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Artigo de método

Um Ensaio de microplacas para avaliar os efeitos químicos de RBL-2H3 degranulação dos mastócitos: Efeitos do Triclosan, sem utilização de solventes orgânicos

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DOI:

10.3791/50671

⸱

1 de novembro de 2013

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, Orono, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine, Orono

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Degranulação dos mastócitos, a liberação de mediadores alérgicos, é importante para alergia, asma e defesa do parasita. Aqui demonstramos uma técnicas para a avaliação dos efeitos de drogas e de substâncias tóxicas em desgranulação, a metodologia utilizada recentemente para expor o efeito inibidor potente do agente antibacteriano triclosano 2.

Resumo

Os mastócitos desempenham um papel importante na doença alérgica e de defesa imunológica contra parasitas. Uma vez activado (por exemplo, por um alérgeno), eles desgranulam, um processo que resulta na exocitose de mediadores alérgicos. Modulação da desgranulação dos mastócitos por drogas e substâncias tóxicas podem ter efeitos positivos ou negativos sobre a saúde humana. Função de mastócitos foi dissecada em pormenor com a utilização de mastócitos de leucemia basófilas de rato (RBL-2H3), um modelo amplamente aceito de mastócitos das mucosas humanas 3-5. Componente de mastro de células granulares e o mediador alérgica β-hexosaminidase, que é libertado de forma linear em conjunto com a histamina dos mastócitos 6, pode ser facilmente e confiantemente ser medido por meio de reacção com um substrato f luorogénico, obtendo-se a intensidade de fluorescência mensurável num ensaio de microplacas que é passível de estudos de alto rendimento 1. Originalmente publicado por Naal et al. 1, que se adaptaram este ensaio degranulação para a triagem of drogas e substâncias tóxicas e demonstrar seu uso aqui.

Triclosan é um agente antibacteriano de largo espectro, que está presente em muitos produtos de consumo e foi encontrado ser uma ajuda terapêutica na doença alérgica da pele humana 7-11, embora o mecanismo deste efeito é desconhecido. Aqui demonstramos um ensaio para o efeito do triclosan sobre a desgranulação de mastócitos. Mostramos recentemente que triclosan afeta fortemente a função dos mastócitos 2. Em um esforço para evitar a utilização de um solvente orgânico, o triclosan é dissolvida directamente em tampão aquoso com calor e agitação, e a concentração resultante é confirmado por espectrofotometria de UV-Vis (usando ε 280 = 4,200 L / M / cm) 12. Este protocolo tem o potencial para ser usado com uma variedade de produtos químicos para determinar os seus efeitos sobre a desgranulação de mastócitos e, mais genericamente, o seu potencial alérgico.

Introdução

Os mastócitos são altamente granulado células imunes efetoras que servem como mediadores importantes na asma, alergias, parasitas defesa e carcinogênese 13-16. Eles residem em quase todos os tecidos vascularizados 15, onde armazenar com segurança os mediadores inflamatórios e alérgicos em grânulos citoplasmáticos até ser ativado para desgranulam. Degranulação é a exocitose de grânulos à membrana, o que resulta na liberação de mediadores farmacologicamente ativos, tais como a histamina, triptase, leucotrienos e 15. Este processo resulta na iniciação de reacções de hipersensibilidade do tipo I, que são críticas para a montagem de defesa contra parasitas bem como o início de reacções alérgicas, asma, e 15 cancerígenas.

Os mastócitos e basófilos, FceRI expressam receptores, os receptores de alta afinidade para a imunoglobulina E (IgE) 17. A exposição a um alergénio ou antigénio provoca a agregação de múltiplos receptores de IgE FceRI ligados 17, e é este so-chamada "reticulação" de receptores Fc de IgE ligadas, que inicia o processo de desgranulação: uma cascata de acontecimentos de fosforilação de tirosina, a activação de fosfolipase C, o efluxo de cálcio das reservas internas, e influxo de cálcio para dentro da célula 18. Este influxo de cálcio é necessária para a desgranulação e, ainda, sinaliza a fusão com a membrana dos grânulos antes de causar a exocitose de grânulos 15. Experimentalmente, um ionóforo de cálcio pode ser utilizada para transporte de cálcio directamente através da membrana da célula 19, o que evita essencialmente todas as etapas de transdução de sinal, antes da etapa 20 do influxo de cálcio, permitindo a identificação de um alvo por via de um tóxico como estando a montante ou a jusante de cálcio de sinalização 20.

Degranulação pode ser medido de forma rápida e eficaz, o controlo da libertação de β-hexosaminidase no sobrenadante de células, que é libertada a partir dos grânulos de forma linear juntamente com a histamina 6, mas ié muito mais fácil de detectar utilizando uma reacção enzima-substrato simples e um leitor de microplacas para análise do produto fluorescente. Este ensaio de microplacas, como descrito na secção do protocolo, baseia-se num método robusto originalmente desenvolvida por Naal et ai. 1, que quantifica a clivagem do substrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-N-acetil--D-β glucosaminide por β- hexosaminidase. Nós modificamos o ensaio para efeitos de teste de drogas e substâncias tóxicas, com triclosan destaque aqui. Este método quantifica fiável desgranulação, é uma alternativa de baixo custo para, por exemplo, o fluxo de métodos de detecção baseados em citometria de 21, e tem o potencial de se prestar bem para rastreio de alto rendimento de uma grande variedade de fármacos anti-alérgicos, assim como imunotóxicas ou substâncias químicas alergênicas. Este último ponto é particularmente importante, tendo em conta o relatório do Conselho Nacional de Pesquisa 2007 "Ensaios de Toxicidade no Século 21: Uma visão e uma StratEGY "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ), que preconiza para o desenvolvimento de testes de toxicologia de alto rendimento que utilizam a cultura de células para reduzir a utilização dispendiosa de animais tradicionais, tais como ratinhos de laboratório. O protocolo desenvolvido pela desgranulação Naal et ai. 1, e modificada por nós 2, utiliza a linha de células RBL-2H3, que é um modelo bem aceite homóloga aos mastócitos das mucosas humanas ou basófilos 3-5. (Métodos para a cultura de células RBL-2H3 estão detalhados em Hutchinson et al. 22). Este ensaio poderia provavelmente ser adaptado a qualquer tipo de célula mastro em anexo.

Triclosan (TCS) é um antimicrobiano de amplo espectro que tem sido utilizado por mais de 30 anos em hospitais, produtos de cuidados pessoais e de bens de consumo 23,24. O modo de ação para a característica antimicrobiana da TCS é a inibição da biossíntese de ácidos graxos, provavelmente inibindo enoil-acilproteína transportadora reductase 25,26. É encontrado em todo o mundo em uma ampla gama de produtos de consumo, tais como gel de banho, loção para as mãos, creme dental, enxaguatório bucal, e na mão sabonetes em concentrações de até 0,3% ou 10 mM 24. O uso generalizado de TCS resultou em níveis detectáveis ​​em humanos 27-29 e em rios e córregos 30. Um estudo feito pela Allmyr et al. 27 demonstraram que a TCS e seus metabólitos estão presentes tanto no plasma e no leite de mães que amamentam. Importante, a TCS é facilmente absorvido pela pele 31-37. Queckenberg et ai. Encontrado 37 ~ 10% a absorção de um ~ 70 mM TCS creme na pele humana, dentro de 12 horas, resultando em uma concentração significativa na pele, onde residem os mastócitos.

SCT foi demonstrado clinicamente para controlar a doença alérgica da pele humana 7-11, mas o mecanismo pelo qual a TCS alivia as doenças alérgicas de pele tem sido desconhecido 38. Usando o ensaio de fluorescência de microplacas detailed neste vídeo, demonstramos recentemente que a TCS, a concentrações tão baixas quanto 2 uM, atenua significativamente a função de mastócitos e desgranulação, proporcionando uma potencial explicação para estes dados clínicos 2. Além de proporcionar uma explicação para estes dados clínicos, os nossos resultados em Palmer et al. 2 sugerem que a TCS de sinalização tem como alvo a jusante das moléculas do influxo de cálcio. Devido à importância da sinalização de cálcio em muitos outros processos imunológicos e biológicos, a TCS poderia ter efeitos adversos sobre uma ampla variedade de processos biológicos necessários. Na verdade, Udoji et al. 39 mostrou que TCS suprime a atividade das células natural killer humano lítico, outra função imune inato importante.

Para além do seu potencial como uma ajuda terapêutica na doença alérgica da pele (ou, inversamente, como um immunotoxicant), TCS também pode ser um disruptor endócrino 40-49. Assim, um procedimento claro de como preparar este produto químico em solução is de interesse para os toxicologistas. Porque SCT é uma pequena molécula hidrófoba, os veículos orgânicos são muitas vezes utilizados para torná-lo mais solúvel em água. Na maioria dos estudos de toxicidade em que a TCS foi testado, a preparação envolveu a dissolução em água com o auxílio de um solvente orgânico tal como etanol, acetona, ou óleo 2,50,51. No entanto, muitas vezes esses solventes são biologicamente ativa-se, complicando assim a interpretação da substância em estudo de dados 51. Na verdade, de acordo com Rufli et al. 52 e outros 53, recomenda-se que as soluções de ensaio para ensaios de toxicidade aquática são preparadas utilizando métodos físicos sobre os métodos químicos, devido ao potencial de solventes químicos para criar artefactos de toxicidade. Nós mostramos anteriormente que a TCS dissolvido em 0,24% de etanol / água (v / v) e sonicado por 30 min amortece RBL degranulação dos mastócitos 2. O etanol em concentrações mais elevadas do que 0,24% foi mostrado para amortecer degradação mastócitoscanulação 54,55, exemplos dos efeitos potencialmente de confusão de solventes orgânicos em estudos de toxicidade.

Não só é importante ter em conta o efeito de solventes no organismo ou células utilizadas para o estudo, mas também é importante para monitorizar o efeito de um solvente sobre o próprio produto químico de teste. Por exemplo, Skaare et ai. Dissolvendo 51 descobriram que a TCS em polietileno-glicol (normalmente encontrados nos dentífricos e bochechos) atenuou os efeitos anti-bacterianos e anti-placa em mulheres saudáveis ​​do sexo feminino durante a dissolução em óleos provocou uma perda completa de função. Portanto, a capacidade de diferentes solventes para modular tóxico e de drogas, incluindo TCS, efeitos devem ser considerados no desenho do ensaio. A utilização de óleos ou aditivos de sabor pode interferir com os efeitos de TCS em vários produtos 50,51.

Num esforço para eliminar a necessidade de utilizar solventes orgânicos, que melhorado para o nosso método de dissolução TCS 2, eliminando o uso de um sol orgânicadesabafar. No presente protocolo, dissolver TCS grânulos diretamente em tampão aquoso com o calor (≤ 50 ° C) e, em seguida, verificar a concentração desse estoque TCS por espectrofotometria de UV-Vis. Estas melhorias são possíveis porque SCT é solúvel em água até 40 uM ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) e tem sido demonstrado que resistem à degradação quando aquecido a 50 ° C ( http:// / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) 56,57. Também tem a vantagem de espectrofotometria de UV-Vis, como TCS também é conhecido por absorvem fortemente a 280 nm, com um 58 coeficiente de extinção molar de 4,200 L / mol / cm 12.

Este protocolo oferece uma maneira simples, mas eficaz para dissolver TCS grânulos para um tampão, sem o auxílio de um solvente orgânico, incluindo o baixo custo e rápida verificaçãode concentração e descreve um ensaio de microplaca fluorescente poderoso para monitorar os efeitos químicos sobre a degranulação dos mastócitos.

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Protocolo

Note-se que todas as receitas tampão são incluídas numa tabela no final do texto do protocolo.

DIA 1:

1. Preparação de Células

  1. Planeje 96 poços esquema de configuração da placa, centrando-se amostras no layout, a fim de evitar efeitos de borda. Atribuir três repetições para cada concentração testada TCS (± desgranulação estimulante de antigénio ou ionóforo), bem como triplicados para a libertação espontânea (sem estimulante degranulação), a libertação máxima (0,2% de Triton X-100 [TX] detergente de lise), bem como poços reservado para amostras de fundo (que não contêm células). Para cada dia experimental replicar, escolher um novo layout aleatório das concentrações das amostras TCS.
  2. Quente mídia RBL (Receita fornecida na tabela) e tripsina em 37 ° C banho-maria.
  3. Confira as células RBL em T-25 frasco (2-4 dias desde a última passagem e menos de 3-4 meses desde que foram descongelados) para os sinais gerais de boa curath: pH adequado indicado pela cor dos meios de comunicação e falta de nebulosidade. Colocar o balão sob um microscópio de luz para confirmar que o balão esteja livre de contaminação e que as células parecem saudáveis, adequadamente confluentes, e principalmente em anexo. Note-se que as células devem ser verificados para a contaminação por micoplasma, aproximadamente a cada seis semanas 22.
Tratamento Triplicatas
Estimulado, 0 mM TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4
Estimulada, 0,001 fiM TCS F6, G6, H6
Estimulada, 0,1 uM TCS A4, B4, C4
Estimulada, 1 uM TCS A6, B6, C6
Estimulado, 5 mM TCS F5, G5, H5
Estimulada, 10 uM TCS A3, B3, C3
Estimulada, 15 uM TCS A5, B5, C5
Estimulada, 20 uM TCS F7, G7, H7
Estimulado, além de maior [TCS] F3, G3, H3
Espontânea, sem TCS (inclui zomba) A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8
TX-100, No TCS D10, D11, D12, E10, E11, E12
Nenhuma célula, fundo, além de maior [TCS] G10, G11, G12, H10, H11, H12

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  1. Pegue o frasco de células RBL na cultura de tecido estéril (TC) capô. As células são ligadas para o bottom do balão. Trabalhando sob o capô CT e utilizando uma técnica estéril padrão, remover todos os meios de frasco com uma pipeta estéril, as células permanecem ligados ao fundo do frasco. Em seguida, enxaguar frasco com 2 ml de tripsina, em seguida, descartar esta lavagem.
  2. Adicionar exactamente 2 ml de tripsina a cobrir a parte inferior do frasco. Colocar em 37 ° C incubadora durante 5 min para permitir que as células a separar a partir do fundo do balão.
  3. Após 5 min, atingiu o lado do frasco com uma mão aberta para soltar as células. Imediatamente, adicione 18 ml de mídia RBL para lavar as células fora do frasco e para saciar a tripsina. Tomar imediatamente a mistura de células-media-tripsina fora do frasco e transferir para um novo tubo de 50 ml estéril (o volume total neste tubo é agora 20 ml).
  4. Após misturar suavemente, mas completamente, retirar 50 mL de suspensão de células a partir deste tubo, e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml esterilizado, o que é um exemplo a ser contado. Tomar esta amostra, assim como os 50 ml0; tubo contendo a mistura de células-media-tripsina fora do capô TC para a bancada.
  5. Gire o tubo de 50 ml em centrífuga (com equilíbrio) por 8 min a 500 xg; esta força células pelotas de forma eficaz.
  6. Durante o tempo de centrifugação, a contagem das células na amostra que foram isoladas antes de girar. Para fazer isso, em primeiro lugar adicionar 50 ul de corante azul de tripano a 50 ul de células em 1,5 ml de tubo, e suave mas completamente pipetar para cima e para baixo para misturar 5x. Imediatamente, transferir 10 ul desta mistura para a hematocytometer vidro, e contar as células na área da grelha de acordo com as instruções do fabricante. Contar, no mínimo, 100 células por resultados estatísticos razoáveis.
  7. Back in the hood TC, remover o sobrenadante de células que foram girados para baixo.
  8. Tapar o tubo celular, e agite sedimento no fundo do tubo para soltar as células.
  9. Adicionar meio de células tratadas com tripsina para se obter uma densidade de 0,5 x 10 6 células / ml, com base na contagem das células.
  10. Misture bem, mas com cuidado para manter as células em suspensão durante o processo de revestimento. Usando um Pipetman, colocar as células a 100 ul / cavidade em uma placa de 96 poços (plana, de fundo preto), seguindo o modelo de placa de folha. Randomizar como as células são adicionados aos poços para evitar o erro sistemático, e misturar depois de cada conjunto de três poços foi adicionado. Não se esqueça de colocar as células nos poços rotulados para as amostras de fundo.
  11. Uma vez que todas as células foram transferidas, colocar a tampa de placa sobre a placa, e transferir para a incubadora (37 ° C / 5% de CO 2) durante a noite. Limpe seguindo técnica asséptica padrão.

DIA 2:

2. Preparação de Triclosan

  1. Usando um cilindro, medida 250 ml Tyrodes tampão graduado (Receita fornecida na tabela) em um frasco de 500 ml Erlenmeyer rotulado como "TCS-buffer." Adicionar bar mexa. Utilizar material de vidro, misture bar, termômetro designado para uso com TCS só.
  2. Também nesta altura, medida a 250ml Tyrodes em um Erlenmeyer de 500 mL separado, identificado como "tampão de controle." utilizar material de vidro, agitar bar, termômetro que não são designados para a TCS. Adicionar bar mexa.
  3. Pesar 0,0022 g de TCS grânulos e transferir para o balão "TCS-tampão" (que contém 250 ml Tampão Tyrodes). Para transferir eficientemente grânulos de Erlenmeyer, use 10 ml das medidos 250 ml Tyrodes para lavar pesar barco, certificando-se de tudo TCS foi transferido.
  4. Place "TCS-tampão" frascos em uma combinação de placa / placa de agitação magnética, e configurá-lo para mexer em um manageably alta velocidade. Uma vez bem misturados, este estoque TCS será nominalmente de 30 mM (concentração real será calculado após o aquecimento). (Faça tudo de mistura em um exaustor química.)
    1. Também nessa época, coloque o "tampão controle" frascos (contendo nenhuma TCS) para uma segunda combinação placa / placa de agitação magnética, e configurá-lo para agitar a uma velocidade similar.
  5. Ligue lâmpada UV / Vis para aquecer a lâmpada para uso posterior.
  6. Aquece-se a solução de "SCT-tampão", a 50 ° C, sob agitação constante. Após atingir a temperatura, o tempo, durante 90 minutos. Durante os 90 minutos, continuar a monitorizar a temperatura de 50 ° C ea velocidade de agitação adequada frequência.
    1. Ao mesmo tempo, aquecer a solução de "tampão de controlo" (que é cerca de 250 ml de tampão de Tyrode normal) a 50 ° C com agitação contínua. Após atingir 50 ° C, tempo durante 90 minutos, tempo durante o qual a temperatura (mantendo a 50 ° C) e sob agitação são ambas monitorizadas.
  7. No final da década de 90 min, tomar dois frascos Erlenmeyer fora dos pratos quentes e transferência para a bancada.
  8. Usando a função de verificação de comprimento de onda num espectrofotómetro UV / Vis, placa da máquina em 1 ml da solução aquecida "controlo de tampão" antes de digitalizar 1 ml da solução aquecida "SCT-tampão". Verifique a forma do espectro, umad valor recorde de absorção a 280 nm. Para determinar a concentração de, utilizar a equação de Beer-Lambert (A 280 = 280 ε ℓ c) utilizando uma ε 280 de 4200 L / mol / cm e 12 ℓ de 1 cm.
  9. Após a determinação da concentração de TCS, adicionar 0,249 g de albumina sérica bovina (BSA) a 249 mL restantes da solução "SCT-tampão", e misturar bem.
    1. Simultaneamente, adicionar 0,249 g de BSA para 249 ml o restante da solução de "tampão de controlo", e misturar bem.

DIA 2:

3. Antígeno-estimuladas Ensaio Degranulação Usando células RBL-2H3

  1. Antes de iniciar, verifique o pH de todos os buffers sendo usados, e garantir que eles são claros e não turva: isto inclui Tyrodes tampão, tampão de acetato de sódio e tampão de carbonato de glicina (receitas fornecidas na tabela).
  2. Mídia RBL quentes e tripsina em 37 ° C banho-maria.
  3. Adicione BT (1 mg / ml0; BSA em tampão de Tyrode): 0,05 g de BSA + 50 ml de tampão de Tyrode (X2). Coloque em banho-maria a 37 ° C.
  4. Adicione 0,2% de Triton X-100: 3,136 ml de BT + 64 ul de 10% de Triton X-100 (concentração final de Triton X-100 é de 0,2%). Misture bem por inversão, mas não vórtice. Coloque em banho-maria a 37 ° C.
  5. Iniciar a preparação da TCS e tampão Tyrodes aquecida (passos "2", acima) Nota:. Não comece o próximo passo (exposição IgE) até a "TCS-tampão" e soluções "tampão" de controle de chegar a 50 ° C e agitar para os primeiros 70 min de tempo de 90 min aquecimento / agitação.
  6. Uma vez que ambas as soluções têm sido agitada a 50 ° C durante 70 minutos, composição de 0,1 ug / mL de anti-DNP IgE rato (Sigma) em meio de RBL para poços de amostras a ser sensibilizados (100 ul / poço). IgE estoque não deve ter mais de 30 dias, quando armazenado a 4 ° C; gravar quantos anos o estoque é. Agite para misturar, mas não vórtice IgE.
  7. Dentro de uma câmara TC,adicionar 0,6 ul estoque IgE (Stock é de 1 mg / ml) a 6 ml de meio de RBL em um tubo de 50 ml. Em um segundo tubo de 50 ml, adicionar 6 ml de apenas media RBL simples (que se destina a amostras nonsensitized).
  8. Despeje todos os meios de placa de 96 poços (que foi preparado no dia 1) em pia, e trazer a placa sob o capô TC.
  9. Aleatoriamente adicionar 100 ul / media mistura IgE aos poços que devem ser estimuladas (48 total de poços). Esta mistura não se destina a "espontânea", "TX" e amostras de "fundo".
  10. Aleatoriamente, adicionar 100 mL de mídia RBL simples apenas para "TX", "espontânea" e "fundo" poços.
  11. Coloque a tampa da placa na placa e mova placa em 5% CO 2/37 ° C incubadora por 1 hora.
  12. Durante 1 hora de incubação, siga os passos de 3,13-3,24.
  13. Na bancada, preparar as diluições do antigénio. Adicionar 0,53 ml de 1,6 mg / ml de caldo de DNP-BSA + 850 ul & #160; BT para obter uma concentração de antigénio de 1 mg / ml. Vortex e inverter este estoque para misturar.
  14. Uma vez que "SCT-tampão" e "solução tampão de contraprova" ter sido aquecido e, em seguida, agitada durante 90 min a 50 ° C, continua-se com o resto da preparação para o protocolo de SCT (ir para passos 2.6 - 2.8.1). Após a BSA estar dissolvida em ambas as soluções, continuar a seguir.
  15. Começar a preparar os buffers de exposição, com ± Ag, ± TCS. Em primeiro lugar, a partir da amostra ml de solução de "SCT-tampão" (que já foi aquecida e agitada durante 90 min), a transferência de 50 mL para um novo tubo de 50 ml 249. Remover 20 ul desta aliquota de 50 ml e substituí-la por 20 ul da 1 ug / ml de antigénio preparada anteriormente para uma concentração de 0,0004 ng / ml de DNP-BSA antigénio final. Vortex e inverter.
    1. Etiqueta este "tubo 1, de alta TCS / Ag + / + BT." É utilizado para diluições e maior exposição à concentração TCS.
  16. A partir da amostra ml de solução de "tampão de controlo" 249, transferir 50 mL para um novo tubo de 50 ml. Remover 20 ul desta nova aliquota de 50 mL e substituir por 20 ul da 1 ug / ml de antigénio preparada anteriormente para uma concentração de 0,0004 ng / ml de DNP-BSA antigénio final. Vortex e inverter.
    1. Etiqueta este "tubo 2, No TCS / Ag + / + BT". Usado para diluições TCS e 0 mM de exposição concentração TCS.
  17. Agora tirar 50 ml de solução "TCS-tampão" e colocar em outro tubo de 50 ml. Retire 20 mL desta nova alíquota de 50 ml e substituí-lo com 20 l de simples BT. Vortex e inverter. Não é adicionado antigénio.
    1. Rotular este "tubo 3, de alta TCS / Não Ag / + BT." Isto é usado para o fundo.
  18. Transferir 50 ml de solução de "controlo de tampão" para outro tubo de 50 ml. Retire 20 mL dessa ne w 50 ml alíquota e substituí-lo com 20 l de simples BT. Vortex e inverter. (Sem Ag é adicionado.)
    1. Rotular este "tubo 4, No TCS / Não Ag / + BT." Isto é usado para o fundo e as amostras espontâneas.
BSA TCS Antígeno
Tubo 1 figure-protocol-2 Alto [] figure-protocol-3
Tubo 2 figure-protocol-4 NO figure-protocol-5
Tubo 3 / "Width =" files/ftp_upload/50671/check.jpg 15px "/> Alto [] NO
Tubo 4 figure-protocol-6 NO NO
  1. Calcular e gravar volumes para diluições após a determinação da concentração do "SCT-tampão de" estoque. O volume total para cada concentração de diluição deve ser de 1 ml, e deve ser preparada em um tubo de microcentrífuga estéril. Use P2 calibrado e P1000 Pipetman.
Concentração Alta Triclosan Tyrodes + + BSA a 0,0004 ng / ml de Ag
(Tubo 1 a partir de cima) 		Aquecida BT 0,0004 ug / ml de Ag
(Tubo 2 a partir de cima)
20 uM
15 uM
10 uM
5 fiM
1 uM
0,1 fiM
0,001 mM
0 mM (topo da placa) ----------------------- 500 mL além de outros 500 mL
0 mM (parte inferior da placa) ----------------------- 500 mL além de outros 500 mL
  1. Depois de 1 hr IgE incubação, tomar placa de incubadora e atirar em todos os meios de pia. (Nota: se os produtos químicos de teste são conhecidas por serem mais tóxica do que a TCS de produtos de consumo, a eliminação de resíduos perigosos podem ser necessárias.)
  2. Usando um Combitip, lavar aleatoriamente células na placa de 96 poços com tampão de Tyrode-BSA (200ul / poço). Soltar o tampão de lavagem para os lados das cavidades, em vez de directamente sobre as células ligadas, de modo a evitar perturbar as células anexadas. Repita o processo uma segunda vez.
  3. Para se preparar para a aplicação de tratamentos, vórtice e inverter diluições direita antes além da chapa.
  4. Começando com a secção superior da placa: Aleatoriamente adicionar triplicados de 200 ul cada uma das soluções de antigénio (com as concentrações correctas de SCT) às cavidades correspondentes. Continue a parte inferior da placa. Adicionar solução de "controlo de tampão" plus Ag (de "Tubo 2" acima) para todos os "simulações" sobre a placa.
  5. Adicionar 200 mL de soluções adequadas para os poços correspondentes:
    1. Adicionar 200 ul de 0,2% de Triton X-100 poços de "TX"-designados.
    2. Em seguida, adiciona-se 200 ul de tubo 3 para os três poços marcados "Antecedentes (Bkgd)-Maior TCS" sobre a placa.
    3. Finalmente, adicione 200 mLTubo de 4-6 poços rotulado "espontânea".
  6. Incubar a placa durante 1 hora, em 37 ° C / 5% de CO 2.
  7. Durante 1 hora de incubação: Obter dois baldes de gelo (um para a placa "antiga" em incubadora e um para nova placa). Descongelar 4-metilumbeliferil-N-acetil-beta-D-glucosaminide (4-MU), à temperatura ambiente durante até 40 minutos, mantendo-se em tiras, pois é sensível à luz.
    1. Uma vez 4-MU estoque é descongelado, compõem solução de 4-MU de trabalho: estoque de 150 mL + 14,85 mL de tampão acetato de frio (receita dada na tabela); vórtice e inverter. Manter no tubo de centrífuga de 50 ml, envolvido em folha, e em gelo até à utilização.
    2. Usando Combitip, adicione aleatoriamente 100 l frio solução de trabalho 4-MU na parte inferior de cada poço de uma nova Grenier preto placa de 96 poços (em balde de gelo # 2). Iniciar primeiro por adição da solução de trabalho de forma aleatória no interior da parte superior da placa, de forma aleatória no interior da parte inferior da placa, de forma aleatória dentro de Triton X-100 poços,e, finalmente, aleatoriamente dentro dos poços de fundo.
    3. Saia nova caixa de P200 dicas para o próximo passo.
  8. No final do 1 hr de incubação, colocar placa de células de incubadora para balde de gelo # 1, pipeta sobrenadante cima e para baixo 4-5x (suavemente, não a introdução de bolhas), indo ao redor do bem para uma boa mistura, mas não tocar as células ao misturar . Sistematicamente, tirar amostra de 25 mL de cada poço e local para a nova placa com o substrato (a mesma ordenação de amostras, como originalmente planejado). Pipeta cima e para baixo para misturar amostra completamente quando em novo poço, sem a introdução de bolhas.
  9. Incubar durante 30 min a 37 ° C / 5% de CO 2.
  10. Após 30 minutos de incubação, adiciona aleatoriamente 200 ul de tampão glicina-carbonato de frio por poço (usando Combitip) para encher os poços até 325 ul totais. (Faça isso além dos X-100 amostras Triton último, para evitar Triton X-100 spillover). Verifique se há bolhas antes chapa leitura (picar com limpo P10 pipetate ponta a aparecer as bolhas).
  11. Execute o prato no leitor de placas de fluorescência (vá para a seção 4).

DIA 2:

4. Fluorescentes Placa Instruções leitor e Análise de Dados

  1. Abra o programa Gen5 e seção experiência aberta.
  2. Ligue o leitor de placa e placa de inserção (canto superior esquerdo é A1).
  3. Protocolo figure-protocol-7 Procedimento figure-protocol-8 Leia para definir leituras personalizadas. Não acrescentam nada sobre amostras, réplicas, etc, a fim de recolher dados de fluorescência matérias de cada poço.
  4. Em "Leia" escolha "fluorescência", "Endpoint", "velocidade normal", "Gain 40", "Excitação 360/40", "Emissão 460/40", posição Optics: Top 50%. Top óptico offset: 7mm. No shake, sem atraso, não cinética, nenhum monitor bem, a temperatura: incubadora fora.
  5. Escolha fundo preto liso, placa de 96 poços (Grenier 96 poços, parte inferior lisa).
  6. Lidar com o layout da placa: Protocolo figure-protocol-9 layout da placa. Configure amostras sem indicar se repete, diluições, etc
  7. Prato figure-protocol-10 ler.
  8. Salvar o arquivo: Clique no botão "Excel", que irá exportar arquivos de dados para o Excel. Faça isso para o layout da placa e para a matriz. Salve o arquivo no computador e em um drive USB.
  9. No Excel, subtrair o fundo leitura média de cada amostra, incluindo Triton X-100 poços.
  10. Calcule% degranulação relativa dividindo cada valor (tendo já havia subtraído fundo) pelo valor médio de Triton X-100, e depois multiplique por 100 para torná-lo uma porcentagem.
  11. Média de todas as triplicatas, e calcular o desvio padrão. Dados do gráfico no Excel como valores médios ± desvio padrão. Para os testes estatísticos, passar agora a software GraphPad Prism por.

DIA 2:

5. Ionóforo Estimulada Ensaio Degranulação Usando células RBL-2H3

  1. Siga o protocolo de "Preparação de células" (Seção 1, dia 1) e "Preparação de triclosan" (Seção 2, Dia 2), conforme as instruções acima. O exemplo layout da placa para a estimulação ionóforo é mostrado abaixo.
Tratamento Triplicatas
Estimulado, 0 mM TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4
Estimulada, 0,001 fiM TCS F6, G6, H6
Estimulada, 0,01 fiM TCS F3, G3, H3
Estimulada, 0,1 uM TCS A4, B4, C4
Estimulada, 1 uM TCS A6, B6, C6
Estimulado, 5 uM [TCS F5, G5, H5
Estimulada, 10 uM TCS A3, B3, C3
Estimulada, 15 uM TCS A5, B5, C5
Estimulada, 20 uM TCS F7, G7, H7
Espontânea, com DMSO, sem TCS (inclui zomba) A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8
TX-100, com o DMSO, n TCS D10, D11, D12, E10, E11, E12
No fundo células, com DMSO, além de maior [TCS] G10, G11, G12, H10, H11, H12

figure-protocol-11
Clique aqui para ver a imagem ampliada .

  1. Antes de iniciar, verifique o pH de todos os buffers sendo usados, e garantir que eles são claros e não turva. Tyrodes, tampão de acetato de sódio, e tampão de carbonato de glicina (receitas indicadas na tabela).
  2. Preparar um tubo de 50 ml de BT, adicionando 0,05 g de BSA a 50 ml de tampão Tyrodes e em vortex para misturar bem. Incubar em banho-maria a 37 ° C.
  3. Adicione 0,2% de Triton X-100 com 0,0032% de DMSO (a concentração de cálcio ionóforo veículo final) por adição de 96 ul de 10% de Triton X-100-4,704 ml BT. Misturar bem. Em seguida, pegue a 0,155 mL desta solução e descarte. Agora adicione de volta em 0.155 ml de DMSO 100%.
  4. Preparar um estoque de 5 mM (2,5 mg / ml) de ionóforo A23187 a partir de pó através da adição de 400 ul de DMSO a 100% fresco para dentro do frasco e ionóforo de vórtex para misturar. Uma vez em solução,transferir para um tubo de 1,5 ml, o conteúdo da ficha e data de validade e de hoje (3 meses após a preparação quando armazenadas adequadamente a -20 ° C).
    1. Alternativamente, se estiver usando um estoque congelado hoje, degelo no gelo, e verifique se a mM ionóforo A23187 5 é bem misturado e clara. Vortex, súbito, e inverter esse estoque antes de usar. Data-base de preparação e Lot # deste A23187.
  5. Uma vez que "SCT-tampão" e "solução tampão de contraprova" ter sido aquecida e agitada durante 90 min, continuar o resto da preparação para o protocolo TCS (ir para 2.6-2.8.1 passos). Após a BSA é bem misturado em ambas as soluções, continue com as etapas do protocolo restantes.
  6. A partir da amostra ml de solução de "SCT-tampão de" 249, transferir 50 mL para um novo tubo de 50 ml. Remover 1,8 mL da alíquota de 50 mL e adicionar 1,8 mL de 5 mM de ionóforo de estoque. Vortex 3x por 8 segundos e inverter 3x. A concentração final é de um ionóforo80 nm. Note-se que esta concentração de A23187 variará dependendo estoque potência, e uma resposta dose de ionóforo A23187 é recomendado para identificar uma concentração de A23187 que provoca um nível desgranulação de aproximadamente 20% de libertação máxima, o qual foi identificado como sendo não citotóxico para uma RBL-2H3 células por ensaio de citotoxicidade (ver 2).
    1. Etiqueta este "tubo 1, de alta TCS / + ionóforo / + BT." Usado para diluições e maior exposição à concentração TCS.
  7. A partir da amostra ml de solução de "tampão de controlo" 249, transferir 50 mL para um novo tubo de 50 ml. Retire 1,8 mL da alíquota de 50 ml e adicionar novamente em 1,8 mL de 5 estoque ionóforo mM. Vortex 3x por 8 segundos e inverter 3x. Ionóforo concentração final é de 180 nm.
    1. Etiqueta este "tubo 2, No TCS / + ionóforo / + BT." Isto é usado para diluições e concentrações 0 TCS fiM.
  8. Do ml da amostra de R 249 20; solução TCS-tampão ", a transferência de 50 ml para um novo tubo de 50 ml. Retire 1,8 ml da nova alíquota de 50 ml e adicionar 1,8 mL de DMSO 100%. Vortex 3x por 8 segundos e inverter 3x, nenhum ionóforo é adicionado.
    1. Etiqueta este "tubo 3, de alta TCS / No ionóforo / + BT / + DMSO", usado para o fundo.
  9. A partir da amostra ml de solução de "tampão de controlo" 249, transferir 50 mL para um novo tubo de 50 ml. Retire 1,8 mL da nova alíquota de 50 ml e adicionar 1,8 mL de DMSO 100%. Vortex 3x por 8 segundos e inverter 3x. No ionóforo é adicionado.
    1. Etiqueta este "tubo 4, No TCS / No ionóforo / + BT / + DMSO", usado para amostras liberação espontânea.
BSA TCS Ionóforo Adicionou-se 100% de DMSO
Tubo 1 "Src =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" 15px "/> Alto [] figure-protocol-12 NO
Tubo 2 figure-protocol-13 NO figure-protocol-14 NO
Tubo 3 figure-protocol-15 Alto [] NO figure-protocol-16
Tubo 4 figure-protocol-17 NO NO eck marca "fo: content-width =" 0,1 em "src =" / "width =" files/ftp_upload/50671/check.jpg 15px "/>
  1. Calcular e gravar volumes para diluições após a determinação da concentração do "SCT-tampão de" estoque. Use P2 calibrado e P1000 Pipetman. O volume total para cada concentração de diluição deve ser de 1 ml, e deve ser preparada em um tubo de microcentrífuga estéril:
Concentração Alta Triclosan + Tyrodes + BSA 180 nM A23187 (tubo 1 de cima) Aquecido BT 180 nM A23187 (tubo 2 de cima)
20 uM
15 uM
10 uM
5 fiM
1 uM
0,1 fiM
0,001 mM
0 mM (topo da placa) ---------------------------------- 500 mL além de outros 500 mL
0 mM (parte inferior da placa) ---------------------------------- 500 mL além de outros 500 mL
  1. Tome as células semeadas ontem fora da incubadora, e vazias na mídia na pia. Usando um Combitip, lavar aleatoriamente células na placa de 96 poços com a BT (200 ul / poço). Repetir a lavagem mais uma vez.
  2. Para se preparar para a aplicação de tratamentos, vórtice e inverter diluições direita antes além da chapa. Começando com a secção superior da placa: Aleatoriamente adicionar triplicados de 200 ul cada da concentração correcta de SCT a corresponding bem. Continue a parte inferior da placa. Adicionar solução de "controlo de tampão" plus A23187 (a partir de "Tubo 2" acima) para todos os "simulações" sobre a placa.
  3. Adicionar 200 mL de soluções adequadas para os poços correspondentes:
    1. Adicionar 200 ul de 0,2% de Triton X-100 poços de "TX"-designados.
    2. Em seguida, adiciona-se 200 ul de tubo 3 para os três poços marcados "Antecedentes (Bkgd)-Maior TCS" sobre a placa.
    3. Por último, acrescente 200 ml de tubo quatro a seis poços rotulados como "espontânea".
  4. Incubar a placa durante 1 hora, em 37 ° C / 5% de CO 2.
  5. Durante a 1 hora de incubação: Obter dois baldes de gelo (um para a placa "antiga" em incubadora e um para nova placa). Descongelar 4-metilumbeliferil-N-acetil-beta-D-glucosaminide (4-MU), à temperatura ambiente durante até 40 minutos, mantendo-se em tiras, pois é sensível à luz.
    1. Uma vez 4-MU estoque é descongelado, maquiagem 4-MU de trabalho solução queem: 150 estoque mL + 14,85 mL de tampão acetato de frio (receita dada na tabela); vórtice e inverter. Manter no tubo de centrífuga de 50 ml, envolvido em folha, e em gelo até à utilização.
    2. Usando Combitip, adicionar 100 ul aleatoriamente frio solução de trabalho de 4-MU no próprio fundo de cada poço de uma nova placa de Grenier preto de 96 poços (em balde de gelo # 2): começar por adição da solução de trabalho de forma aleatória no interior da parte superior da prato, de forma aleatória no interior da parte inferior da placa, de forma aleatória dentro de Triton X-100 poços, e, finalmente, aleatoriamente dentro dos poços de fundo.
    3. Saia nova caixa de P200 dicas para o próximo passo.
  6. No final do 1 hr de incubação, colocar placa de células da incubadora em balde de gelo # 1, pipeta sobrenadante cima e para baixo 4-5x (suavemente, não a introdução de bolhas), indo ao redor do bem para uma boa mistura, mas não tocar as células ao misturar . Sistematicamente, tirar amostra de 25 mL de cada poço e local para a nova placa com o substrato (a mesma ordem de SAmples, como originalmente planejado). Pipeta cima e para baixo para misturar amostra completamente quando em novo poço, sem a introdução de bolhas.
  7. Incubar durante 30 min a 37 ° C / 5% de CO 2.
  8. Após 30 minutos de incubação, adiciona aleatoriamente 200 ul de tampão glicina-carbonato de frio por poço (usando Combitip) para encher os poços até 325 ul total de (fazer esta adição aos Triton X-100 amostras últimos, a fim de evitar o Triton X-100 de transbordamento). Verifique se há bolhas antes da placa de leitura (picar com limpo P10 ponteira para estourar as bolhas).
  9. Execute o prato no leitor de placas de fluorescência (Siga todos os passos na secção 4).

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Resultados

Quando aquecida a 50 ° C durante 90 min, o espectro de absorção de UV-Vis de SCT produz uma curva forte, suave entre ~ 260 e 300 nm, com pico a 280 nm, como mostrado na Figura 1. Espectrofotometria de UV-Vis, portanto, é uma importante ferramenta que pode ser utilizada para calcular a concentração, uma vez que o coeficiente de absorção molar publicada a 280 nm é de 4.200 L / mol / cm 12. Nós descobrimos que a TCS não cai para fora da solução durante o período de tempo de todo o experimento desgranulação, após aqu...

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Discussão

Em 2004, Naal et ai. Uma desenvolveu um biossensor de mastócitos para o ensaio de elevado rendimento de degranulação. É um ensaio robusto que nós adaptamos para os nossos estudos TCS e detalhado neste vídeo. Antes da Naal et ai. Ensaio 1, a desgranulação dos mastócitos foi avaliada rotineiramente através β-hexosaminidase 59-61, mas estes métodos iniciais utilizados fluorímetros no qual uma amostra foi lido ao mesmo tempo. Importante, Naal et al. concordância directa estabelecido en...

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Divulgações

Não temos nada a divulgar.

Agradecimentos

LMW e RHK são suportados pela Escola de Pós-Graduação da UMaine de Ciências Biomédicas e Engenharia (GSBSE); RHK também foi apoiado pelo Fundo Maine & Estação Experimental Forest. Financiamento adicional foi fornecido pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIH P20-GM103423), o Agricultural Maine & Estação Experimental Florestal (Grant Número ME08004-10, JAG), a Universidade de Maine ADVANCE Rising Tide Center (NSF Grant # 1008498) e um Research Grant Iniciado em Farmacologia / Toxicologia da PhRMA fundação (JAG). Agradecemos drs. David Holowka e Barbara Baird para o antigénio e células. Somos gratos a Hina Hashmi, Alejandro Velez e Andrew Abovian ajuda com equipamentos e ordens. Este é Maine Agricultural & Estação Experimental Floresta número de publicação 3311.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários

Células RBL-2H3

ATCCp align="center">CRL-2256

As células que usamos foram um presente, mas também estão disponíveis no ATCC

Triclosan/Irgasan

Sigma

72779

CAS# 3380-34-5

Deve ser armazenado em ambiente de baixa umidade

Trypsin

Gibco

25300-054

CAS# 3380-34-5

EMEM

Lonza

12-611F

Soro Bovino Fetal

Atlanta Biologicals

S11150

Sulfato de Gentamicina

Lonza Biological Sciences

17-518

Albumina, soro bovino

Calbiochem

12659

CAS# 9048-46-8

Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; solução a 10%)

Pierce

28314

CAS# 9002-93-1

HEPES

J.T Baker

4153-01

CAS# 75277-39-3

Cloreto de magnésio

VWRp align="center">BDH0244-500G

CAS# 7791-18-6

D-(+)-Glucose

Biomedicals

152527

CAS# 50-99-7

Cristal de cloreto de potássio

J.T Baker

3046-01

CAS# 7447-40-7

Cloreto de cálcio diidato

Acros Organics

207780010

CAS# 10035-04-8

Glicina

Sigma

G8898

CAS# 56-40-6

4-Metilumbeliferil-N-acetil-β-D-glucosaminada (4-MU)

EMD Biosciences

474502-250MG

CAS # 37067-30-4

Embrulhe em papel alumínio – é sensível à luz

Anti-DNP Mouse IgE

Sigma

D8406

O reagente tem concentração de 1 mg/ml. Alíquota 25 µ l  de reagente em tubos de microcentrífuga separados e parafilme. Armazene alíquotas em -20 ° C que não estão sendo usados e armazene a alíquota que está sendo usada em 2-8 > C por no máximo 1 mês.

DNP-BSA

Presente do Dr. David Holowka e da Dra. Barbara Baird, Cornell University<p align="center">

Sugira: catálogo DNP-BSA da life technologies# A23018

Calcium Ionophore A23187

Sigma

C75-22-1mg

O ionóforo foi feito de um pó adicionando 400 µ l  de DMSO 100% fresco no frasco de ionóforo e é mantido a -20 &graus; C

Nota: usamos o ionóforo após sua data de validade de 3 meses com sucesso

DMSO

Sigma

D2650

CAS# 67-68-5

Ácido acético

VWRp align="center">BDH3094-2

CAS# 64-19-7

Carbonato de sódio anidro

Sigma

222321

CAS# 497-19-8

Cloreto de sódio

Sigma

71376

CAS# 7647-14-5

Ácido clorídrico

VWR

BDH3026

CAS# 7647-01-0

Buffer de referência, pH 7

VWRp align="center">BDH5046

Tampão de referência, pH 10

VWRp align="center">BDH5072

Reference Buffer, pH 4

VWRp align="center">BDH5018

pH eletrodo solução de armazenamento

VWR

14002-828

Equipamento:

Espectrofotómetro DU 7500

Beckmann

Já não vendido

Leitor de placas Synergy 2

Usa o software de coleta e análise de dados de microplacas Gen5

BioTek

Módulo S

Hematocitômetro

Hausser Scientific

3110

7 x  7 CER HOT/STIR 120 V

Combinação de placa quente/placa de agitação magnética

VWRp align="center">97042-634

Centrifuge

Eppendorf

5430

Banho-maria para cultura de tecidos

VWRp align="center">Model# 89032-206

Armário de segurança biológica para cultura de tecidos

SafeGARD (capuz TC)

The Baker Company

Model# SG403A-HE

Incubadora de cultura de tecidos

ThermoScientific

Model# 3598

Pipetman

VWRp align="center">

Range: P2-P1000

Balance

Mettler Toledo

Model# AG204

medidor de pH

Symphony/VWRp align="center">Model# SB70P

Pipet-Aid

Drummond Scientific

4-000-100

Dispensador Combitip

Eppendorf

4981 000.019

Recipes:

Tampão de acetato, pH 4,4

Faça ácido acético 0,12 M e titule para pH 4,4 com NaOH 10 N. Isto é 5,3 ml de ácido acético glacial em 1 L de água MilliQ: (1 L)*(0,12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1,37 g) = 5,3 ml porque a densidade do glacial é de 1,37 g/ml

Filtro estéril em frasco de vidro autoclavado

Substrato (4-MU)

Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Armazenar em -20° C Estoque: 0,12 M em DMSO (46 mg em 1 ml de DMSO), quente a 37 ° C, vórtice, sonicar 10 min. em sonicador em banho-maria com água morna, vórtice novamente

Para cada experimento, fazer uma nova solução de substrato em tampão acetato (diluição 100x), para concentração final de 1,2 mM em tampão acetato

Tampão carbonato de glicina, pH 10

26,7 g glicina 47,1 g carbonato de sódio anidro Adicionar água deionizada por 1 L, e ajuste o pH para 10

Filtro estéril em frasco de vidro autoclavado

Tyrodes (2 L), pH 7,4

135 mM NaCl: 15,78 g (ou 270 ml de 1 M) 5 mM KCl: 10 ml de estoque 1 M 1,8 mM CaCl2: 7,20 ml de estoque 0,5 M 1 mM MgCl2: 4,00 ml de estoque 0,5 M 5,6 mM de glicose: 2,02 g (11,2 ml de 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml de estoque 1 M Usando pH HCl concentrado de ~9,7-7,4

Filtro estéril em frasco de vidro autoclavado

RBL Cell Media

Descongelar o soro fetal bovino (FBS, armazenado a -20 ° C) por cerca de 4 horas em 37 &graus; C banho-maria Siga a técnica estéril padrão Retire 1 L mínimo de meio essencial (MEM) com L-glutamina (com Earle' s sais) Despeje um pouco de MEM para obter 800 ml de MEM, adicione 200 mL de FBS quente Adicione 1 ml de antibiótico sulfato de gentamicina a 1 L de meio com pipeta estéril Use apenas frascos de meio que tenham sido autoclavados e marcados apenas para uso em cultura de células.

Filtro estéril (0,2 mm) em frasco de vidro autoclavado

Material plástico usado:

200 µ l  Pontas de pipeta estéreis descartáveis com graduações em 96 rack

VWRp align="center">53509-009

polypropylene

1.000 µ l  Pontas de pipeta de aerossol estéreis com HighRecovery

VWRp align="center">89003-420

polietileno

10 µ l  micro ponta de baixa ligação estéril

VWRp align="center">14217-704

polypropylene

Tubos de microcentrífuga descartáveis/cónicos para alta força G

VWRp align="center">20170-038

polypropylene

Descartável/graduado/cônico/estéril 50 ml  tubos de centrífuga com tampas de rosca

VWRp align="center">21008-178

polypropylene

Descartável/graduado/cónico/estéril 15 ml  tubos de centrífuga com tampas de rosca

VWRp align="center">21008-103

polypropylene

CELLSTAR Balão T-25 tratado com cultura de tecidos com tampa de filtro

Greiner Bio One

690175

poliestireno

CELLSTAR Balão T-75 Tratado com Cultura de Tecidos com Tampa de Filtro

Greiner Bio One

658175

poliestireno

CELLSTAR 10 ml  Pipeta Sorológica Embalada em Papel/Plástico

Greiner Bio One

607180

poliestireno

CELLSTAR 2 ml  Pipeta Sorológica Embalada em Papel/Plástico

Greiner Bio One

710180

poliestireno

CELLSTAR 5 ml  Pipeta Sorológica Envolvida em Papel/Plástico

Greiner Bio One

606180

poliestireno

CELLSTAR 25 ml  Pipeta sorológica embrulhada em papel/plástico

Greiner Bio One

760180

poliestireno

1 cm cubetas

N/A

N/A

poliestireno

CELLSTAR, Microplaca de 96W, Tratamento para Cultura de Tecidos, Preto, com Tampa

Placa de 96 poços

Greiner Bio One

655086

poliestireno

Combitips

Eppendorf

022266501

Polipropileno/

polietileno

<<<<<<<<<<<<<<<<

Referências

  1. Naal, R., Tabb, J., Holowka, D., Baird, B. In situ measurement of degranulation as a biosensor based on RBL-2H3 mast cells. Biosens. Bioelectron. 20, 791-796 (2004).
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