Transplantes faciais em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Os embriões

Resumo

Uma técnica para o transplante "Extreme Anterior Domain" tecido facial entre embriões de Xenopus laevis foi desenvolvido. Tecidos podem ser movidos de um gene de expressão fundo em outra, permitindo o estudo das necessidades locais para o desenvolvimento craniofacial e sinalização para as interações entre as regiões faciais.

Resumo

Defeitos congênitos craniofaciais ocorrer em 1 em cada 700 nascidos vivos, mas etiologia raramente é conhecido devido à compreensão limitada do desenvolvimento craniofacial. Para identificar onde vias de sinalização e tecidos agir durante padronização do rosto em desenvolvimento, a técnica "transplante de face" foi desenvolvido em embriões de rã Xenopus laevis. Uma região de tecido facial presuntivo (o "extremo anterior Domain" (EAD)) é removido a partir de um embrião dador na fase tailbud, e transplantado para um embrião hospedeiro da mesma fase, a partir do qual a região equivalente foi removido. Isto pode ser usado para gerar uma cara quimérico onde o tecido do hospedeiro ou de doadores tem uma perda ou ganho de função no gene, e / ou inclui um rótulo linhagem. Após a cura, o resultado do desenvolvimento é monitorizada, e indica os papéis da via de sinalização dentro do doador ou tecidos hospedeiros circundantes. Xenopus é um modelo útil para o desenvolvimento de cara, tal como a região facial é grande e prontamente umccessible para micromanipulação. Muitos embriões podem ser analisadas, durante um curto período de tempo já que o desenvolvimento ocorre rapidamente. Constatações do sapo são relevantes para o desenvolvimento humano, uma vez que os processos craniofaciais aparecer conservadas entre Xenopus e mamíferos.

Introdução

Para entender os mecanismos subjacentes defeitos craniofaciais congênitos ^1-2, tecidos importantes e suas contribuições de sinalização durante o desenvolvimento craniofacial devem ser identificados. No sapo Xenopus laevis, parte do rosto, incluindo a boca e as narinas forma do "Extreme Anterior Domain" (EAD), onde ectoderma e endoderma estão diretamente justapostas ^3-4. A EAD também actua como um centro de sinalização para influenciar os tecidos circundantes, incluindo a crista neural craniano, que forma as mandíbulas e outras regiões da face ^5. Para identificar genes que contribuem para a função de EAD, uma técnica de "trans....

Protocolo

1. Reagentes Preparar

1. 10x MBS: Preparar 1 L de 10x Modificado solução ¹⁷ de Barth Saline (MBS). Consulte a Tabela 1, Reagentes, ingredientes e instruções. Use água destilada para todas as soluções. Misture em uma proveta, utilizando uma barra de agitação, até a dissolução completa. Todas as soluções devem ser feitas à temperatura ambiente.
2. 1x MBS: Diluir 100 ml da solução de MBS 10x em 900 ml de água destilada para fazer 1 L de 1x MBS. Adicionar 0,7 ml de 1 M de solução de CaCl _2.
3. 0.1x MBS: diluir 1x MBS para preparar 1 L de solução 0,5 x MBS e 2 L de 0,1 x MBS solução. Para 1 L de 0,1 x MBS soluçã....

Resultados

Tecido transplantado deve ser totalmente inserida na cabeça hospedeiro após o transplante, conforme mostrado na Figura 3A, e tem uma ponte de vidro apropriadamente colocado na face do embrião, como mostrado na Figura 2bc. O tecido do doador transplantadas devem ser corretamente dimensionado para a abertura de acolhimento, para o transplante seja bem sucedido. O tecido EAD não devem sobressair a partir da cabeça, de forma alguma, como pode ser visto nas Figuras 3B e

Discussão

Etapas críticas e limitações: O procedimento de transplante de rosto EAD é tempo e trabalho intensivo. Requer prática, mãos firmes, e destreza para aperfeiçoar. O protocolo de transplante de rosto depende da capacidade do pesquisador para remover de forma eficiente e tecidos para transplante. Se alguém leva muito tempo para inserir o transplante no rosto do anfitrião, o rosto de acolhimento começará a se contrair e curar. Pinça pode ser utilizado para expandir delicadamente a região facial. No entanto, se contraç.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pipeta Pasteur	VWR	14672-400	Vidro Lima
Tamanho 5 3/4 in	Pipeta de Transferência Graduada
	VWR	16001-180	Descartável
#5/45 fórceps	Fine Science Tools by Dupont medical	11251-35	Angled 45°
Fórceps Padrão	Fine Science Tools	11000-20	Reto; ponta serrilhada; tubulação capilar de aço inoxidável
(para agulhas)	FHC	30-30-1	Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fibra
Tampa de deslizamento	VWR	48393 252	24 x 60 mm  micro vidro de cobertura;
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F9378
	Sutter Instrument Co	Needle Puller: descontinuado Filamento: FB300B	O extrator de agulhas mais semelhante, atualmente disponível, é o P-97. Para filamentos, use filamentos de caixa quadrada Sutter de 3,00 mm, 3,0 mm de largura.
		modelo P-80	Flaming / Brown
Stereomicroscope	Zeiss
Stereomicroscope Lighting by Fostec	Fostec		Use uma caixa de luz com 2 braços de fibra óptica.
Suporte de Pino Niquelado	Fine Science Tools	26018-17	Diâmetro de Abertura da Mandíbula: 0-1 mm
Suporte de Pino Niquelado Moria	Fine Science Tools	26016-12	Diâmetro de abertura da mandíbula: 0-1 mm
Agulhas de Tungstênio	Fine Science Tools	10130-05	0.125 mm Diâmetro da haste
Van Aken Plastalina	Blick	#33268-2981
Argila de Modelagem- branco, vermelho, ou Kit mMessage mMashine
	Ambion	AM1340

com Plugue de AlgodãoExtrator de Agulhas Extrator de micropipetas SP6 ou T7 amarelo