Um ensaio de exonuclease baseado em fluorescência para caracterizar DmWRNexo, ortólogo da exonuclease WRN progeróide humana e sua aplicação a outras nucleases

Resumo

As exonucleases desempenham papéis críticos na garantia da estabilidade do genoma. A perda da função da exonuclease WRN resulta em envelhecimento prematuro. O estudo de substratos e outros requisitos da nuclease in vitro pode ajudar a elucidar seu papel in vivo. Aqui demonstramos um ensaio rápido e reprodutível baseado em fluorescência para medir sua atividade de nuclease.

Resumo

WRN exonuclease está envolvida na resolução de danos ao DNA que ocorrem durante a replicação do DNA ou após a exposição a genotoxinas endógenas ou exógenas. É provável que desempenhe um papel na prevenção do acúmulo de intermediários recombinogênicos que, de outra forma, se acumulariam em garfos de replicação transitoriamente paralisados, consistente com um fenótipo hiper-recombinante de células sem WRN. Em humanos, o domínio exonuclease compreende uma porção N-terminal de uma proteína muito maior que também possui atividade helicase, juntamente com locais adicionais importantes para a interação DNA e proteína. Em contraste, em Drosophila, a atividade da exonuclease do WRN (DmWRNexo) é codificada por um locus genético distinto da helicase presuntiva, permitindo a dissecação bioquímica (e genética) do papel da atividade da exonuclease nos mecanismos de estabilidade do genoma. Aqui, demonstramos um método fluorescente para determinar a atividade da exonuclease WRN usando DmWRNexo recombinante purificado e oligonucleotídeos fluorescentes marcados com extremidade. Este sistema permite maior reprodutibilidade do que os ensaios radioativos, pois os oligonucleotídeos do substrato permanecem estáveis por meses e fornece um método mais seguro e relativamente rápido para análise detalhada da atividade da nuclease, permitindo a determinação da polaridade, processividade e preferências de substrato da nuclease.

Introdução

As nucleases desempenham um papel vital nas células na remoção de DNA danificado, resolvendo estruturas não duplex, como junções de Holliday, e fornecendo capacidade de revisão durante a replicação do DNA, tanto intrínseca às DNA polimerases quanto extrínseca a elas¹. As nucleases podem atuar degradando sequencialmente o DNA de extremidades livres (exonucleases) ou clivando ligações fosfodiéster internas dentro de uma molécula de DNA mais longa (endonucleases). A perda da atividade da nuclease pode resultar em fenótipos de instabilidade do genoma altamente específicos. Enquanto a mutação do BLM, membro da família RecQ helicase, resulta em taxas excessivamente altas de troca de cromátides irmãs e taxas de câncer globalmente elevadas (revisado por Payne e Hickson²), a mutação da proteína WRN altamente relacionada leva ao envelhecimento prematuro³; a principal diferença significativa entre esses dois membros da família é a presença de um domínio de exonuclease 3'-5' com WRN⁴. Evidências de um papel crítico da exonuclease WRN na manutenção da estabilidade do genoma se acumularam a partir da análise de genótipos em pacientes com WS⁵, juntamente com estudos de mutação pontual e deleção em células humanas, apoiados por estudos cristalográficos do domínio isolado da exonuclease⁶. No entanto, a cooperação e a conversa cruzada entre a atividade de exonuclease do WRN e sua atividade de helicase central⁷ tornam difícil separar a funcionalidade de cada um e suas contribuições relativas para a estabilidade do genoma. Em plantas e animais metazoários inferiores, a atividade da exonuclease WRN está presente em um único polipeptídeo sem atividade helicase^8-10 (revisado em Cox e Boubriak¹¹); foi demonstrado bioquimicamente em Arabidopsis que esta exonuclease atua de forma coordenada com o cognato WRN helicase, reconstituindo efetivamente as atividades enzimáticas combinadas observadas no vertebrado WRN⁹. Estudamos a exonuclease WRN em Drosophila, uma vez que as excelentes ferramentas genéticas permitem a análise do impacto da mutação da exonuclease (sem impactar na helicase cognata presuntiva) em todo o nível do organismo e ao longo do desenvolvimento^10,12. Além disso, clonamos, expressamos e purificamos a exonuclease recombinante Drosophila WRN (DmWRNexo), permitindo uma análise bioquímica completa de suas propriedades enzimáticas^13,14.

A análise de nuclease in vitro tem sido tradicionalmente conduzida usando oligonucleotídeos radiomarcados, avaliando a degradação procurando a escada de produtos em géis de acrilamida^4,8,15. Embora sensíveis, esses ensaios não são quantitativamente reprodutíveis no dia-a-dia devido ao decaimento radioativo dos substratos marcados. Além disso, o manuseio e o descarte de reagentes radioativos representam problemas ambientais e de saúde significativos; O fornecimento de radiomarcadores também está se tornando cada vez mais problemático. Um método alternativo recente avalia a quantidade do produto final de degradação por espectrometria de massa¹⁶. No entanto, é demorado (leva vários dias), requer equipamento especializado e a leitura é a quantidade de produto final (nucleotídeo único), portanto, não é adequado para medição sensível de aspectos como processividade enzimática ou para determinar se alguns nucleotídeos, sequências ou modificações levam à pausa ou parada da nuclease. Para superar esses problemas, adaptamos os ensaios tradicionais baseados em gel para uso com substratos de oligonucleotídeos fluorescentes, gerando substratos marcados de forma estável que podem ser usados de forma reprodutível por longos períodos de tempo e, assim, permitir a comparação direta das atividades da nuclease sob diferentes condições.

Protocolo

1. Preparação de Oligonucleotídeos de Substrato

1. Sintetize oligonucleotídeos personalizados.
   1. Projete um oligonucleotídeo de fita simples com uma molécula de fluoresceína conjugada com 5'; esta será a espinha dorsal de cada substrato. (Observe que isso é para uma exonuclease de 3'-5'; para uma exonuclease de polaridade 5'-3', use uma fita de backbone conjugada com 3'). Se a polaridade não for conhecida, 3' e 5' devem ser testados.
   2. Projete fitas complementares de modo que, quando recozidas no oligonucleotídeo marcado com fluorescência, o(s) substrato(s) duplex de escolha sejam formados. Observe que a fita complementar não é conjugada a um fluoróforo. Ao fazer o pedido, especifique a purificação PAGE (a dessalinização não é suficiente).
   3. Armazene estoques de oligonucleotídeos tamponados em 10 mM a 1 nmol/μl a -20 °C e no escuro.
2. Misture o oligonucleotídeo marcado com espinha dorsal com cada oligonucleotídeo complementar não marcado em uma proporção molar de 1:1,2 de marcado: não marcado em tampão (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM EDTA pH 8,0, 50 mM NaCl). (Nota: uma proporção de 1:1 é mais desejável, mas é mais importante que TODA a fita rotulada esteja ligada. Proporções de 1:1 - 1:1,5 podem funcionar.)
3. Aqueça um banho-maria ou bloco de calor a 95 ° C e coloque a mistura de recozimento por 3 min e, em seguida, desligue e deixe o conjunto esfriar lentamente (1 ° C / min) até abaixo de 30 ° C.
4. Verifique o recozimento completo do oligonucleotídeo marcado executando o substrato duplex resultante em um gel nativo de poliacrilamida a 10% (10% de acrilamida 19:1: bis-acrilamida em 1x Tris-borato-EDTA (TBE, 89 mM de base Tris, 89 mM de ácido bórico, 2 mM de EDTA) polimerizado com 0,05% p/v de persulfato de amônio (APS) e 0,005% v/v TEMED). Visualize via PhosphorImager (consulte a seção 5 abaixo).

2. Preparação de géis de acrilamida

1. Configure o sistema de fundição de gel, por exemplo, o equipamento de gel Hoefer SE400 com placas de 16 cm x 18 cm e espaçadores de 1,5 mm.
   1. Limpe bem as placas e espaçadores de vidro com detergente e água. Use luvas limpas para evitar sujar novamente as placas com óleo dos dedos, o que dificultaria a formação consistente de gel.
   2. Enxágue as placas com bastante água destilada (deionizada) para remover os resíduos de detergente e, em seguida, limpe com um lenço de papel sem fiapos (por exemplo, Kimwipes).
   3. Finalmente, borrife com etanol 70% e limpe - as placas de vidro devem ranger se estiverem limpas. Reserve na vertical para permitir que o resto do etanol evapore.
   4. Limpe o resto do equipamento de formação de gel com água destilada (use detergente primeiro, se necessário) e seque.
   5. Monte as placas de vidro e espaçadores no equipamento de formação de gel, certificando-se de que o sistema seja à prova de vazamentos.
2. Prepare a solução de gel para a porcentagem de poliacrilamida desejada
   1. Para o ensaio de nuclease, use géis de poliacrilamida a 14% desnaturantes com ureia 8 M em 1x TBE.
   2. Para fazer 100 ml (o suficiente para 2 géis com bastante excesso para vazamento) tome 48,05 g de uréia em um copo largo e adicione 35 ml de solução de acrilamida 19:1 a 40% e 10 ml de TBE 10x (890 mM Tris, 890 mM de ácido bórico, 20 mM de EDTA, pH 8,3 com NaOH). CUIDADO: Use luvas - a acrilamida é uma neurotoxina potente. Dissolva a ureia usando uma barra de agitação e uma placa de agitação magnética (isso levará algum tempo).
   3. Quando dissolvido, adicione água miliQ-deionizada a 100 ml. Filtre e esterilize usando uma membrana de 0,22 μm. Se não for usado imediatamente, desgaseifice brevemente usando equipamento de sucção e guarde no escuro (durará alguns dias). Não leve à geladeira, pois a uréia precipitará.
3. Polimerizar e moldar o gel.
   1. Pegue a ureia-acrilamida e adicione 0,5 ml de persulfato de amônio a 10% (p / v) (APS, feito em água destilada) e 50 μl de TEMED. Agite o recipiente lentamente para misturar sem transmitir ar (o que inibirá a polimerização) e despeje no formador de gel. Aja rapidamente ou o gel pode endurecer antes que o vazamento termine.
   2. Adicione o pente apropriado para formar poços para carregamento de amostras (escolhido de acordo com o equipamento de gel e o número de amostras a serem analisados, por exemplo, pentes de 15 ou 29 dentes são adequados para uso com o equipamento de gel Hoefer). Verifique se não são introduzidas bolhas de ar sob os dentes do pente.
   3. Deixe definir. Monitore vazamentos. A polimerização completa é retardada nos favos devido ao contato com a atmosfera. Quando os poços estiverem firmes, o restante do gel será endurecido.
   4. Remova os pentes e enxágue a acrilamida não polimerizada usando água e uma pipeta.
4. Configure o gel para correr.
   1. Coloque o gel fundido no sistema de funcionamento de gel e adicione a quantidade apropriada de 1x tampão de funcionamento TBE na câmara inferior e nos poços de gel. O gel agora está pronto para ser carregado.

3. Preparação da proteína DmWRNexo recombinante marcada com His

1. Expressão bacteriana da proteína DmWRNexo
   1. Usando um loop de inoculação, colete bactérias raspando a superfície dos estoques de glicerol mantidos a -80 ° C (as bactérias são E. coli T7 Iq LysY (NEB) transformadas com pIVEX2.3d-DmWRNexo). Riscar em placas de ágar LB (10 g de triptona, 5 g de extracto de levedura, 5 g de NaCl, 15 g de ágar perfeito até 1 L com água destilada e pH ajustado para 7,4) com 50 μg/ml de ampicilina. Incubar invertido durante a noite a 37 °C.
   2. Escolha uma única colônia da placa em 50 ml LB (10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl até 1 L com água destilada) suplementada com 50 μg / ml de ampicilina (feita em água e esterilizada por filtro a 0,22 μm). Crescer com agitação a 220 rpm 37 °C durante a noite.
   3. Inocular 1,8 L (alíquotas de 600 ml cada em três frascos cónicos de 2 L para assegurar uma arejamento adequada) de LB-ampicilina com a cultura de 50 ml durante a noite e aumentar até OD₆₀₀ ~ 0,8. Adicione IPTG a uma concentração final de 0,7 mM e incube a 26 ° C (para evitar a agregação de proteínas) com agitação por 4-8 horas.
   4. Colha o pellet celular por centrifugação a 8.000 rpm 4 °C por 10 min - use 6 frascos de centrífuga de plástico estéril de 500 ml com suspensão de células de 300 ml em cada um. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um pequeno volume (10 ml) do LB-amp original, transfira para um tubo Falcon de 15 ml e depois gire novamente a 5.000 rpm para granular as células - remova o sobrenadante novamente e congele a -80 ° C (isso ajuda na lise).
2. Lise celular bacteriana
   1. Completar 3,2 ml de tampão de lise contendo 1 ml de NaCl 5 M, 1 ml de DTT 1 M, 200 μl de benzamidina 1 M e 1 ml de lisozima 10 mg/ml (ressuspensa em água destilada).
   2. A cada pellet derivado de 300 ml de suspensão bacteriana, adicionar 320 μl de tampão de lise. Ressuspenda o máximo possível - use uma ponta p1000 'serrada' e mexa, bem como pipetando para cima e para baixo. Incubar no gelo 20 min. Adicione mais 100 μl de tampão de lise e misture bem, depois transfira o máximo possível do lisado ressuspenso para um tubo de microcentrífuga (será muito viscoso e difícil de pipetar).
   3. Centrifugar o lisado a 14.000 rpm num rotor de microcentrífugas pré-arrefecido a 4 °C durante 30 min e, em seguida, levar o sobrenadante para um tubo de microcentrífugas limpo: este contém a proteína recombinante.
3. Purificação da armadilha Dele
   1. Preparação de reagentes: Rotular 5 tubos de microcentrífugas para cada uma das seguintes concentrações de imidazol: 40 mM, 60 mM, 100 mM, 300 mM e 500 mM (por exemplo, rótulo 40-1, 40-2, 40-3, etc.), que serão usados para coletar as frações da coluna. Guarde os tubos no gelo em uma prateleira com as tampas abertas (mas cubra frouxamente com filme plástico ou similar para mantê-los limpos enquanto prepara todo o resto). Completar 25 ml de 20 mM de imidazol e 10 ml de estoques de cada uma das outras concentrações de imidazol em tubos universais de 25 ml, utilizando 1x PBS (8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄, 0,24 g de KH₂PO₄, pH ajustado para 7,4 e perfeito até 1 l com água destilada) como diluente.
   2. Ajustar o lisado bacteriano para 20 mM de imidazol utilizando um volume adequado de 2 M de solução-mãe de imidazol e ajustar o volume para pelo menos 1 ml (<5 ml) utilizando 20 mM de imidazol.
   3. Lave uma coluna His-Trap de 1 ml (Amersham) com 10 ml de água MilliQ usando uma seringa de 5 ou 10 ml com Luer lock e pressão manual suave e, em seguida, equilibre a coluna passando por 10 ml de imidazol 20 mM composto em PBS (consulte a etapa 3.3.1 acima).
   4. Carregue o lisado na coluna. À medida que o lisado é carregado na coluna, pode ocorrer contrapressão significativa; Isso é perfeitamente normal. Não fique tentado a aplicar muita força na seringa e mantenha uma pressão constante e uniforme. É comum ver uma leve mudança de cor à medida que o lisado entra na coluna. Colete o fluxo em uma garrafa de Sterilin bijou (capacidade de 7 ml) e guarde no gelo.
   5. Lavar a coluna com 10 ml de imidazol 20 mM e recolhê-lo num tubo universal de 25 ml sobre gelo, rotulado como «lavagem».
   6. Passe 5 ml de imidazol 40 mM pela coluna, coletando frações de 1 ml em cada um dos tubos de microcentrífuga (rotulados como 40.1, 40.2, 40.3, etc.): observe cuidadosamente o êmbolo da seringa, pois isso permite a medição de 1 ml.
   7. Agora passe sequencialmente por 5 ml de cada um dos 60 mM, 100 mM, 300 mM e 500 mM de imidazol, coletando novamente 5 frações de 1 ml em cada concentração de sal.
4. Análise de frações de coluna
   1. Dot blot: Dot 2 μl de cada fração da coluna (e também carregar, fluir e lavar) em uma folha de nitrocelulose - é mais fácil se isso for descartado com uma grade usando um lápis macio). Deixe secar ao ar. Processe o dot blot bloqueando por 15 min a 1 hora a temperatura ambiente em leite em pó desnatado a 5% feito em PBS com 0,2% v / v Tween 20, depois lave em PBS-Tween várias vezes e incube com anticorpo HRP-anti-his diluído 1:500 em PBS-Tween por 30-60 min. Lave extensivamente com PBS-Tween e depois PBS e detecte anticorpos ligados usando quimioluminescência aprimorada (ECL), visualizada no Hyperfilm MP. Este dot blot dá uma excelente ideia das frações de pico antes da análise SDS-PAGE e pode informar as etapas de purificação subsequentes, se necessário (por exemplo, se a estabilidade da proteína for um problema, é possível agrupar frações de pico com base nos resultados do dot blot e carregar diretamente nas colunas de filtração de gel - consulte a etapa 3.5 abaixo).
   2. SDS-PAGE: Colete 50 μl de cada fração da coluna em um tubo de microcentrífuga rotulado contendo 50 μl de corantes de carregamento 2x SDS-PAGE (4% p / v SDS, 20% v / v glicerol, 120 mM Tris-HCl pH 6,8 com 200 mM DTT). Ferva essas amostras por 5 min a 95-100 ° C (observe se estiver usando um bloco quente sem tampa aquecida, faça um pequeno orifício na tampa de cada tubo com uma agulha de seringa de calibre estreito para evitar que os tubos 'explodam' à medida que aquecem). Execute minigéis SDS-PAGE a 10% carregando 10 μl de cada fração de coluna e core com azul brilhante de Coomassie para verificar as frações de pico e % de pureza da proteína. Se necessário, também é possível fazer western blot para proteína marcada com his transferindo proteínas separadas por SDS-PAGE para nitrocelulose; bloqueie as membranas com 5% de leite desnatado em PBS-0,2% Tween 20, depois lave e sonde com anticorpo anti-his conjugado com HRP (1:500) quanto ao dot blot.
5. Para aumentar a pureza, as frações de pico da coluna his-trap podem ser agrupadas e carregadas em uma coluna de filtração de gel Superdex 75 com eluição em sal crescente (conforme descrito anteriormente Boubriak et al.¹³ e Mason et al. ¹⁴).

4. Ensaio de nuclease

1. Faça estoques de substratos de trabalho.
   1. Use 20 substratos de pmol por reação (embora isso possa variar de acordo com a questão a ser abordada) para que um material de trabalho conveniente seja de 200 pmol / μl (ou seja, 10x). Os estoques de giro são constituídos em pequenos volumes de tampão de recozimento (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM EDTA pH 8,0, 50 mM NaCl) ou em 10 mM Tris-HCl pH 7,0 (até pH 8,5, de acordo com a nuclease) sem sal ou EDTA, de acordo com a sensibilidade enzimática ou ensaio a ser realizado.
   2. Conservar a 4 °C e no escuro (embrulhado em papel alumínio). Os substratos duram muitas semanas sem perda de integridade duplex ou de sinal fluorescente.
2. Ensaio de concentração de proteína exonuclease por análise colorimétrica ou espectrometria UV em Abs₂₆₀.
   1. Conservar em alíquotas pequenas a -80 °C.
   2. Se as amostras forem congeladas/descongeladas uma vez, assuma uma taxa de dobramento incorreto de proteína de 5% (ou defina empiricamente para cada proteína a ser analisada) e ajuste as concentrações de acordo.
   3. Descarte as proteínas para o ensaio da atividade da exonuclease após dois ciclos de congelamento / descongelamento e observe o status da proteína para cada experimento.
3. Projete, experimente e calcule as quantidades de master mix (MM) para amostras.
   1. Faça um MM contendo todos os componentes comuns às amostras que estão sendo testadas (geralmente tudo, exceto a enzima ou substrato) para diminuir a variação entre amostras.
   2. Permita o erro de pipetagem ao fazer o MM, por exemplo, calcule volumes para N amostras fazendo o suficiente para (N + 0,1N) amostras.
   3. Configure reações em um volume total de 20 μl / amostra, contendo 1 pmol de enzima e 20 pmol de substrato (como padrão antes da otimização - obviamente, as quantidades variam de acordo com o que está sendo testado, por exemplo, alterar a quantidade de enzima se testar o efeito da concentração da enzima). Para DmWRNexo, o tampão ideal para a atividade da nuclease foi encontrado empiricamente para conter 40 mM Tris-HCl pH 8,0, 4 mM MgCl₂, 5 mM ditiotreitol, com 0,1 mg / ml de BSA de grau de biologia molecular.
4. Configure reações.
   1. Mantenha todos os reagentes a 4 °C (balde de gelo ou criorack).
   2. Completar a mistura principal e a alíquota para o número adequado de tubos de microcentrífugas estéreis de 0,5 ml isentos de DNase. Inclua um controle sem enzima para visualizar o substrato inicial (controle não degradado).
   3. Defina um bloco de calor para a temperatura apropriada para a atividade enzimática (37 ° C, com um ponto de tempo final de 30 min foi ideal para DmWRNexo, embora isso possa precisar ser determinado empiricamente comparando a atividade da enzima escolhida em uma faixa de temperaturas e tempos). Os potenciais inibidores enzimáticos comumente presentes nos tampões devem ser cuidadosamente testados (por exemplo, o EDTA inibe o DmWRNexo, assim como o excesso de ATP¹⁴, presumivelmente por quelação do Mg²⁺ crítico para a atividade da nuclease). Observe que mesmo altas concentrações de imidazol (>300 mM) não têm impacto na atividade da enzima DmWRNexo nem extinguem a fluorescência.
   4. Solução de maquiagem STOP (80% formamida, 1x TBE). Isso é em 3x. Isso pode conter corantes como azul de bromofenol, se necessário. Armazene na RT.
   5. Instale o seguinte próximo ao bloco de calor: o(s) reagente(s) final(is) a ser(em) adicionado(s) à mistura de reação (geralmente enzima); um pipetador e pontas de 1-10 μl, um temporizador, criorack ou balde de gelo e solução STOP.
5. Inicie a reação.
   1. Defina o cronômetro para adicionar enzima ao primeiro tubo. Coloque o tubo no bloco de calor.
   2. Continue adicionando enzima ao resto dos tubos em intervalos apropriados. (15 segundos é suficiente para reações simples que requerem apenas solução STOP para serem concluídas). Coloque em bloco de calor assim que a enzima for adicionada.
6. Pare a reação.
   1. Quando o temporizador atingir o tempo correto (por exemplo, 15 min), adicione 10 μl de solução STOP à primeira amostra e misture por pipetagem. Coloque imediatamente no gelo/no criorack.
   2. Continuar a interromper as reações nos intervalos de tempo apropriados e na mesma ordem em que foram configuradas, de modo que cada reação tenha exatamente o mesmo tempo de incubação.
7. As amostras estão agora prontas para serem carregadas no gel desnaturante preparado.
   1. Carregue metade (ou toda) de cada amostra usando pontas de carregamento de gel para pipetagem precisa. Nos níveis de oligonucleotídeo usados na reação, metade da reação dará um bom resultado para visualização e permitirá que uma repetição seja executada (por exemplo, se o gel inicial não funcionar corretamente).
   2. É conveniente carregar 1x solução STOP contendo corante (por exemplo, azul de bromofenol) em uma ou mais pistas para verificar como o gel está funcionando.
   3. Oligonucleotídeos fluorescentes de tamanhos conhecidos podem ser executados ao lado das amostras como um marcador de tamanho.
8. Execute o gel.
   1. Adicione a câmara tampão superior ao aparelho de gel e encha com tampão de corrida (1x TBE), certificando-se de que as amostras não sejam perturbadas. Verifique se há vazamento de buffer.
   2. Conecte o equipamento de gel a uma fonte de alimentação e funcione a 200 V (tensão constante) por 150-200 min ou até que o corante azul de bromofenol (se estiver usando) esteja cerca de dois terços do caminho para baixo do gel (ele corre em torno do nível de DNA 10nt neste gel percentual). Monitore o vazamento do buffer, que pode distorcer ou impedir a separação.
   3. Pare o gel e remova-o do aparelho de corrida.

5. Análise e imagem em gel

1. Determine a sensibilidade do gerador de imagens a ser usado, por exemplo, o Fuji FLA-3000 PhosphorImager/Fluorescence Imager pode detectar fluorescência de fluoresceína usando um laser azul de 473 nm, usando sua maior configuração de sensibilidade de F1000 e a menor leitura de pixel (resolução) de 50 μm.
2. Digitalize o gel.
   1. Remova os espaçadores e uma placa de gel com cuidado. Enxágue bem o gel restante na outra placa de gel (mas com cuidado) para remover vestígios de uréia precipitada que, de outra forma, interfeririam na digitalização.
   2. Coloque a placa (com o gel ainda preso) na face de vidro do porta-gel e coloque-a no Imager. Observe as coordenadas do gel no vidro (se não preencher toda a superfície).
   3. Abra o software apropriado no computador conectado e escaneie a região anotada da área de escaneamento onde está o gel. Utilizar as melhores condições determinadas como no passo 5.1. O arquivo resultante será relativamente grande (vários MB), mas a imagem pode ser cortada e compactada, se necessário.
   4. Salve e exporte como um arquivo que pode ser lido pelo software de análise, por exemplo, exporte como um .tiff para análise usando o ImageJ.
3. Analise os dados.
   1. Um ensaio de exonuclease bem-sucedido causará degradação do substrato sequencialmente ao longo do oligonucleotídeo em direção ao fluoróforo, resultando em um padrão característico de fragmentos de DNA fluorescente no gel. As espécies com maior mobilidade no gel (que correm mais longe) são menores do que o substrato inicial não degradado e, portanto, representam produtos da degradação da exonuclease.
   2. Use a ferramenta 'Géis' no ImageJ para quantificar as intensidades relativas das espécies em cada pista, dependendo de sua mobilidade, a fim de determinar os níveis de degradação, portanto, a atividade da exonuclease em cada amostra.

Resultados

Realizar a análise in vitro de atividade exonucleásica exige diversos passos preparatórios além da análise propriamente dita. Um resumo dos procedimentos é mostrado na Figura 1.

Antes de realizar ensaios de exonuclease baseados em fluorescência, é fundamental otimizar a detecção do substrato oligonucleotídico marcado fluorescentemente após a separação em géis de uréia-acrilamida, utilizando um sistema de imagem fluorescente apropriado. A escolha do filtro é extremamen...

Discussão

A determinação da atividade da exonuclease de proteínas purificadas requer a análise dos produtos de clivagem do DNA. A clivagem sequencial do DNA por exonucleases pode ser visualizada pela separação de produtos de clivagem marcados em géis de acrilamida. Historicamente, isso envolvia a marcação final do substrato de DNA com um radiomarcador (por exemplo, ³²P ou ³⁵S), mas com as desvantagens inerentes ao uso do radiomarcador (custo, questões de segurança e instabilidade ao longo do tempo). ...

Materiais

Equipment

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagent/Material
Oligonucleotídeos personalizados	Eurogentec		É necessário obtê-los em alta pureza por exemplo com purificação PAGE.
		5'FLO	fluoresesceína-5' GAACTATGGCTCTC GAGTGCTAGGACATGTCTGA CTACGTACAAGTCACC - 3'bubble
			5'- GGTGACTTGTACGT AGTCAGACATGTCCTAGCAC TCGAGAGCCATAGTTC-3'40
% 19:1 Solução de acrilamida	Severn Biotech	20-2400-05	CUIDADO: neurotoxina potente, portanto, luvas devem ser usadas o tempo todo
Colunas His-Trap (1 ml)	GE Healthcare	17-5247-01
Todos os outros reagentes	qualquer fornecedor		Grau de biologia molecular é necessário (livre de DNase); tubos de microcentrífugas da mesma forma devem ser livres de DNase e RNase<
Leitor	Fuji
V2.02	FujiFilm
Image Gauge V3.3	FujiFilm

respeitável td colspan="4">Hoefer SE400 aparelho de gel Hoefer SE400-15-1.5 FLA-3000 (fósforo e fluorescência de imagens