Membros do género Burkholderia são patógenos de importância clínica. Nós descrevemos um método para extração de proteínas bacterianas, usando ruptura mecânica, e eletroforese em gel 2-D para a análise proteômica subseqüente.
Artigo de método
Membros do género Burkholderia são patógenos de importância clínica. Nós descrevemos um método para extração de proteínas bacterianas, usando ruptura mecânica, e eletroforese em gel 2-D para a análise proteômica subseqüente.
A investigação dos níveis de proteínas intracelulares de espécies de bactérias é de grande importância para a compreensão dos mecanismos patogênicos de doenças causadas por estes organismos. Aqui, descrevemos um processo para a extracção de proteínas a partir de espécies de Burkholderia baseado em lise mecânica com esferas de vidro na presença de ácido tetra-acético de etilenodiamina e de fluoreto de fenilmetilsulfonilo em tampão fosfato salino. Este método pode ser usado para diferentes espécies de Burkholderia, para diferentes condições de crescimento, e é provavelmente apropriada para a utilização em estudos de proteomas de outras bactérias. Após a extracção de proteínas, uma (2-D) técnica de eletroforese em gel de proteômica bidimensional é descrito para estudar mudanças globais nos proteomas desses organismos. Este método consiste na separação de proteínas de acordo com o seu ponto isoeléctrico, por focagem isoeléctrica na primeira dimensão, seguido de separação com base no peso molecularpor electroforese em gel de acrilamida na segunda dimensão. A visualização das proteínas separadas é realizada por coloração com prata.
A Burkholderia gênero compreende mais de 62 espécies, Gram-negativos isolados de uma ampla variedade de nichos, e é dividido em dois blocos principais 1,2. O primeiro grupo inclui humana, animal e organismos phytotrophic, ea maioria dos estudos têm-se centrado nas espécies patogênicas deste grupo devido à sua importância clínica. Os membros mais patogênicas são B. pseudomallei e B. mallei (que causa melioidosis e mormo respectivamente) 3,4 e patógenos oportunistas (17 espécies definidas do complexo Burkholderia cepacia, BCC) 5, que causam doença na fibrose cística (FC) e doença granulomatosa crônica....
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1. Crescimento Cultura (dias 1 +2)
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Análise comparativa dos perfis de proteínas extraídas da mesma cultura bacteriana em duas ocasiões diferentes mostraram padrões semelhantes de bandas indicando extração de proteínas de sucesso. Proteínas de peso molecular extraídos variou 10-150 kDa. Figura 1 mostra representativa coloração com Coomassie azul do gel as extracções de proteínas de células inteiras a partir de multivorans Burkholderia (um membro da BCC) isolados clínicos crescidos em LB ou levedura / Manitol (YEM) e caldo colhido .......
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Um método para a preparação de proteínas tem sido descrito que pode extrair a maioria das proteínas de Burkholderia com boa reprodutibilidade. Isto é demonstrado pela obtenção do mesmo perfil de proteína a partir de duas preparações independentes realizadas em dias diferentes, utilizando a mesma cultura bacteriana cresceu em LB ou caldo YEM como mostrado na Figura 1. Extração foi eficiente para as bactérias cultivadas em meio líquido, no entanto, não testei este método para as bactérias cultiva.......
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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de estudo da Universidade de British Columbia (a BV) e doações de Fibrose Cística Canadá e Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (DPS) para. Agradecemos Jacqueline Chung para a preparação inicial dos protocolos.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Fluoreto de fenilmetanossulfonil (PMSF) | Sigma | P7626 | Acetona tóxica e corrosiva |
| Fisher | A18-1 | Inflamável | |
| PBS Buffer | Bioscience | R028 | |
| Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) | Fisher | BP118-500 | tóxico |
| Contas de vidro (0.1 mm) | Produtos BioSpec | 11079101 | |
| Nalgene Oak Ridge Tubos de centrífuga, policarbonato (50 ml) | VWR | 21009-342 | |
| Kit de extração de proteínas MicroBCA | Pierce | 23235 | |
| Tubos de microcentrífuga 2.0 ml cónicos Tubos com tampa de rosca e anel de vedação | Fisher | 02-681-375 | |
| Kit de limpeza 2-D | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| Ureia | Invitrogen | 15505-050 | Irritante |
| CHAPS | Amersham Biosciences | 17-1314-01 | |
| Ditiotreitol (DTT) | MPBiomedical, LCC | 856126 | Irritant |
| Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm | Amersham Biosciences | 176002-46 | |
| Duracryl | Proteomic Solutions | 80-0148 | Muito tóxico, cancerígeno |
| Persulfato de amônio | Fisher | BP179-100 | Inflamável, tóxico, corrosivo |
| N, N, N', N'-tetrametiletilenodiamina (TEMED) | Invitrogen | 15524-010 | |
| Dodecil sulfato de sódio inflamável (SDS) | Fisher | BP166-500 | Toxicidade aguda, inflamável |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Etanol | Fisher | HC1100-1GL | Inflamável, tóxico |
| Ácido acético | Fisher | A491-212 | Inflamável, corrosivo |
| Glutaraldeído | Fisher | G151-1 | Muito tóxico, corrosivo, perigoso para o meio ambiente |
| Tetrationato de potássio | Sigma | P2926 | |
| Acetato de sódio | EM Science | 7510 | |
| Nitrato de prata | Sigma | 209139 | Corrosivo, perigoso para o meio ambiente |
| Formaldeído | Sigma | 252549 | Tóxico |
| Tiossulfato de sódio | Sigma | S7026 | |
| Tris Base | EMD | 9230 | |
| Glicina | MPBiomedical, LCC | 808831 | |
| Glicerol | MPBiomedical, LCC | 800688 | |
| Metanol | Fisher | A412-4 | Inflamável, tóxico, perigoso para a saúde |
| Carbonato de sódio anidro | EMD | SX0400-3 | |
| Óleo mineral | ACROS | 415080010 | |
| Equipment | |||
| Rotor de ultracentrífuga JA-20 | Beckman Coulter | 334831 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | 3110BX | |
| Sistema de focagem isoelétrica Ettan IPGphor II e acessórios | GE Healthcare | 80-6505-03 | www.amershambiosciences.com |
| Ettan DALT Sistema de eletroforese vertical grande | GE Healthcare | 80-6485-27 | www.amershambiosciences.com |
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