Descolamento de Retina modelo em roedores por injeção sub-retiniana de hialuronato de sódio

Resumo

Criação de descolamento de retina experimentais com uma altura reprodutível e sustentada de desapego, e sem hemorragia sub-retiniana, é importante para o estudo da fisiopatologia da perda de células fotorreceptoras da retina na doença e avaliar intervenções terapêuticas potenciais. Relatamos tal método em detalhes.

Resumo

Injeção sub-retiniana de hialuronato de sódio é um método amplamente aceito de induzir o descolamento de retina (DR). No entanto, a altura e tempo de RD ou a ocorrência de hemorragia sub-retinal pode afectar a morte celular de fotorreceptores na retina descolada. Por isso, é vantajoso criar DRs reprodutíveis sem hemorragia sub-retiniana para avaliar a morte celular de fotorreceptores. Nós modificamos um método previamente relatado para criar bolhosa e RDs persistentes em um local reprodutível com rara ocorrência de hemorragia sub-retiniana. O passo crítico deste método modificado é a criação de uma incisão escleral auto-vedante, o que pode impedir a fuga de hialuronato de sódio, após injecção no espaço sub-retiniano. Para fazer a incisão escleral de auto-selagem, um túnel na esclerótica é criado, seguido pela penetração de esclerótica para a coróide, com uma agulha G 30. Apesar de hemorragia de coróide podem ocorrer durante esta etapa, astriction com uma lança cirúrgica reduz a taxa de hem coróideorrhage. Este método permite que um modelo mais reprodutível e fiável de morte de fotorreceptores em doenças que envolvem RD como regmatogéneo RD, retinopatia da prematuridade, retinopatia diabética, coriorretinopatia serosa central, e degeneração macular relacionada com a idade (AMD).

Introdução

Fotorreceptores da morte celular e subsequente declínio visuais ocorre quando as células fotorreceptoras são separados a partir do epitélio pigmentar da retina subjacente. A separação física dos fotorreceptores é visto em várias doenças da retina, incluindo a degeneração macular relacionada com a idade (AMD), coriorretinopatia serosa central, retinopatia diabética e retinopatia de prematuridade, bem como regmatogéneo (isto é causado por uma ruptura na retina) descolamento da retina ( RD). Injeção sub-retiniana de hialuronato de sódio é um modelo amplamente aceito para criar uma RD que leva à morte das células fotorreceptoras, fornecendo informações sobre a fisiopatologia da degeneração dos fotorreceptores ^1-15.

Degeneração de fotorreceptores induzida por injecção sub-retiniana de hialuronato de sódio, introduzido pela primeira vez em 2001, ^7, tem a vantagem de um campo de tempo razoável (dias ou semanas). No entanto, ele pode ter uma variabilidade significativa da perda de células fotorreceptoras do animal ao animal devido a dois principais fatores que afetam a morte das células fotorreceptoras após RD: 1) de altura e duração da RD, e 2) a ocorrência de hemorragia sub-retiniana. Há uma curva de aprendizagem técnica íngreme para o método que contribui para ambos os factores. Degeneração de células fotorreceptoras aumenta com a altura da RD, como a distância entre o epitélio pigmentado da retina (RPE) da camada e fotorreceptores aumenta ^16-17. De acordo com esses relatórios, nossas experiências anteriores mostraram mais morte de fotorreceptores em RDs bolhosas que RDs rasas. Também tem sido relatado que a hemorragia sub-retiniana é tóxico para as células fotorreceptoras e afecta a morte celular de fotorreceptores ^18-21. Da mesma forma, temos observado mais a morte de fotorreceptores em RDs com hemorragia sub-retiniana de DRs sem hemorragia sub-retiniana. Assim, as técnicas para minimizar a variabilidade tem de se concentrar em alcançar alturas consistentes de RD, evitando hemorragia sub-retiniana.

O nosso método de modificação emdução RD pode fazer bolhosa reprodutível e RD persistente na mesma posição do olho com rara ocorrência de hemorragia sub-retiniana. Foi realizada a cirurgia através de uma abordagem temporal, porque é mais fácil de conseguir um campo operatório mais largo em comparação com outros sites. Depois da incisão da conjuntiva, uma incisão escleral auto-selagem é feita utilizando uma agulha G 30. Um túnel na esclerótica é criado, seguido pela penetração de esclerótica para a coróide. Se o sangramento coróide ocorre neste passo, a hemorragia irá sair do olho através da ferida escleral, e o sangramento pode ser interrompido por astriction com uma lança cirúrgico. Uma punção da câmara anterior é, então, realizada a partir da córnea para reduzir a pressão intra-ocular. Este é um passo importante, pois a injeção sub-retiniana só vai levar ao aumento da pressão intra-ocular com oclusão da artéria da retina resultante e isquemia da retina interna. Uma agulha 33 G ligada a uma seringa Hamilton de 10 ul é então inserida no espaço sub-retiniano, e 3,5 μ, Hialuronato de sódio l é suavemente injetado para descolar a retina neurossensorial do EPR subjacente. Em contraste com outros métodos de induzir RD que são realizados sob a observação de fundo de olho, esta técnica é realizada sob observação directa. Desde a ferida escleral é auto-selante, hialuronato de sódio não vai vazar para fora após a injeção. Finalmente, a cola é colocado sobre a ferida de esclerótica e a conjuntiva é recolocado na sua posição original. Estes passos dura também reduzir o risco de fuga de hialuronato de sódio. A injecção de 3,5 mL de hialuronato de sódio cria DRs reprodutíveis (50%) da retina nos olhos de ratinhos de 8 semanas de idade. Criando a ferida auto-selante é o passo mais importante no nosso procedimento modificado, pois evita que o hialuronato de sódio injetado vaze para fora do olho, permitindo assim bolhosa reprodutível e RDs persistentes.

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com a Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia Declaração para o uso de animais em Ophthalmic and Vision Research, e as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Massachusetts Eye and Ear Infirmary Comitê Animal Care.

1. O pré-tratamento

1. Anestesiar um rato com 8 semanas de idade, com uma injecção intraperitoneal de uma mistura de 60 mg / kg de cetamina e 6 mg / kg de xilazina.
2. Cortar os bigodes. Isso é feito porque eles interferem com a visualização e colocação de instrumentos.
3. Dilatar a pupila com 5% de fenilefrina e 0,5% tropicamide.
4. Corte os cílios. Isto também é feito porque interferem com a visualização e a colocação do instrumento.
5. Aplicar anestesia tópica (solução oftálmica de 0,5% de cloridrato de proparacaína).

2. Cirurgia Sob o Microscópio

1. Coloque o mouse em uma pos lateraisition com o nariz para o cirurgião. Uma pitada dedo do pé é realizado para confirmar a anestesia cirúrgica e luvas estéreis são vestiu antes de iniciar a cirurgia.
2. Incisão na conjuntiva temporais no limbo posterior e separar a conjuntiva da esclera. Evitar a penetração da esclerótica. Após este passo, compreender a conjuntiva no limbo com fórceps para controlar o olho.
3. Fazer uma incisão escleral de auto-selagem, utilizando a ponta de uma agulha G 30 com o chanfro apontada para cima. Fazer um túnel na esclerótica através da esclera e penetrar na esclerótica na coróide (Figura 1). Não penetrar a retina. Se o sangramento ocorre coróide e sai através da ferida escleral, realizar uma astriction com uma lança cirúrgico até que o sangramento pare. Esta ferida escleral será auto-selado com pressão intra-ocular.
4. Perfurar a córnea com uma agulha de 30 G para reduzir a pressão intra-ocular. Use a agulha paralela à íris para evitar ferir a íris e lente durante entry para a câmara anterior. A pressão intra-ocular vai fazer com que a ferida para auto-selagem.
5. Inserir uma agulha G 33 conectado a um mL da seringa no espaço sub-retiniano Hamilton 10, com o bisel apontado para baixo (em direção ao olho interno) e injetar o hialuronato de sódio 3,5 mL com cuidado para retirar a retina neurossensorial do EPR subjacente. Evite penetrar a retina com a agulha 33 G, porque o hialuronato de sódio vai para o espaço vítreo, mas não o espaço sub-retiniano, se a retina é penetrada. Além disso, evitar injeção rápida porque vai criar uma lágrima oral, e hialuronato de sódio vai vazar para a câmara anterior.
6. Deixe o fluxo do humor aquoso para fora do punção da córnea, empurrando a córnea em torno do furo da córnea com uma pinça para ajustar a pressão intra-ocular.
7. Confirmar a ausência de fuga a partir da ferida escleral usando uma lança cirúrgico.
8. Para reduzir o risco de fuga de hialuronato de sódio, colocar cianoacrilato cola cirúrgicaa ferida escleral.
9. Recoloque a conjuntiva à sua posição original, utilizando cianoacrilato cola cirúrgica. Isto irá reduzir ainda mais o risco de fuga de hialuronato de sódio.
10. Verifique o fundo usando uma tampa de vidro e confirme a criação de uma RD bolhosa sem hemorragia sub-retiniana.

3. Após tratamento

1. Aplicar uma pomada antibiótica ao olho bacitracina para reduzir o risco de infecção.
2. Mantenha os ratos em uma almofada de aquecimento para evitar a anestesia (mistura de cetamina e xilazina) de causar baixa temperatura do corpo posterior à pressão arterial baixa.
3. Coloque os ratos de volta para a jaula de animais depois que eles despertam da anestesia. Monitorar os ratos diárias para complicações. Se surgir alguma complicação, eutanásia os ratos, conforme descrito abaixo.

4. Sacrifício

1. Eutanásia dos ratinhos por deslocamento cervical depois de injecção intraperitoneal de 100 mg / kg de pentobarbital de sódio, e enucleate os olhos em pontos de tempo apropriados para cada experiência (não mostrado). Evite aplicar pressão sobre o olho durante a enucleação porque o hialuronato de sódio pode vazar. RDs bolhosas deve ser persistente durante pelo menos 14 dias.

Resultados

Para avaliar a persistência da RD feito por este protocolo, criosecções foram feitas nos dias 3, 7 e 14 após a indução da RD. Seis olhos foram utilizadas para cada ponto de tempo. Hematoxilina e eosina (HE) foi usado para visualizar as seções. Todas as secções mostraram uma RD bolhosa aproximando a lente (Figura 2). Um olho mostrou hemorragia sub-retiniana no dia 7. Não há olhos mostrou quaisquer sinais de infecção ou lesão lente.

Figura 1. Criando uma incisão escleral de auto-selagem. Este esquema mostra uma imagem em corte transversal de um olho normal de rato. Linha vermelha indica a incisão escleral auto-selante. Um túnel na esclerótica, seguido pela penetração de esclerótica para a coróide, com uma agulha G 30, cria uma incisão escleral de auto-selagem. Esta ferida escleralvai ser auto-selado com pressão intra-ocular, o que pode impedir a fuga de hialuronato de sódio após a injecção para dentro do espaço sub-retinal e alcançar os descolamentos de retina bolhosas persistentes.

Figura 2. Curso do tempo de descolamento de retina. Esta foto de fundo de olho mostra um descolamento de retina bolhosa sem hemorragia sub-retiniana imediatamente após a cirurgia. Criosecções com hematoxilina e eosina (HE) show de descolamento de retina bolhosa persistente sem hemorragia sub-retiniana por pelo menos 14 dias.

Discussão

Vários métodos para o estabelecimento de um modelo de RD em roedores olhos foram relatados ^{3-15 de 22.} A maioria deles utilizam a injecção sub-retiniana de hialuronato de sódio porque é um material viscoso, utilizado durante a cirurgia intra-ocular em seres humanos, e não está associada com qualquer conhecida toxicidade ocular ^1-15. Hialuronato de sódio, em vez de solução salina normal tamponada com fosfato (PBS) ou solução salina, aumenta a duração da RD.

Os métodos para a injeção sub-retiniana de hialuronato de sódio usar uma das duas abordagens: uma abordagem transvitreal ^3-6 ou uma abordagem escleral ^7-15. Ambos os métodos são realizados com a observação do fundo. Na abordagem transvitreal, um injector sub-retiniana é introduzida na cavidade vítrea, uma retinotomia é criada na periferia da retina, e o hialuronato de sódio é injectado no espaço sub-retiniano. Neste método, duas rasgaduras da retina são feitos, o que aumenta o risco da retinal hemorragia que pode ir para o espaço sub-retiniano. Além disso, existe o risco de lesão de lentes quando o retinotomia é criado. Existem vários métodos modificados para a abordagem escleral. Na maior parte destes métodos de ^7-12, após a redução da pressão intra-ocular com um punção da câmara anterior, uma agulha de 30 G ligada a uma seringa cheia com hialuronato de sódio está directamente inserida no espaço sub-retiniano através da conjuntiva, esclerótica, coróide e RPE. O hialuronato de sódio é então injectado no espaço sub-retiniano. O risco de desgaste e danos da retina lente usando este método escleral é menor do que utilizando a abordagem transvitreal. No entanto, o furo feito na esclerótica com uma agulha de 30 G é grande, especialmente para os olhos de rato, e o hialuronato de sódio injectado no espaço sub-retiniano facilmente fugas para fora do olho através da ferida escleral. Isto leva a uma RD inferior a menos persistente e a morte celular de fotorreceptores mais variável. Além disso, se a hemorragia ocorre na coróideo passo de perfuração de esclerótica, a hemorragia irá propagar-se no espaço sub-retiniano por causa da pressão intra-ocular tem sido reduzido antes da injecção sub-retiniana hialuronato.

Vários fatores podem influenciar o efeito de RD no descolamento de retina, incluindo a hemorragia sub-retiniana ea altura e persistência da RD ^16-21. Células fotorreceptoras de morte aumenta com o aumento da altura da RD ^{16, 17,} e danos às células fotorreceptoras podem ser mais extensa, devido à redução de difusão de oxigênio e nutrientes essenciais dos coriocapilares com maior RD comparação com RD superficial. Hemorragia sub-retiniana também é tóxico para as células fotorreceptoras ^18-21; possíveis mecanismos dessa toxicidade no descolamento de retina incluem hipoxia e perturbação metabólica, hemorragia sub-retiniana como uma barreira de difusão, e neurotoxicidade direta induzida por componentes do sangue (como o ferro). Lesão Lens, que tem sido relatado para ter um efeito protetor sobre a reticélulas ganglionares nal ^23, também podem afetar a morte das células fotorreceptoras após a indução da RD. Além disso, se o local da ferida de entrada não é selado, o hialuronato de sódio pode sair com a manipulação de olho durante a enucleação. Isso pode levar à classificação errônea de um RD como superficial, o que por sua vez pode afetar a interpretação dos resultados.

Nós modificámos o método escleral para injecção sub-retiniana de hialuronato de sódio para aumentar a reprodutibilidade de TR e reduzir o índice de hemorragia sub-retinal. O passo fundamental deste protocolo é a criação de uma incisão escleral auto-selante usando uma agulha 30 G, o que impede o vazamento de hialuronato de sódio após a injeção. Ao contrário dos métodos anteriores, este protocolo é realizada sem a observação do fundo de olho para que maior atenção é dada à ferida escleral. Aplicação de cola também impede o hialuronato de sódio de vazar para fora do olho. Em nossa experiência, a taxa de hemorragia sub-retiniana com este protocolo wcomo significativamente menor do que com outros protocolos. Se o sangramento coróide ocorre durante a etapa de incisão da esclerótica, irá sair do olho através da ferida de esclerótica porque este passo é executado antes de reduzir a pressão intra-ocular. Se o sangramento coróide ocorra após a redução da pressão intra-ocular e descolamento da retina neurosensorial, sangue dissecar para o espaço sub-retiniano. Descobrimos que isso aconteça em cerca de 5% dos casos, em contraste com cerca de 10-20% com as outras técnicas. Estes animais devem ser excluídos da análise.

Esta técnica também pode ser usada para a injecção sub-retiniana de transferência de genes mediada por vector para atingir as células fotorreceptoras ou RPE ^{24, 25.} Porque o veículo típico (PBS, solução salina) para essas injeções é significativamente menos viscoso do que o hialuronato de sódio, técnicas padrão são atormentados por mais vazamentos. A técnica aqui descrita, reduzindo este risco, faz experiências de transferência de vector mais reprodutível efiável.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ketaject	Phoenix	2010025
AnaSed	LLOYD	4004821
5% Fenilepfrina / 0,5% Tropicamida	Massachusetts Eye and Ear Pharmacy
0,5% Solução Oftálmica de Cloridrato de Proparacaína	AKORN	17478-263-12
Provics	Alcon	8065183085
Webglue	Microscópio Veterinário Patterson	07-8566128
	Leica	MG90
30G1/2 Agulha PrecisionGlide	BD	305106
Weck-Cel Eye Spears	Beaver-Visitec	0008685
Seringa de 10 Microlitros	Hamilton	7635-01
33 gauge, agulha de 0,5 polegada	Hamilton	7803-05
Tampa de Vidro 18x18mm	Fisher Scientific	18-548A