FRET doador e receptor fluoproteínas rescent. A ligação de ATP para as subunidades ε resulta em mudanças de conformação na proteína que trazem o dador e aceitador de FRET em estreita proximidade e permitir a transferência de energia de ressonância de fluorescência do dador ao receptor.
Introdução
As mitocôndrias são organelos essenciais para a produção de ATP, a biossíntese de aminoácidos, ácidos gordos, heme, aglomerados de enxofre do ferro e pirimidinas. As mitocôndrias também desempenham um papel fundamental na homeostase do cálcio e na regulação da apoptose. Uma crescente evidência de ligações mitocôndrias ao envelhecimento e doenças relacionadas à idade, incluindo a doença de Parkinson, doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica e doença de Huntington. 2 Enquanto as pessoas vivem suas vidas inteiras com mutações em proteínas mitocondriais que estão associadas a doenças neurodegenerativas, os sintomas da doença ocorrerem apen....
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Protocolo
1. Transformação de células de levedura com o Biossensores
- Transformar a estirpe de levedura com o plasmídeo desejado Mito-roGFP ou mitGO-ATeam2 usando o método do acetato de lítio 27.
- Para confirmar a transformação com o plasmídeo de biossensor de origem e para evitar a perda do plasmídeo, seleccionar e manter os transformantes no meio completo sintético selectivo apropriado (SC-Ura para Mito-roGFP, ou SC-Leu por mitGo-ATeam2). Se a sonda fluorescente foi subclonado num plasmídeo diferente do que os descritos aqui, o uso do meio selectivo apropriado. Visualiza transformantes por microscopia de fluorescência para confirmar que elas exp....
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Resultados
Medindo estado redox mitocondrial com mito-roGFP
Aqui, mostramos que mito-roGFP1 tem a gama dinâmica para detectar alterações no estado redox mitocondrial de totalmente oxidado a reduzida em células de levedura viva, sem afetar o crescimento de células de levedura ou morfologia mitocondrial. Primeiro, encontramos células que expressam GFP mitocôndrias-alvo e roGFP1 crescer a taxas normais (Figura 1A). A taxa de crescimento máxima, tal como medido pelo declive máximo da curva de.......
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Discussão
Aqui, descrevemos métodos para usar mito-roGFP1 e mitGO-ATeam2 como biossensores para avaliar o estado redox mitocondrial e os níveis de ATP em células de levedura viva. Nós achamos que a expressão de plasmídeo de origem mito-roGFP1 ou mitGO-ATeam resulta em quantitativo direcionamento para mitocôndria, sem qualquer efeito óbvio sobre a morfologia e distribuição mitocondrial ou nas taxas de crescimento celular. 3 Mito-roGFP1 pode detectar alterações no estado redox mitocondrial de altamente oxidado a estados .......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por prêmios de HHMI 56006760 para JDV, o National Institutes of Health (NIH) (2 TL1 RR 24158-6) para DMAW, e da Fundação Médica Ellison (AG-SS-2465) e do NIH (GM45735, GM45735S1 e GM096445) para LP. GM45735S1 foi emitido a partir do NIH sob a Recuperação Americana e Reinvestimento de 2009. Os microscópios utilizados para estes estudos foram apoiados, em parte, através de uma subvenção NIH / NCI (5 P30 CA13696).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagentes | |||
| Antimicina A | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 1397-94-0 | Dissolvido em etanol para uma solução-mãe de 2 mg/ml. |
| Meio de crescimento de levedura SGlyc (à base de glicerol sintético) *omitir para SGlyc-Ura **omitir para SGlyc-Leu | Dissolver em H2O. Ajustar o pH para 5,5 com NaHCO3. Autoclave. Ingredientes: 0,67% Levedura à base de nitrogênio sem aminoácidos 3% Glicerol 0,05% Glicose 2 mg/ml adenina 2 mg/ml uracila* 1 mg/ml L-arginina 1 mg/ml L-histidina 1 mg/ml L-leucina** 3 mg/ml L-lisina 2 mg/ml L-metionina 4 mg/ml L-fenilalanina 2 mg/ml L-triptofano 3 mg/ml L-tirosina | ||
| SC (sintético completo, à base de glicose) meio de crescimento de levedura *omitir para SGlyc-Ura **omitir para SGlyc-Leu | Dissolver em H2O. Ajustar o pH para 5,5 com NaHCO3. Autoclave. Ingredientes: 0,67% Levedura à base de nitrogênio sem aminoácidos 3% Glicose 2 mg/ml de adenina 2 mg/ml de uracila* 1 mg/ml de L-arginina 1 mg/ml de L-histidina 1 mg/ml de L-leucina** 3 mg/ml de L-lisina 2 mg/ml de L-metionina 4 mg/ml de L-fenilalanina 2 mg/ml de L-triptofano 3 mg/ml de L-tirosina | ||
| Valap | Combine os ingredientes na proporção de 1:1:1 (p:p:p). Derreter submergindo em um 70 ° C H2O banho. Alíquota em placas de Petri de vidro. Armazene em temperatura ambiente. Ingredientes: Vaselina vaselina, parafina dura, lanolina | ||
| Equipamento e Software | |||
| Preclean Gold Seal Rite-on Micro Slides | Thomas Scientific (Swedesboro, NJ) | 3050 | Tamanho: 25 x 75 mm; Espessura: 0,93 a 1,05 mm |
| Lamínulas de alto desempenho, No. 1.5, 18x18 mm | Zeiss (Thornwood, NY) | 474030-9000-000 | Estas são menos variáveis em espessura (170± 5 μ m) do que as lamínulas padrão, reduzindo a aberração esférica e melhorando o desempenho da imagem 3D |
| Vidro de Cobertura para Microscópio Fisherbrand, No. 1.5 | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) | 12-545E | Tamanho: 22 x 22 mm, espessura No. 1.5 (170 μ m) |
| Microscópio confocal de varredura a laser A1 com detector espectral e objetiva Apo-TIRF 100x/1.49 NA | Nikon (Melville, NY) | ||
| Microscópio AxioObserver.Z1 equipado com objetiva 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar (Zeiss) e câmera CCD refrigerada Orca ER (Hamamatsu) e controlado pelo software Axiovision | Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Cidade de Hamamatsu, Japão) | ||
| Software de análise de imagem 3D Volocity | Perkin Elmer (Waltham, MA) | Módulo de restauração para deconvolução; Módulo de quantificação para cálculo e medição de proporções | |
| Software ImageJ | Institutes of Health (Bethesda, MD) | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
Referências
- Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6),....
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Reimpressões e permissões
