Artigo de método

Extração de proteínas e 2-D métodos Eletroforese em Gel de

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DOI:

10.3791/50730

15 de outubro de 2013

Neste artigo

Resumo

Membros do género Burkholderia são patógenos de importância clínica. Nós descrevemos um método para extração de proteínas bacterianas, usando ruptura mecânica, e eletroforese em gel 2-D para a análise proteômica subseqüente.

Resumo

A investigação dos níveis de proteínas intracelulares de espécies de bactérias é de grande importância para a compreensão dos mecanismos patogênicos de doenças causadas por estes organismos. Aqui, descrevemos um processo para a extracção de proteínas a partir de espécies de Burkholderia baseado em lise mecânica com esferas de vidro na presença de ácido tetra-acético de etilenodiamina e de fluoreto de fenilmetilsulfonilo em tampão fosfato salino. Este método pode ser usado para diferentes espécies de Burkholderia, para diferentes condições de crescimento, e é provavelmente apropriada para a utilização em estudos de proteomas de outras bactérias. Após a extracção de proteínas, uma (2-D) técnica de eletroforese em gel de proteômica bidimensional é descrito para estudar mudanças globais nos proteomas desses organismos. Este método consiste na separação de proteínas de acordo com o seu ponto isoeléctrico, por focagem isoeléctrica na primeira dimensão, seguido de separação com base no peso molecularpor electroforese em gel de acrilamida na segunda dimensão. A visualização das proteínas separadas é realizada por coloração com prata.

Introdução

A Burkholderia gênero compreende mais de 62 espécies, Gram-negativos isolados de uma ampla variedade de nichos, e é dividido em dois blocos principais 1,2. O primeiro grupo inclui humana, animal e organismos phytotrophic, ea maioria dos estudos têm-se centrado nas espécies patogênicas deste grupo devido à sua importância clínica. Os membros mais patogênicas são B. pseudomallei e B. mallei (que causa melioidosis e mormo respectivamente) 3,4 e patógenos oportunistas (17 espécies definidas do complexo Burkholderia cepacia, BCC) 5, que causam doença na fibrose cística (FC) e doença granulomatosa crônica....

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Protocolo

1. Crescimento Cultura (dias 1 +2)

  1. Crescer uma cultura de partida: 3 ml de Luria Bertani (LB) caldo numa ml tubo de pressão top 15, a 37 ° C durante a noite rotador. Dilui-se o crescimento durante a noite a uma DO600 de 0,6. Adicionar 1 ml desta diluição para 100 ml de caldo LB num balão Erlenmeyer de 250 mL. Incubar a 37 ° C com agitação a 250 rpm durante 16 horas em fase estacionária (SP), a melhor aproximada, em cultura descontínua, condições de infecção e para assegurar que os factores de virulência bacteriana sob o controlo de factores de sinal de fase estacionária, tais como centros de investigação e de quorum detecção, são expressos. Alte....

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Resultados

Análise comparativa dos perfis de proteínas extraídas da mesma cultura bacteriana em duas ocasiões diferentes mostraram padrões semelhantes de bandas indicando extração de proteínas de sucesso. Proteínas de peso molecular extraídos variou 10-150 kDa. Figura 1 mostra representativa coloração com Coomassie azul do gel as extracções de proteínas de células inteiras a partir de multivorans Burkholderia (um membro da BCC) isolados clínicos crescidos em LB ou levedura / Manitol (YEM) e caldo colhido .......

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Discussão

Um método para a preparação de proteínas tem sido descrito que pode extrair a maioria das proteínas de Burkholderia com boa reprodutibilidade. Isto é demonstrado pela obtenção do mesmo perfil de proteína a partir de duas preparações independentes realizadas em dias diferentes, utilizando a mesma cultura bacteriana cresceu em LB ou caldo YEM como mostrado na Figura 1. Extração foi eficiente para as bactérias cultivadas em meio líquido, no entanto, não testei este método para as bactérias cultiva.......

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de estudo da Universidade de British Columbia (a BV) e doações de Fibrose Cística Canadá e Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (DPS) para. Agradecemos Jacqueline Chung para a preparação inicial dos protocolos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagents
Fluoreto de fenilmetanossulfonil (PMSF)SigmaP7626Acetona tóxica e corrosiva
FisherA18-1Inflamável
PBS BufferBioscienceR028
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)FisherBP118-500tóxico
Contas de vidro (0.1 mm)Produtos BioSpec11079101
Nalgene Oak Ridge Tubos de centrífuga, policarbonato (50 ml)VWR21009-342
Kit de extração de proteínas MicroBCAPierce23235
Tubos de microcentrífuga 2.0 ml cónicos Tubos com tampa de rosca e anel de vedaçãoFisher02-681-375
Kit de limpeza 2-DGE Healthcare80-6484-51
UreiaInvitrogen15505-050Irritante
CHAPSAmersham Biosciences17-1314-01
Ditiotreitol (DTT)MPBiomedical, LCC856126Irritant
Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cmAmersham Biosciences176002-46
DuracrylProteomic Solutions80-0148Muito tóxico, cancerígeno
Persulfato de amônioFisherBP179-100Inflamável, tóxico, corrosivo
N, N, N', N'-tetrametiletilenodiamina (TEMED)Invitrogen15524-010
Dodecil sulfato de sódio inflamável (SDS)FisherBP166-500Toxicidade aguda, inflamável
AgaroseInvitrogen15510-027
EtanolFisherHC1100-1GLInflamável, tóxico
Ácido acéticoFisherA491-212Inflamável, corrosivo
GlutaraldeídoFisherG151-1Muito tóxico, corrosivo, perigoso para o meio ambiente
Tetrationato de potássioSigmaP2926
Acetato de sódioEM Science7510
Nitrato de prataSigma209139Corrosivo, perigoso para o meio ambiente
FormaldeídoSigma252549Tóxico
Tiossulfato de sódioSigmaS7026
Tris BaseEMD9230
GlicinaMPBiomedical, LCC808831
GlicerolMPBiomedical, LCC800688
MetanolFisherA412-4Inflamável, tóxico, perigoso para a saúde
Carbonato de sódio anidroEMDSX0400-3
Óleo mineralACROS415080010
Equipment
Rotor de ultracentrífuga JA-20Beckman Coulter334831
Mini BeadbeaterBiospec Products3110BX
Sistema de focagem isoelétrica Ettan IPGphor II e acessóriosGE Healthcare80-6505-03www.amershambiosciences.com
Ettan DALT Sistema de eletroforese vertical grandeGE Healthcare80-6485-27www.amershambiosciences.com
irritante tóxico

Referências

  1. Drevinek, P., Mahenthiralingam, E. Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence. Clin. Microbiol. Infect. 16, 821-830 (2010).
  2. Suarez-Moreno, Z. R., et al. Commo....

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