Um ensaio de exonuclease baseado em fluorescência para caracterizar DmWRNexo, ortólogo da exonuclease WRN progeróide humana e sua aplicação a outras nucleases

Resumo

As exonucleases desempenham papéis críticos na garantia da estabilidade do genoma. A perda da função da exonuclease WRN resulta em envelhecimento prematuro. O estudo de substratos e outros requisitos da nuclease in vitro pode ajudar a elucidar seu papel in vivo. Aqui demonstramos um ensaio rápido e reprodutível baseado em fluorescência para medir sua atividade de nuclease.

Resumo

WRN exonuclease está envolvida na resolução de danos ao DNA que ocorrem durante a replicação do DNA ou após a exposição a genotoxinas endógenas ou exógenas. É provável que desempenhe um papel na prevenção do acúmulo de intermediários recombinogênicos que, de outra forma, se acumulariam em garfos de replicação transitoriamente paralisados, consistente com um fenótipo hiper-recombinante de células sem WRN. Em humanos, o domínio exonuclease compreende uma porção N-terminal de uma proteína muito maior que também possui atividade helicase, juntamente com locais adicionais importantes para a interação DNA e proteína. Em contraste, em Drosophila, a atividade da exonuclease do WRN (DmWRNexo) é codificada por um locus genético distinto da helicase presuntiva, permitindo a dissecação bioquímica (e genética) do papel da atividade da exonuclease nos mecanismos de estabilidade do genoma. Aqui, demonstramos um método fluorescente para determinar a atividade da exonuclease WRN usando DmWRNexo recombinante purificado e oligonucleotídeos fluorescentes marcados com extremidade. Este sistema permite maior reprodutibilidade do que os ensaios radioativos, pois os oligonucleotídeos do substrato permanecem estáveis por meses e fornece um método mais seguro e relativamente rápido para análise detalhada da atividade da nuclease, permitindo a determinação da polaridade, processividade e preferências de substrato da nuclease.

Introdução

As nucleases desempenham um papel vital nas células na remoção de DNA danificado, resolvendo estruturas não duplex, como junções de Holliday, e fornecendo capacidade de revisão durante a replicação do DNA, tanto intrínseca às DNA polimerases quanto extrínseca a elas¹. As nucleases podem atuar degradando sequencialmente o DNA de extremidades livres (exonucleases) ou clivando ligações fosfodiéster internas dentro de uma molécula de DNA mais longa (endonucleases). A perda da atividade da nuclease pode resultar em fenótipos de instabilidade do genoma altamente específicos. Enquanto a mutação do BLM, membro da família RecQ helicase, resulta em taxas excessivamen....

Protocolo

1. Preparação de Oligonucleotídeos de Substrato

1. Sintetize oligonucleotídeos personalizados.
   1. Projete um oligonucleotídeo de fita simples com uma molécula de fluoresceína conjugada com 5'; esta será a espinha dorsal de cada substrato. (Observe que isso é para uma exonuclease de 3'-5'; para uma exonuclease de polaridade 5'-3', use uma fita de backbone conjugada com 3'). Se a polaridade não for conhecida, 3' e 5' devem ser testados.
   2. Projete fitas complementares de modo que, quando recozidas no oligonucleotídeo marcado com fluorescência, o(s) substrato(s) duplex de escolha sejam formados. Observe que a fita complementar não

Resultados

Realizar a análise in vitro de atividade exonucleásica exige diversos passos preparatórios além da análise propriamente dita. Um resumo dos procedimentos é mostrado na Figura 1.

Antes de realizar ensaios de exonuclease baseados em fluorescência, é fundamental otimizar a detecção do substrato oligonucleotídico marcado fluorescentemente após a separação em géis de uréia-acrilamida, utilizando um sistema de imagem fluorescente apropriado. A escolha do filtro é extremamen.......

Discussão

A determinação da atividade da exonuclease de proteínas purificadas requer a análise dos produtos de clivagem do DNA. A clivagem sequencial do DNA por exonucleases pode ser visualizada pela separação de produtos de clivagem marcados em géis de acrilamida. Historicamente, isso envolvia a marcação final do substrato de DNA com um radiomarcador (por exemplo, ³²P ou ³⁵S), mas com as desvantagens inerentes ao uso do radiomarcador (custo, questões de segurança e instabilidade ao longo do tempo). .......

Materiais

Equipment

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagent/Material
Oligonucleotídeos personalizados	Eurogentec		É necessário obtê-los em alta pureza por exemplo com purificação PAGE.
		5'FLO	fluoresesceína-5' GAACTATGGCTCTC GAGTGCTAGGACATGTCTGA CTACGTACAAGTCACC - 3'bubble
			5'- GGTGACTTGTACGT AGTCAGACATGTCCTAGCAC TCGAGAGCCATAGTTC-3'40
% 19:1 Solução de acrilamida	Severn Biotech	20-2400-05	CUIDADO: neurotoxina potente, portanto, luvas devem ser usadas o tempo todo
Colunas His-Trap (1 ml)	GE Healthcare	17-5247-01
Todos os outros reagentes	qualquer fornecedor		Grau de biologia molecular é necessário (livre de DNase); tubos de microcentrífugas da mesma forma devem ser livres de DNase e RNase<
Leitor	Fuji
V2.02	FujiFilm
Image Gauge V3.3	FujiFilm

respeitável td colspan="4">Hoefer SE400 aparelho de gel Hoefer SE400-15-1.5 FLA-3000 (fósforo e fluorescência de imagens