A cultura de células epiteliais nasais Humano na interface ar líquido

Resumo

Células epiteliais nasais, obtidas através de biópsia superficial raspar de voluntários humanos, são expandidas e transferido para tecido inserções de cultura. Ao atingir a confluência, as células são cultivadas na interface ar-líquido, obtendo-se culturas de células ciliadas e não ciliadas. Culturas de células epiteliais nasais diferenciados fornecem modelos experimentais para o estudo de viáveis ​​da mucosa respiratória.

Resumo

Os modelos in vitro utilizando células epiteliais primárias humanas são essenciais para a compreensão das principais funções do epitélio respiratório no contexto de infecções microbianas ou agentes inalados. Comparações diretas de células obtidas de populações doentes nos permitem caracterizar diferentes fenótipos e dissecar os mecanismos subjacentes mediando mudanças na função da célula epitelial. A cultura de células epiteliais da região traqueobrônquica humana tem sido bem documentada, mas é limitado pela disponibilidade de tecido de pulmão humano ou invasividade relacionado com a obtenção das escovas biópsias brônquicas. Células epiteliais nasais são obtidos através de biópsias superficiais raspar nasal muito menos invasivos e os assuntos podem ser biopsiados várias vezes, sem efeitos colaterais significativos. Além disso, o nariz é o ponto de entrada para o sistema respiratório e, portanto, um dos primeiros locais a serem expostas a qualquer tipo de estressor transportada pelo ar, como agentes microbianos, poluentes, ou alérgenos.

Resumidamente, as células epiteliais nasais obtidos a partir de voluntários humanos são expandidos em placas de cultura de tecidos revestidos, e em seguida transferida para inserções de cultura de células. Ao atingir a confluência, as células continuam a ser cultivadas na interface ar-líquido (ALI), durante várias semanas, o que cria condições mais fisiologicamente relevantes. A condição cultura ALI usa a mídia definidas levando a um epitélio diferenciado que apresenta características morfológicas e funcionais semelhantes ao epitélio nasal humano, com células ciliadas e mucosas tanto produzindo. Inserções de cultura de tecidos com células epiteliais nasais diferenciadas pode ser manipulado numa variedade de maneiras dependendo das questões de pesquisa (tratamento com agentes farmacológicos, de transdução com vectores lentivirais, a exposição a gases, ou infecção com agentes microbianos) e analisados ​​por numerosos pontos de extremidade diferentes, desde caminhos celulares e moleculares, ch funcionalanges, morfologia, etc

Em modelos in vitro de células epiteliais nasais humanos diferenciados permitirá que os investigadores a abordar novas e importantes questões de pesquisa, utilizando modelos experimentais organotípicas que grande parte imitar o epitélio nasal in vivo.

Introdução

Objetivo da técnica

As células epiteliais (ECS) nas vias aéreas estão entre os primeiros locais a serem diretamente expostos a estressores ambientais inalados, tais como patógenos, alérgenos ou poluentes atmosféricos. ECs são mais do que uma barreira estrutural: Eles agem como uma central para iniciar e regular a resposta imune respiratório ^1-3 através da liberação de mediadores solúveis ^4-6 ea expressão de ligantes / receptores em sua surfac ^7-9. Enquanto as linhas de células imortalizadas podem ser utilizados como modelos para estudar CEs respiratórias in vitro, eles não conseguem diferenciar-se em....

Protocolo

1. Prepare Plastic Ware: Brasão Placa

1. Adicionar 500 ul PureCol (1:100 diluído em água esterilizada) para cada poço de uma placa de 12 poços.
2. Incubar a 37 ° C numa incubadora durante 30 min, remover o PureCol e enxagua-se com HBSS a direita antes as células são adicionadas à placa (ver passo 3.1).

2. Obtenção e pré-tratamento de Biópsia de CNE Humano

1. Biópsia raspar Nasal
   1. Obter ECs superficiais que revestem os cornetos nasais sob visão direta através de um espéculo nasal polipropileno reutilizável 9 mm (modelo 22009) em um otoscópio operacional com espéculo (modelo 21700). Este dispositivo prop....

Resultados

CNE cultivadas seguindo o protocolo aqui descrito re-diferenciar-se em uma camada de células endoteliais heterogéneo composto por células ciliadas e não ciliadas, que representam a situação in vivo (Figura 1). Alguns dos CNE diferenciadas são muco produtores (células marcadas em azul usando AB / PAS, Figura 1B). Embora o protocolo aqui apresentado é optimizada, a diferenciação pode variar no que diz respeito à distribuição das populações totais de células (isto é, dife.......

Discussão

ECs respiratórias fornecer não apenas uma barreira física para proteger o corpo humano a partir de estímulos exógenos ^20, mas também funcionam como uma central para iniciar e regular as respostas de defesa imunológico respiratórias ^1-3 através da secreção de mediadores solúveis ou interações célula-célula receptor-ligante diretos. A fim de estudar melhor o papel das células endoteliais na resposta imune, para examinar as diferenças de potencial entre os CEs a partir de populações de doentes, ou par.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Espéculo nasal	Welch Allyn	Modelo 22009	9 mm, polipropileno reutilizável
Otoscópio cirúrgico	Welch Allyn	Modelo 21700
Cubeta de células de sonda de rinoceronte	Arlington Scientific	SY-96-092	dobre a cabeça da cubeta um pouco mais Placas de
cultura de 12 poços	Inserções de	3512
Transwell	Corning	3460
Frasco de cultura de tecidos	Corning	430639 e 430641	T25 e T75 frasco ventilado
RPMI 1640 (com L-Glutamina)	Gibco	11875
Meio de Crescimento de Células Epiteliais Bronquiais/Traqueais	aplicações de células	511-500
BEGM Meio de Crescimento de Células Epiteliais Bronquiais	Lonza	CC-3170	Isso vem como um kit de um frasco de meio e frascos com suplementos.
Solução de bicarbonato de sódio a 7,5%	Gibco	25080	Use como está.
NuSerum	BD Biosciences	355104	Use como está.
Mídia de congelamento BAMBANKER	BAMBANKER	302-14681	Use como está.
CoolCell	Biocision	HTBCS-136	(recipiente de congelamento de células sem álcool CryoPrep)
PureCol	AdvancedBioMatrix	5005-B	diluir 1:100 com água estéril (deve ser aproximadamente 0,03 mg / ml) use 500 μ l/poço de uma placa HBSS de 12 poços
com Ca2 e Mg2+	Gibco	14025
DNAse 1	Sigma	DN25	Dissolva a 1,5 mg/ml, que é uma solução 100x, adicione 10 μ l para cada ml de meio
Tripsina, 0,25%, 1x, com vermelho de fenol	Gibco	25200-056	Use nele é
Inibidor de Tripsina de Soja (SBTI)	Sigma	T6522	Use dissolvido em HBSS na concentração de 1 mg/ml
Ácido retinóico	Sigma	R7632	Composição 100 μ M solução estoque (veja abaixo), diluir para 10 μ M com álcool absoluto, tome 5 μ l deste e adicioná-lo a 1 ml de meio BEGM (nossa solução de trabalho). O retinol All-trans tem um coeficiente de extinção de 52.480 em etanol a 325 nm. Dissolver 25 mg em 50 ml de etanol absoluto. Diluições seriadas devem ser feitas, diluir 50 ml de reserva em 450 ml de etanol absoluto, tomar 50 ml deste, diluir em 450 ml de etanol absoluto, tomar 50 ml deste, diluir em 450 ml de etanol absoluto, e novamente tomar 50 ml deste, diluir em 450 ml de etanol absoluto, tomar 100 ml deste e diluir em 900 ml de etanol absoluto e ler no espectrofotómetro a 325 nm, esse número é então multiplicado por seu ' fator de diluição, então dividido pelo coeficiente de extinção de 52.480, isso dará um número em mM. Faça um estoque de 100 mM (armazene a -20 ° C) e a partir deste estoque é feita uma alíquota de 10 mM, o ácido retinóico diário necessário seria de 5 ml desta alíquota de 10 mM em meio ALI de 995 ml. Exemplo: a leitura de 325 nm é 1,15. 1,15 x 10.000 (fator de diluição) / 52.480 = 0,219 = 219 mM, faça um estoque de 100 mM a partir disso, em etanol absoluto.
DMEM glicose alta (1x), líquido, com L-glutamina e piruvato de sódio	Gibco	11995
Extrato de hipófise bovina	Gibco	13028-014	Usado para meios BEGM ALI.
Nistatina	Sigma	N4014-50 mg	Constituir uma solução de 3,3 mg/ml.
Albumina de soro bovino	Fisher Scientific	BP1600-100	Faça uma solução de solução de 10 mg / ml em água miliQ.
PneumaCult-ALI media	StemCell	5001	Isso vem como um kit de um frasco de meio e frascos com suplementos. Para obter detalhes, veja abaixo.
Hidrocortisona	StemCell	7904	Dissolva 2,4 mg de hidrocortisona em 1 ml de ddH2O (usado para fazer a solução estoque de hidrocortisona 200x)
Heparina Sal de sódio em PBS (2 mg/ml)	StemCell	7980	Use nisso.
Balões filtrantes (500 ml)	Corning	431097	0,22 μ m tubos de filtro de tamanho de poro
(50 ml)	Millipore	SCGP00525	Steriflip, 0.22 μ Pontas de pipeta de tamanho de poro m
- Pontas de barreira ART	Bioprodutos moleculares	2139RI, 2069RI, 2179RI
Tubos cônicos, estéreis, 15 ml e 50 ml
ddH><2O, etanol absoluto, gelo
CO2 incubadora
centrífuga
			de Segurança Biológica
(P2, P200, P1000), 9 pol. Pipetas de
Luvas
Jaleco com punhos apertados
< TD> (isso é estável por 2 semanas em 2-8 ° C ou por até 6 meses a -20 &graus; C) Mídia e soluções usadas: Receita Usado para Observação geral: aqueça sempre o meio à temperatura ambiente BEGM media 500 ml de mídia de aplicação de células BEGM com uma alíquota de ácido retinóico (misture-os até a metade e filtre) 500 ml de mídia BEGM Lonza com uma alíquota de suplementos de cota única < UL> digestão da biópsia BEGM+ media 50 ml BEGM Media mantendo células no plástico nas placas (passagem0) 10 μ L Ácido retinóico (solução de trabalho) semeando células no balão (passagem1; parcialmente) manter as células no balão BEGM++ media 50 ml Lonza' s Meios BEGM com suplementos semeando células frescas em placa de 12 poços em plástico 1 ml de bicarbonato de sódio células de manutenção nas placas de plástico (passage0; apenas parcialmente) 2,5 ml NuSerum semeando células no balão (passagem1; parcialmente) BEGM ALI media 250 ml DMEM-H Manter as células no transwell antes que elas sejam ALI 250 ml de BGB incluindo suplementos 2 ml de extrato de hipófise bovina (solução de 12,5 mg/ml) 1 ml de nistatina (solução de 3,3 mg/ml) 75 μ l BSA (solução de 10 mg/ml) 200X Solução estoque de hidrocortisona (96 μ L/ml solução) 200 μ l hidrocortisona dissolvida Como suplemento ao PneumaCult-ALI Complete Base Medium para o último dia no frasco e quando as células estão em inserções 4250 μ l cloreto de sódio dissolvido 540 μ l ddH2O 10 μ l etanol absoluto Filter solução através de 0,22 μ m filtro, solução de alíquota e armazenar a -20 & C, evite ciclos adicionais de congelamento/descongelamento PneumaCult-ALI Meio de base completo 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium Meio de base para todos os três meios de comunicação PneumaCult-ALI 50 ml Suplemento PneumaCult 10x A mídia PneumaCult é sensível à luz, portanto, mantenha-a sempre no escuro PneumaCult-ALI Maintenance Medium Por 1 ml de PneumaCult-ALI Complete Base Medium add: ALI cultura em inserções 10 μ l PneumaCult 100x Maintenance Suplemento 2 μ l Heparina (de uma solução-mãe de 2 mg/ml) 5 μ l Hidrocortisona (de um 96 μ l/ml de solução-mãe)

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