Anticorpo de coloração em C. Elegans Usando o "Freeze-Cracking"

Resumo

"Freeze-cracking", um método para expor os tecidos internos do nemátodo C. elegans para anticorpos para localização de proteínas, é demonstrada.

Resumo

Para manchar C. elegans com anticorpos, a cutícula relativamente impermeável deve ser contornado por métodos químicos ou mecânicos. "Freeze-cracking" é um método usado para puxar fisicamente a cutícula de nematóides comprimindo nematóides entre duas lâminas de aderentes, congelá-los, e puxando os slides separados. Congela-craqueamento proporciona uma maneira simples e rápida para obter acesso aos tecidos sem tratamento químico e pode ser utilizado com uma variedade de fixadores. No entanto, isso conduz a uma perda de muitas das amostras e a compressão necessária distorce mecanicamente a amostra. Prática é necessária para maximizar a recuperação de amostras com boa morfologia. Congela-craqueamento pode ser optimizado para as condições específicas de fixação, a recuperação de amostras, ou a coloração não específica baixos, mas não para todos os parâmetros de uma vez. Para anticorpos que requerem condições de fixação muito rígidos e tolerar os tratamentos químicos necessários para permeabilizar quimicamente a cutícula, tratamentt de nemátodos intactas em solução pode ser preferida. Se o anticorpo requer uma posição mais clara ou se as condições de fixação ideais são desconhecidas, congelar-cracking fornece uma maneira muito útil para analisar rapidamente o anticorpo e pode render informações específicas localização subcelular e celular para o antígeno de interesse.

Introdução

Para determinar a localização celular e subcelular de proteínas, os cientistas têm tradicionalmente marcado tecidos com anticorpos seleccionadas para reconhecer especificamente ^um especial proteínas. Em alguns organismos modelo, como C. elegans, coloração do anticorpo foi frequentemente substituído por técnicas de genética molecular, que produzem resultados mais rapidamente. Estes incluem a transformação de organismos com construções que consistem de fusões de genes entre as regiões de codificação do gene de interesse e proteína fluorescente verde e promotor. No entanto, as técnicas moleculares estão sujeitas a um número de artefactos, incluindo p....

Protocolo

NOTA: Várias etapas do protocolo são apresentados com opções para set-up e preparação, dependendo das condições específicas de cada ensaio. Para estes casos, as etapas alternativas são apresentados como A, B, C, etc O protocolo com passos alternativos é descrito na Figura 1.

1. Preparação de Slides Polilisina revestidos

Podem ser utilizados três tipos diferentes de lâminas, dependendo da troca desejada entre a facilidade de preparação, a adesão relativa, e a ligação não específica do anticorpo. Detalhes das alternativas de preparação de diapositivos são apresentados abaixo nas etapas 1A....

Resultados

Quando worms são devidamente compactado, rachado, e levemente fixo, praticamente todo o worm pode ser acessível a coloração de anticorpos (ver Figura 2). A localização dos núcleos, tal como indicado por coloração com DAPI indica quais as partes do sem-fim está intacto Quando os vermes são submetidos a um fixador mais difícil, tal como o formaldeído, a morfologia do verme pode ficar distorcida (como pode ser visto pela aparência não natural ondulada do músculos nas Figuras 3A-D). Um outr.......

Discussão

O protocolo de congelamento de craqueamento é um dos vários métodos para a coloração do anticorpo em C. elegans. Ele fornece uma maneira relativamente simples de manchar vermes, mas exige reagentes específicos e prática para os melhores resultados. As etapas críticas (esboçado na Figura 1) incluem: 1) preparação de slides (consulte as etapas 1 e 2) de compressão manual dos nematóides (veja as etapas 2 e 3) de fixação rápida (ver passo 3). Em primeiro lugar, para maximizar a adesão dos nemátodos.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
corrediça de poli-L-lisina (marca ESCO)	Fisher	12-545-78	Sigma corrediças da marca também adequado
bromidrato de poli-L-lisina	Sigma	P1524	IMPORTANTE: Marca e alto peso molecular de polilisina crítica
única borda fosca slides	Fisher	48312-002	Outras marcas são adequadas
azida de sódio	Sigma	S2002-25G	TÓXICO, use luvas e máscara enquanto pesa o pó para fazer 10% de estoque. Use luvas ao canalizar o
frasco de coloração de coplin	VWR	47751-792	Outras marcas são adequadas
para envelope de 5 lâminas	Ciência da Microscopia Eletrônica	71549-01	Uma das muitas marcas diferentes de porta-lâminas pequeno, adequado para coloração
de Paraformaldeído	VWR	MK262159	IMPORTANTE: Soluções regulares de formalina (37% de formaldeído) NÃO são adequadas. 1) Dissolva o paraformaldeído crisatlalina em tampão fosfato e armazene em pequenas alíquotas congeladas. Ou 2) comprar paraformaldeído de grau de microscopia eletrônica em alíquotas. TÓXICO - use luvas; Descarte o excesso da pia com água.
Solução de glutaraldeído, 25% em água	Sigma	G 5882	IMPORTANTE: comprar glutaraldeído grau de microscopia eletrônica em ampolas; TÓXICO - use luvas; Descarte o excesso da pia com água.
Triton X-100	VWR	EM-9410	Outras marcas são adequadas
Soro bovino Albumina	Fisher	ICN820451	Outras marcas são adequadas
Soro de burro, liofilizado	Jackson Immunoresearch	017-000-121	Outras marcas são adequadas
Cy3 Burro anti-rato IgG multi-rotulagem	Jackson Immunoresearch	715-165-150	Esta empresa é recomendada para anticorpos multi-rótulo (esgotados por afinidade) de alta qualidade. Selecione o corante e o antígeno apropriados (animal usado para aumentar o anticorpo primário).
galato de n-propila	Fisher	ICN10274750	Outras marcas são adequadas
DAPI, dicloridrato de 4',6'-diamidino-2-fenilindol	Sigma	D 9542	TÓXICO. Use luvas e dispense em pequenas alíquotas e feeze para minimizar a exposição
Whatman #1 Filtros de 15 cm de diâmetro	Fisher	09805G
Coverslip #1 1/2 retângulo 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 espessura é opticamente melhor
Pasta de lâminas de microscópio	VWR	48429-092	Outras marcas são adequadas