Abordagens para a frente genéticos em<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Resumo

Descreve-se um método para realizar a análise genética baseada em Chlamydia mutagénese química e sequenciação do genoma inteiro. Além disso, um sistema de intercâmbio de ADN no interior das células infectadas está descrito que pode ser usado para o mapeamento genético. Este método pode ser largamente aplicável a sistemas microbianos sem sistemas de transformação e técnicas de genética molecular.

Resumo

Chlamydia trachomatis, o agente etiológico das doenças sexualmente transmissíveis e infecções oculares, permanece mal caracterizado pela sua intratabilidade a transformação experimental com DNA recombinante. Desenvolvemos uma abordagem para realizar a análise genética em C. trachomatis, apesar da falta de técnicas de genética molecular. O método envolve: i) a mutagénese química para gerar rapidamente extensas bibliotecas de mutantes geneticamente definidos, com fenótipos distintos, ii) de toda a sequenciação do genoma (WGS) mapear as lesões genéticas subjacentes e para encontrar as associações entre o gene mutado (s) e.. um fenótipo comum,. iii) geração de estirpes recombinantes por co-infecção de células de mamíferos com bactérias de tipo selvagem e mutante. Assim, fomos capazes de estabelecer relações causais entre os genótipos e fenótipos. O acoplamento de variação do gene quimicamente induzida e WGS para estabelecer associações correlativos genótipo-fenótipo Should ser largamente aplicável à grande lista de interesse médico e ambientalmente microorganismos importantes actualmente insolúveis para a análise genética.

Introdução

Os obrigatórios bactéria intracelular Chlamydia trachomatis contas para um número estimado de 2,8 milhões de infecções do trato genital por ano nos Estados Unidos (Center for Disease Control) com seqüelas associadas, como a doença inflamatória pélvica, gravidez ectópica e infertilidade (1). Chlamydia spp têm uma única fisiologia, com um ciclo de desenvolvimento bifásico consistindo de duas formas: o corpo elementar infecciosa, mas não replicante (EB), e o corpo reticulado mas não infecciosa replicativo (RB). A infecção inicia-se com a ligação de células epiteliais EBS para endoctyotosis seguidos por (2). Dentro de um vacúolo ligada à membrana denominada a inclusão, EBS diferenciar na forma RB, que, em seguida, replica por fissão binária. No meio do ciclo, as transições para trás para o RBS EBS, os quais são, em seguida, expelido para o espaço extracelular para iniciar novos ciclos de infecção, quando as células hospedeiras de lise (3).

C. trachomatis érefractário à manipulação de rotina com técnicas de genética molecular padrão, tais como a substituição do gene alvo, transposons, e transdução de fagos, que têm sido fundamentais para a maioria dos estudos de genética bacteriana, não é claro até que ponto os genes de Chlamydia individuais contribuem para a evasão da imunidade inata , aquisição de nutrientes, transições de desenvolvimento, ou de outros processos importantes para a sobrevivência do patógeno dentro de um hospedeiro eucarióticas (4). Consequentemente, este patógeno permanece mal caracterizado, apesar da sua importância clínica.

Os genomas de Chlamydia spp. são relativamente pequenas (~ 1 Mb) (5) com várias espécies e biovares seqüenciados utilizando tecnologias de seqüenciamento Próxima Geração. Análise do genoma comparativo por WGS tem proporcionado uma visão única sobre a evolução das espécies por clamídia e sua adaptação para os seres humanos (6-8) e em certa medida já forneceu algumas informações sobre a função potencial de fatores de virulência (9, 10). Tele diversidade genética exibida pelos isolados clínicos não fornece a necessária resolução para mapear sistematicamente a função da maioria dos factores de virulência, presumivelmente porque as mutações nesses genes teria sido prontamente seleccionado contra. Sem efeitos de confusão de seleção natural, a variação do gene mutagênico induzido, juntamente com os ensaios definidos que os defeitos medida em virulência, pode expandir o espectro de mutações que podem ser pesquisados. Mutagénicos químicos, em particular, são úteis como eles podem gerar nulo, condicional hypomorphic (função reduzida), e hipermórficos (ganho de função) alelos. Com a chegada das tecnologias de seqüenciamento de genoma robustas de próxima geração, essas mutações podem ser facilmente identificados e mapeados. Deste modo, as associações fortes podem ser feitas entre as mutações no gene ou uma via genética e um fenótipo comum, permitindo a aplicação de abordagens para a frente genéticos.

As seqüências do genoma de estirpes clínicas revelou mosaicismo bsorovares ntre e locos de recombinação freqüente (11). A evidência empírica de recombinação foi demonstrada através da co-infecção de duas linhagens resistentes aos antibióticos diferentes e seleção de dupla progênie recombinante resistente, que foi revelado para ter contribuições genéticas de duas amostras (12, 13). Assim, a transferência genética entre o tipo selvagem e estirpes mutantes em um ambiente de co-infecção permite a segregação de mutações quimicamente induzidas para identificar o gene afectado que conduz ao fenótipo observado.

Aqui, nós descrevemos um método para realizar a análise genética baseada em Chlamydia mutagénese química, WGS, e um sistema para a troca de ADN no interior das células infectadas (14) (Figura 1).

Protocolo

1. Chemical Mutagênese

Nota: Nós achamos que a forma RB replicativo é mais passível de mutagênese química do que a forma EB. No ciclo médio (entre 18 a 20 hpi), RBs estão em maior números anteriores a RB-EB transição. Porque Chlamydia trachomatis é um agente patogénico intracelular obrigatório, os efeitos do agente mutagénico na saúde do hospedeiro pode limitar a recuperação bacteriana. As células Vero foram encontrados para ser mais resistente aos efeitos adversos de níveis elevados de SEM do que outras linhas de células testadas.

Segregação de mutações por recombinação exige seleção para antibiótico progênie recombinante resistente. Recomendamos a utilização de cepas resistentes aos medicamentos (por exemplo, rifampicina, spectinomicina, ou trimetoprim) para a geração de mutantes para a capacidade de realizar análises recombinante e isolar linhagens isogênicas. Estirpes resistentes aos antibióticos foram produzidos por um processo passo a passo de selecção (15, 16).

Nãoe: Chlamydia trachomatis (estirpe L2 / 434/Bu / ATCC VR902B) é BSL2 patógeno. Consulte os procedimentos operacionais padrão institucionais (SOP) para lidar com esses patógenos.

1. Preparação de células de cultura e infecção:
   1. Semente de aproximadamente 1 x 10 ⁶ células Vero (ATCC CCL-81) por cada 25 cm ² (T25), balão em 3 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS). Incubar a 37 ° C, 5% de CO _2. As células devem formar uma monocamada confluente dentro de 24 h.
   2. Aspirar médio. Infect frascos T25 confluentes de células Vero com Chlamydia a uma multiplicidade de infecção (moi) de 5 (~ 14 x 10 ⁶⁾ num volume total de 3 ml de meio (DMEM, 200 ng / ml ciclohexamida, 10% de FBS).
2. Comece a mutagênese em 18 horas pós-infecção (hpi):
   1. Prepare a 20 mg / mL de EMS (etil metano-sulfonato) em tampão fosfato salino (PBS) com 0,9 mM de cálcioe cloreto de magnésio 0,49 mM em uma capa de segurança química como EMS é um líquido volátil.
      Nota: EMS é um potente agente mutagênico e carcinogênico. Neutralizar desperdiçar EMS e descontaminar derramamentos, plástico, papel e vidro com 1 M de hidróxido de sódio.
   2. Aspirar o meio e lava-se as células uma vez com 3 ml de PBS / _MgCl2 / _CaCl2. Incubar as células com 3 ml de 20 mg / ml em PBS SGA / _MgCl2 / _CaCl2, durante uma hora, no exaustor de fumos, à temperatura ambiente. Células Vero são capazes de sobreviver a esta concentração de EMS e condições fora da incubadora por curtos períodos. Lembre-se de incluir uma amostra de controlo que não tenha sido mutado.
   3. Remova o meio contendo EMS e colocá-lo em um recipiente de NaOH 1 M para inativar o agente mutagênico. Lave as células infectadas três vezes em 3 ml de PBS + _MgCl2 / _CaCl2 para remover mutagénica residual. Adicionar 6 ml de DMEM/10% de FBS, com 200 ng ml ciclohexamida / e 25 ug / ml de gentamicina, e incubar em 5% de CO _{2, 37 ° C durante 48-72 h. Inclusões aparece desprovido de bactérias de cerca de 36 h depois da mutagénese. Em 72 h, cerca de 10% de inclusões são preenchidos com bactérias, enquanto o restante permanece vazio.}
   4. Extraia EBs por lise hipotônica: Completamente aspirar médio. Adicionar 1,0 ml de _H2O e rocha para desalojar as células durante 10 min. Lisar as células por pipetagem para cima e para baixo por, pelo menos, 10 vezes. Recolhe lisado numa microcentrífuga e adicionar 0,250 ml de tampão de fosfato de sacarose 5x glutamato (SPG) para trazer a concentração final de 1x. Armazenar a -80 ° C.
      Observação: O nível de mutagénese pode ser avaliada através da indução de resistência à rifampicina. Para ensaiar a frequência da resistência à rifampicina, a placa 1 10 x ⁸ x 10 e 7 diluições em série de bactérias na presença de 200 ng / ml de rifampicina. A frequência da resistência à rifampicina é definido como o número de placas resistentes a rifampicina, divididos pelo número total de bactérias metalizados. Consulte a seção abaixo para obter instruções de placa.

2. Isolamento clonal de Chlamydia trachomatis cepas mutantes de purificação Plaque

1. Conjunto monocamadas confluentes de células Vero em placas de 6 poços: Semente 0,4 x 10 ~ ⁶ células em 3 ml de DMEM/10% de FBS por poço. Permitir que as células formam uma monocamada homogénea ao longo do próximo 24 h.
2. Descongele solução estoque de Chlamydia mutado no gelo. Realizar 6 x 10 diluições em série em um volume total de 200 ul por diluição em DMEM/10% de FBS e libertá-los em gelo.
   Nota: A título de bactérias em unidades formadoras de inclusão (IFU) é uma boa estimativa de unidades formadoras de placas (pfu). Destinam-se a placa de 10, 100 e 1000 pfu.
3. Lave as células duas vezes com Vero 3 ml de PBS por poço.
4. Adiciona-se 3 ml de DMEM a cada poço para placas de 6 poços e 100 ul das diluições bacterianas em duplicado. Redemoinho da placa para garantir uma mistura.
5. Rodar as placas infectadas em 2.700 xg durante 30 min a 15 ° C, em seguida, incuba-se a 37 ° C num humidificada,5% incubadora de CO ₂ durante 1-2 horas.
6. Prepare a 0,54% de agarose em DMEM (de 6 poços):
   1. Adicionar os seguintes ingredientes: 18,9 mL 2x DMEM frio, 4,2 ml de FBS, NEAA 100x 0,42 ml, 0,042 ml a 200 ug / ml ciclohexamida, 0,021 ml de 50mg/ml de gentamicina. Misturar bem.
   2. Misturar em 18,9 ml de água quente estéril agarose a 1,2% / H ₂ O, a agitação para evitar grumos. Mistura deve ser quente ao toque. Tenha em um banho de água quente a 55 ° C antes de adicionar às células infectadas.
7. Aspirar suspensão bacteriana de pratos e aplicar 6 ml de 0,54% de agarose / DMEM por poço. Permitir agarose para solidificar completamente à temperatura ambiente, fora do capuz durante 15 min. Secam-se as placas com as tampas removidas, na capa de biossegurança durante 15 min.
   NOTA: A vibração da capa de contenção biológica pode distorcer a agarose solidifica.
8. Incubar a 37 ° C na incubadora de CO ₂ durante 7-10 dias. As placas devem estar disponíveis com o auxílio de um microscópio de dissecação. (Refer à Figura 3, para uma imagem típica de placas.)
9. Um dia antes do isolamento de mutantes, de sementes de 1 x ⁴ 10 células Vero em 100 ul por poço de uma placa de 96 poços. As células serão confluente dentro de 24 h.
10. Usando um microscópio de dissecação, placas de marca para ser escolhido. Colete fichas de placas usando um 1,0 ml barreira ponteira estéril.
11. Ressuspender as placas em 100 ul de DMEM suplementado com FBS a 10%, 400 ng / ml ciclohexamida, 50 ug / ml de gentamicina.
12. Para expandir cepas mutantes, sobrepor a suspensão em monocamadas confluentes de células Vero. Rodar as placas a 2700 x g, 15 ° C durante 30 min.
13. Incubar a 37 ° C / 5% de CO _2, num incubador humidificado. Colheita EBs quando> 50% das células estão infectadas, o que pode ocorrer tão cedo quanto 48 hpi e tão tarde como 14 dias. Esta quantidade de células infectadas permite que as bactérias viáveis ​​suficiente para ser armazenado. Cepas mutantes diferem em taxas de crescimento e infectividade. Permitir retardar estirpes de crescimento para a Naturally re-infectar células vizinhas até células suficientes estão infectados.
14. Extrair EB por lise hipotónica das células infectadas:
    1. Completamente aspirar médio.
    2. Adicione 160 ml de água estéril. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
    3. Perturbar as células por pipetagem cima e para baixo várias vezes para garantir a lise completa, use dicas de barreira para evitar a contaminação cruzada.
    4. Transferir 160 uL de lisados ​​para os tubos de microcentrífuga.
    5. Misturar em 40 mL de SPG 5x. Armazenar a -80 ° C.
15. Ensaio e tela de mutantes para o fenótipo (s) de interesse.

3. Seqüenciamento do genoma inteiro de Mutantes Chlamydia selecionados

1. Extrair DNA genômico de gradiente-purificada EBS, que são em grande parte livre de contaminação DNA do hospedeiro. Protocolos para a cultura em larga escala e purificação de Chlamydia da EBS pode ser encontrado na ref. (17). Use kits de purificação de DNA genômico comerciais (por exemplo, cat Qiagen 69504.) Para extRACT DNA a partir de 2 x 10 ⁹ bactérias seguindo as instruções do fabricante.
2. Use um fluorímetro (Qubit, Invitrogen gato. Q32866) para medir com precisão a quantidade de DNA. 1-5 ug de ADN purificado é necessária para a plataforma de sequenciação Ilumina.
   Nota: várias plataformas podem ser utilizadas sequências de genomas bacterianos, incluindo os sistemas Illumina/Solexa- e baseada sólida. Optamos por usar HiSeq (Illumina), uma vez que produz alta densidade de curto, mas de seqüenciamento de alta qualidade lê. Seqüenciadores menores do genoma escala, como IonTorrent (Life Technologies) e MySeq (Illumina) são adequados e também mais do que suficiente para multiplexação estes Quencing de até quatro genomas Chlamydia por vez, o que excede a cobertura mínima de 25X para a montagem do genoma adequada. Preparação de bibliotecas de sequenciação de ADN para a plataforma Ilumina são descritos abaixo.
3. Fragmento de DNA de tamanho apropriado (300-400 pares de base para Illumina seqüenciamento), utilizando uma Adaptive Acoustics Focada em S220trumento (Covaris) de acordo com as configurações sugeridas pelo fabricante. Nota: fragmentação do DNA por nebulização resultados em maior perda de amostra, devido à dispersão em aerossol da amostra.
4. Prepare as bibliotecas de sequenciamento genômico utilizando kits de construção comercial (Illumina FC-102-1001), seguindo as instruções do fabricante. Bibliotecas podem ser indexados usando primers com código de barras (Illumina FC-121-1003) de tal forma que várias amostras podem ser reunidos e seqüenciados simultaneamente.
5. Executar o seqüenciamento de amostras. Esta etapa é geralmente realizada por serviços comerciais ou instalações nucleares operadas por pessoal técnico dedicado. Siga os procedimentos e recomendações.
6. Ilumina lê (FASTQ formato) pode ser montado a um genoma de referência utilizando o software de interface gráfico de utilizador amigável, como Geneious (Biomatters), que pode também ser utilizado para o SNP / identificação da mutação. Para mutações mapa, definir parâmetros para 90% a frequência mínima para a variante e 50X para a cobertura mínima. Abrir fonelectrónicos genoma montadores, tais como MAQ (18) e BWA (19), também podem ser usados.
7. Confirmar mutações pela sequenciação de Sanger: usar o DNA genómico como modelo para a amplificação por PCR de 300-500 pb regiões flanqueadoras mutações identificadas e sequências purificadas ou diluído (01:20) Os produtos da PCR por sequenciação de Sanger.

4. Geração de Chlamydia recombinantes

Nota: Chlamydia podem trocar DNA durante a infecção, o que permite a geração de estirpes recombinantes (12, 13, 20). Após a co-infecção de células com duas estirpes resistentes aos antibióticos únicos, recombinante "progénie" podem ser seleccionadas pela resistência aos antibióticos dupla (12, 13). Aproveitamos esse fenômeno para segregar mutações e gerar tensões co-isogênicos. Assim, as estirpes mutantes foram gerados no fundo resistentes a antibióticos (por exemplo, a resistência à rifampicina (RIF ^R) H471Y em CTL0567 (rpoB)) de tal modo que elas possam ser cruzadas com o tipo selvagem estirpe bearinga alelo resistente ao antibiótico diferente (por exemplo, resistência a espectinomicina (Spc ^R), G1197A na r01/r02 (16SRNA copia 1 e 2)). Para obter detalhes sobre troca de DNA e recombinação de Chlamydia, consulte as referências (12, 13).

1. Co-infectam tipo selvagem e estirpes mutantes clonais por centrifuging6 ⁵ x 10 bactérias a partir de cada estirpe em monocamadas confluentes de células Vero cultivadas em placas de 24 poços. Em paralelo, infectar monocamadas com cada cepa sozinho.
2. Aos 44 hpi, colheita EBs por lise hipotônica das células infectadas:
   1. Completamente aspirar médio.
   2. Adicionar 0,4 ml de água estéril e deixe descansar por 10 min.
   3. Lisar as células por pipetagem vigorosa cima e para baixo por pelo menos 10 vezes. Transferir os lisados ​​para um tubo de microcentrífuga.
   4. Misturar em 0,1 mL de SPG 5x para uma concentração final de 1 x SPG.
   5. Os lisados ​​brutos podem ser utilizadas imediatamente ou armazenadas a -80 ° C.
3. Plaque 50 mL da EB bruto prepara umd 5 x 01:10 diluições em agarose / DMEM suplementado com os antibióticos apropriados para selecionar para recombinantes. (Consulte a tabela para as concentrações de antibióticos típicos para a seleção de recombinantes).
4. Chapa purificar e enriquecer estirpes recombinantes como acima. Pontuação recombinantes para a presença ou ausência do fenótipo desejado. Extrair ADN a partir de estirpes recombinantes por tratamento DNAzol (secção seguinte) com a finalidade de genotipagem para a presença ou ausência de mutações.
5. Cruzes pode ser repetido com outras estirpes que carregam os marcadores de resistência a antibióticos para segregar mais mutações, e gerar estirpes isogénicas. Co-infectar recombinantes selecionados para outra cepa do tipo selvagem tendo um marcador antibiótico diferente.

Tabela 1: As concentrações de antibióticos para a selecção de recombinantes:

Concentração final	Instruções de preparação
200 ng / ml de rifampicina	Adicione 25 mg / ml de caldo de armazenamento em dimetil sulfóxido (DMSO). Adicione-se 200 ug / ml de solução de trabalho por diluição do estoque de armazenamento com H 2 O. Armazenar a -20 ° C no escuro.
200 ug / ml de trimetoprim	Faça um mg / ml estoque 100 em DMSO. Armazenar a -20 ° C
200 ug / ml de espectinomicina	Faça um mg / ml estoque 100 na água em 100 mL alíquotas. Armazenar a -20 ° C. Evite repetir degelo congelamento.

5. A extração de DNA genômico de linhagens recombinantes para genotipagem

Nota: kits de purificação baseados em coluna também pode ser usado. Uma vantagem de extração de DNA por meio de tratamento DNAzol é o custo.

1. Infect 1,2 x 10 ⁵ clamídias para monocamadas de células Vero cultivadas em placas de 12 poços.
2. Na 36-48 hpi, aspirar médio e adicione 0,375 ml de DNAzol (Invitrogen 10503-027). Agitar suavemente as células e pipeta o lysates para um microtubo de 1,5 ml.
3. O precipitado de DNA pela adição de 0,188 ml de etanol a 100%. Misture por inversão.
4. Extrair DNA de spool com uma ponta de pipeta e colocá-lo em um tubo limpo. Alternativamente, o sedimento de DNA por centrifugação à velocidade máxima durante 2 min à temperatura ambiente ou a 4 ° C, e decantar o sobrenadante.
5. Lavar ADN precipitar duas vezes com 1,0 ml de etanol a 75%.
6. ADN Ar seco após a remoção do etanol por 15 sec.
7. Solubiliza-se o ADN com NaOH 0,2 mM de 8 ml, em seguida, neutraliza-se até pH 8,0 com 20,2 mL de 0,1 M de HEPES. Levar até um volume final de 0,5 ml com água ou TE. Alternativamente, o DNA ressuspender em tampão TE (sedimento de DNA não completamente solubilizado.).
8. Use DNAzol ADN extraído como molde para amplificação por PCR de 300-500 pb regiões flanqueadoras das mutações identificadas. Seqüência purificada ou diluído (1:20) Os produtos de PCR por seqüenciamento Sanger.

Resultados

A exposição a agentes mutagénicos leva a inclusões que aparecem desprovido de bactérias, presumivelmente devido a morte da célula bacteriana. Normalmente, sorotipo LGV-L2 vai lisar completamente as células infectadas dentro de 48 h após a infecção, mas o tratamento com agentes mutagênicos podem estender o ciclo de> 90 h. Cerca de 10% de inclusões devem recuperar. Nas nossas experiências, as células Vero infectadas tratadas com 20 mg / mL de EMS levou a um decréscimo de 99% na recuperação de progenitura infecciosa em ...

Discussão

Esta metodologia atende aos requisitos básicos para a análise genética, uma vez que estabelece ligação entre os genótipos e fenótipos. Importante, isto é conseguido sem o auxílio de ferramentas moleculares convencionais de DNA recombinante para a transformação e inactivação por inserção de genes em bactérias, o que é muitas vezes um passo limitante da velocidade para a análise da função dos genes em microrganismos não-modelo.

Um passo importante é a assegurar a clonalidade de mutantes de pla...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11995-073
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-010-CV
Etil metanossulfonato (EMS)	Sigma	M0880
Ciclohexamida	Sigma	C4859-1ML
Gentamicina	Life Technologies	15750-060
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Life Technologies	14190-144
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 0,493 mM MgCl2 e 0,901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2)	Life Technologies	14040-133
1 M NaOH
5x tampão SPG (1,25 M sacarose, 50 mM de fosfato de sódio, 25 mM de ácido glutâmico)
Tampão SPG (0,25 M de sacarose, 10 mM de fosfato de sódio, 5 mM de ácido glutâmico)
Água (estéril, grau de cultura de tecidos)
2x DMEM (preparado a partir de pó, tamponado com 7,4 g/L de bicarbonato de sódio	Sigma	D7777
Aminoácidos não essenciais (NEAA)	Life Technologies	11140-050
1,2% GTG Agarose, kits de	Lonzo	50070
	Qiagen	69504
DNAzol	Life Technologies	10503-027
Etanol (grau de biologia molecular)
8 mM NaOH
0,1 M HEPES (4- (2-hidroxietil) -1- ácido piperazineetanossulfónico) tampão
Balões de cultura de tecidos de 25 cm2 (frascos T25)
Placas
poços Placas de cultura de tecidos de 12 poços
Placas
Capuz
Biológico capa
>Centrífuga e adaptadores para placas de tecido giratório>
Microscópio
Fluorômetro (Qubit)	Invitrogen	Q32866
Adaptive Focused Acoustics S220 instrumento	Covaris