Detectando, visualizar e quantificar a geração de espécies reativas de oxigênio em um modelo de sistema Amoeba

Summary

Nós adaptamos um conjunto de protocolos para a medição de espécies reativas de oxigênio (ROS) que podem ser aplicados em vários modelos celulares ameba e mamíferos para estudos qualitativos e quantitativos.

Abstract

Espécies reativas de oxigênio (ROS) compreendem uma gama de moléculas reativas e de curta duração contendo oxigênio, que são dinamicamente interconvertidos ou eliminados ou cataliticamente ou espontaneamente. Devido aos curtos períodos de vida da maioria ROS ea diversidade de suas fontes e localizações subcelulares, um quadro completo só pode ser obtida por meio de medições cuidadosas usando uma combinação de protocolos. Aqui, apresentamos um conjunto de três protocolos diferentes usando OxyBurst Green (OBG) revestida de contas, ou dihydroethidium (DHE) e Amplex Ultrared (AUR), para monitorar qualitativa e quantitativamente vários ROS em fagócitos profissionais, como Dictyostelium. Nós otimizamos os processos de revestimento contas e miçangas OBG revestidos usados ​​e microscopia ao vivo para visualizar dinamicamente intraphagosomal geração ROS no nível de uma única célula. Foram identificados lipopolissacarídeo (LPS) de E. coli como um potente estimulador para a geração de ROS em Dictyostelium. Além disso, nós dtempo real eveloped, ensaios de médio rendimento, utilizando DHE e AUR para medir quantitativamente superóxido intracelular e extracelular H ₂ O ₂ a produção, respectivamente.

Introduction

Espécies reativas de oxigênio (ROS) estão envolvidos em uma ampla variedade de processos biológicos, tais como a defesa do hospedeiro, a sinalização, o desenvolvimento do tecido e resposta à lesão, bem como hipertensão e câncer. O phagosomal NADPH oxidase máquinas bem estudado é dedicado a geração de ROS rápida, conhecida como a explosão oxidativa, para matar as bactérias ingeridas em phagosomes dos neutrófilos ^1. Além disso, o vazamento de elétrons como um subproduto da cadeia respiratória mitocondrial foi previamente pensado para ser responsável apenas por uma fonte não regulamentada de ROS. Mas, recentemente, foi identificado como um mecanismo importante para contribuir para a matança intraphagosomal de bactérias nos macrófagos do rato ^2. Nos últimos anos, a ameba social Dictyostelium, tornou-se um modelo poderoso e popular para o estudo de células mecanismos intrínsecos da resposta imune inata. De fato, Dictyostelium e fagócitos humanos partilham uma surpreendentemente alto nível de conservação em molecular máquinas responsáveis ​​por bactérias sentindo, imersão e matando ^3,4. Os homólogos de proteínas e enzimas relacionadas com a produção de ROS e toxinas, tais como oxidase de NADPH, catalases, superóxido dismutase, pode ser encontrado em humanos e Dictyostelium. À medida que a ameba melhor estudada, Dictyostelium apresenta várias vantagens únicas sobre sistema modelo de mamíferos. Eles crescer à temperatura ambiente, sem a necessidade de CO _2, com um tempo de duplicação de 8-10 horas. Eles podem ser facilmente mantidas como culturas aderentes ou em suspensão. Além disso, graças ao seu genoma haplóide completamente seqüenciado e anotado, e para a manipulação genética fácil, Dictyostelium tornou-se um modelo muito atraente organismo experimental.

Em estudos anteriores, vários derivados clorados e fluorados de fluoresceína (conhecidos coletivamente como OxyBurst verde, OBG) que emitem fluorescência após a oxidação por ROS, têm sido usados ​​como um repórter ROS. Cell-permeante esterified derivados são usados ​​para medir citoplasmática ROS, enquanto dextrano ou derivados acoplados à proteína de células-impermeabilizante são usados ​​para medir ROS extracelular. Em particular, grânulos de OBG-ASB revestidas já tiverem sido usadas para detectar a produção de ROS phagosomal em células de mamíferos ^5. No entanto, a abordagem baseada em leitor de microplacas só pode dar uma curva de geração de ROS em média de uma população de células. Com o presente protocolo, usando Dictyostelium, um dos fagócitos profissionais e condições experimentais otimizadas, obtemos fagocitose estável e eficiente, sem conjugar qualquer opsonina sobre as contas. DHE tem sido usada em vários sistemas de modelos, tais como os neutrófilos e macrófagos de mamífero, para detectar a produção de ROS ^6-9. Enquanto isso, existem algumas controvérsias sobre a especificidade e sensibilidade do método ^8,10. Como uma versão melhorada de Amplex Red, a intensidade de fluorescência de AUR é menos sensível ao pH, o que torna mais adequado para medirROS em ambientes não-neutras ou fracamente ácidas. AUR foi recentemente aplicado em vários sistemas de mamíferos ^11,12, mas a sua utilização em modelos não mamíferos, o que muitas vezes necessitam de meios de crescimento ligeiramente ácido, não tem sido relatado ainda. Além disso, não existe um protocolo publicado quantitativamente e dinamicamente medir a produção e localização ROS na ameba Dictyostelium sociais.

O objetivo do conjunto de protocolos apresentados é fornecer uma solução fácil e versátil para monitorar vários ROS e sua localização, e ainda dar insights sobre os mecanismos celulares relacionados com o ROS. Para o ensaio de OBG, usamos a microscopia ao vivo para acompanhar todo o processo de geração de ROS phagosomal após a captação de contas OBG revestidos por células Dictyostelium, e forneceu uma nova abordagem para estudar o mecanismo de matar intraphagosomal de bactérias. Nós otimizamos de médio rendimento DHE e AUR ensaios em Dictyostelium, para medir Superox intracelularide e H ₂ O ₂ extracelular produção, respectivamente, utilizando LPS como um potente estimulador de ROS. Observe que o LPS foi recentemente demonstrado que o aumento da actividade bactericida de Dictyostelium direcção bactérias ingeridas ^13. Além disso, o tratamento com DEDTC e catalase confirmado explicitamente que estes dois métodos de medir especificamente diferentes tipos e localizações subcelulares de ROS em Dictyostelium. Finalmente, o ensaio de OBG pode ser adaptado a qualquer célula fagocítica aderente, por opsonizantes ainda mais os grânulos com ligandos para receptores de células fagocíticas animais. Em princípio, os ensaios de DHE e AUR pode ser também para medições em qualquer célula aderente ou não aderente em condições experimentais apropriadas aperfeiçoá-lo.

Protocol

1. Visualização e medição qualitativa de ROS Produção em Fagossomos

As contas OBG revestidos deve ser preparado com antecedência. Os processos de revestimento miçangas e técnica agar são adaptados a partir de referências publicadas ^5,14.

1. Adicionar 1 ml de suspensão de 3,0 mM esferas de sílica carboxiladas (cerca de 1,8 x 10 ⁹ esferas) em um tubo de 1,5 ml, lavar as contas 3x com 1 ml de PBS por centrifugação rápida e centrifugação.
2. Ressuspender as pérolas em 1 ml de PBS contendo 25 mg / ml de cianamida (para activar as esferas de sílica carboxiladas para ligar covalentemente prelabeled BSA), incubar numa roda durante 15 min.
3. Lavar 3x com 1 ml de tampão de acoplamento (borato de sódio 0,1 M, pH 8,0) por centrifugação rápida (centrífuga à velocidade máxima de um tampo de mesa mini-centrifuga-se durante 5 segundos, ou, alternativamente, centrifugar a 2.000 g durante 1 min numa centrífuga de bancada) e vórtex para remover o excesso de cianamida.
4. Misturar os grânulos foram lavados com 500 mL de coupling tampão contendo 1 mg de verde OxyBurst (OBG) H2HFF (di-hidro-2 ', 4,5,6,7,7'-hexafluorofluorescein)-BSA, encher o tubo com gás azoto a partir de um padrão de gás pode antes de nivelamento, e incubar numa roda, durante 14 horas (durante a noite) à temperatura ambiente no escuro.
5. Lave as contas 2x com 1 ml de tampão de têmpera (250 mM de glicina em PBS) para remover não reagiu OBG, e duas vezes com tampão de acoplamento para remover o tampão de têmpera por centrifugação rápida e centrifugação.
6. Adicionar 1 ml de tampão de ligação contendo 50 ng de Alexa Fluor 594 éster de succinimidilo para conjugar a BSA. Encher o tubo com azoto antes de nivelamento, e incubar em uma roda durante 1,5 horas à temperatura ambiente no escuro.
7. Lave as contas 3x com 1 ml de tampão de têmpera por centrifugação rápida e vortex para parar a reacção, em seguida, lavar as contas 3x com 1 ml de PBS por centrifugação rápida e centrifugação.
8. Finalmente, voltar a suspender as pérolas em 1 ml de PBS com 2 mL de 10% w / v de azida para o armazenamento a longo prazo. Medir a concentration de grânulos em suspensão com um hemocitómetro (geralmente cerca de 1-2 x 10 ⁹ contas / ml), encher o tubo com azoto antes de nivelamento, e armazenar a 4 ° C no escuro.
9. A eficiência do revestimento da fluoresceína OBG pode ser testada, verificando o espectro de emissão com excitação a 500 nm. Quando oxidado por H ₂ O ₂ na presença de peroxidase de rábano (HRP), a intensidade de fluorescência de grânulos oxidadas, no pico de emissão (538 nm), é de 11-12x maior que a dos grânulos revestidos não oxidados.
10. Colheita crescimento exponencial células Dictyostelium de um prato 10 centímetros Petri, placa diferentes densidades de células em três centímetros pratos com um plástico opticamente transparente ou com fundo de vidro, e cultivá-las durante a noite. Escolha os pratos que são cerca de 80% confluentes para o experimento. Um protocolo detalhado para o cultivo de células de Dictyostelium foi publicada em ^{15 de.}
11. Substituir o meio de cultura com meio loflo (médio LF), incubar2 horas antes da experiência, a fim de diminuir a autofluorescência extracelular e intraendosomal do meio de cultura HL5C.
12. Em paralelo, o material fundido 10 ml de 1,5% de agar bacto em meio LF, verter o agar sobre uma superfície plana (isto é, uma placa de vidro de 10 cm x 10 cm), a fim de formar uma camada de agar de cerca de 1 mm de espessura, para esperar 10-15 min a solidificar. Cortar a camada de agar em 2 cm x 2 centímetros quadrados e coloque no meio LF para uso posterior.
13. Enquanto isso, prepare a fiação de disco ou grande microscópio de campo, definir a temperatura da câmara ambiental a 22 ° C e ajustar as configurações para este experimento. (Veja os comentários adicionais na discussão).
14. Após 2 horas de incubação, aspirar o meio LF a partir dos 3 cm de disco, mas a monocamada de células deve ainda ser coberto por uma fina película de meio. Dilui-se os grânulos revestidos a 1,5 x 10 ⁷ esferas / ml, e adicionar 10 ul para a camada de células.
15. Pegue uma folha de agar quadrado, drenar o excesso de líquido, mas manter molhado. Com cuidado, coloque ªe agar quadrados no topo da camada de células. Não mova o quadrado agar quando se está deitado sobre as células. O agar é utilizado para aumentar o contato entre esferas e células, melhorando assim a absorção, e também ligeiramente comprime as células, mantendo-as melhor no plano focal da objetiva.
16. Coloque a tampa sobre o prato, coloque-o no palco microscópio e, automaticamente, tirar fotos nos canais vermelho, verde e fase a cada 1 min de 2 horas ou mais.
17. Selecione e focar em eventos celulares que contêm todo o processo de fagocitose. Mesclar os 3 canais otimizados e montar as imagens em um filme usando o software de processamento de imagem profissional. Quantificar intensidades de fluorescência de cada contas selecionadas em canais vermelho e verde, ea proporção de verde / vermelho vai refletir a dinâmica phagosomal produção ROS das células.

2. Medição quantitativa e Média taxa de transferência de superóxido intracelular Produção

1. Coletar one 80% confluentes prato de Dictyostelium, em 10 ml de meio HL5C. Células Centrífuga Dictyostelium a 850 xg durante 5 min, com cuidado e o excesso de meio completamente aspirado. Ressuspender as células em tampão SS6.4 [0,12 M de sorbitol em tampão de Sorensen (14,69 mM de KH ₂ PO _4, e 6,27 mM de Na ₂ HPO _4), pH 6,4], contagem de células e diluir para uma densidade final de 6 x 10 ⁶ células / ml (ver comentários adicionais na discussão).
2. Adicionar 50 ul de suspensão celular em cada poço de uma branca não transparente placa de 96 poços (ver comentários adicionais na discussão).
3. Diluir estoque DHE (30 mM em DMSO) a 500 vezes com SS6.4, pipeta 50 ul de DHE diluída para cada poço utilizando uma pipeta de canais múltiplos, se necessário. A concentração final da DHE é de 30 uM. A reacção inicia-se imediatamente.
4. Estímulos ou inibidores podem ser adicionados neste momento, ou em outros pontos de tempo de acordo com as necessidades específicas.
5. Use o ponto de "leitura & # top final34, Modo de um leitor de microplacas de fluorescência, fluorescência com excitação / emissão a 522 nm/605 nm, ler todos os 2 minutos durante 1 hora, a vibração da média de 5 segundos / min, a 22 ° C.

3. Quantitativa e High Throughput Medição de Extracelular H ₂ O ₂ Produção

1. Siga os mesmos passos descritos em 2.1 e 2.2.
2. Prepare HRP diluída pela adição de 5 ul de estoque de HRP (100 U / ml em água destilada) em 10 ml de SS6.4, vórtice ou inverter o tubo para misturar bem e manter em gelo para posterior utilização. A solução HRP diluída é de 0,05 U / ml.
3. Preparar a mistura de reacção por mistura de AUR o estoque AUR (AUR 10 mM em DMSO) e a solução diluída em tampão HRP SS6.4 para as concentrações finais de 6,25 jiM, e 0,005 U / ml, respectivamente. Como um exemplo, para preparar a mistura de reacção para 40 reacções, misturar 1,600 mL de SS6.4 com 400 ul de HRP e diluída com 2,5 ml de solução de estoque AUR.
4. Adicionar 50 ul de mistura AURtura em cada poço utilizando uma pipeta de canais múltiplos, se necessário. Agora, a reacção começa.
5. Estímulos ou inibidores podem ser adicionados neste momento, ou em outros pontos de tempo de acordo com as necessidades específicas.
6. Use o ponto de modo final "top leitura" de uma micro leitor de placas de fluorescência, com fluorescência excitação / emissão a 530 nm nm/590, leia cada 2 minutos para 1 hora, a vibração da média 5 seg / min, a 22 ° C.

Results

A geração de ROS em phagosomes pode ser visualizada qualitativamente e dinamicamente por microscopia (S1 do ficheiro). A fluorescência vermelha emitida pela Alexa fluor 594 é insensível pH e mantém-se constante no ambiente phagosomal, enquanto que a oxidação de OBG aumenta a fluorescência no canal verde. O espectro de emissão de ensaios in vitro e oxidado OBG grânulos revestidos não oxidados são comparados na Figura 1B, que mostra um aumento significativo da intensidad...

Discussion

Em comparação com os métodos anteriormente descritos, o ensaio de OBG visualiza dinamicamente o processo de geração de ROS phagosomal ao nível da célula individual, em vez de medir o sinal médio ROS a partir de uma população de células. Tais métodos população de amostragem tendem a obscurecer a informação crítica causada por fagocitose não-sincrónico. Nós adaptado com sucesso DHE e AUR ensaios para Dictyostelium e otimizados os protocolos. Mais importante, nós especificados os tipos e localizações subcelulares ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
OxyBURST Green H2HFF BSA	Invitrogen	O-13291
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-20004
Contas de sílica carboxilada	Kisker Biotech	PSi-3.0COOH
HL5C médio	para médio	HLC0102
meio LoFlo	para médio	LF1001
Bacto ágar	BD	204010
Dihidroetídio	Sigma	37291-25MG
Amplex UltraRed	Invitrogen	A36006
Peroxidase de rábano	Roche	10108090001
Dietilditiocarbamato (DEDTC)	Sigma	D3506-100G
Catalase	Sigma	C9322-1G
Cyanamide	Sigma	187364-25G
Lipopolissacarídeos	Sigma	L2630-25G
EQUIPMENT
ibidi μ-Dish 35 mm, high	ibidi	81156	Fundo feito de plástico opticamente transparente
Prato MatTek 35 mm	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C	Fundo feito de um lamínula de vidro
Scepter Cell Counter	Merck Millipore	PHCC00000
Placa branca de 96 poços	Nunc	236108
Centrifuge	SORVALL	Legend RT
Leitor de microplacas	BioTek	Synergy Mx