É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Culturas neuronais estratificadas por sexo para estudar vias de morte celular isquêmica

12.4K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/50758

⸱

9 de dezembro de 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Colorado School of Medicine, 2Oregon National Primate Research Center, Oregon Health & Science University, 3Department of Pharmacology, University of Colorado School of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Culturas neuronais embrionárias primárias dissociadas do hipocampo são úteis para investigar os mecanismos de sinalização envolvidos na morte dos neurônios. A sexagem dos embriões antes do isolamento e dissociação do hipocampo permite a preparação de culturas masculinas e femininas separadas, o que permite ao pesquisador identificar e investigar a sinalização celular específica do sexo.

Resumo

As diferenças sexuais na suscetibilidade neuronal à lesão isquêmica e à doença neurodegenerativa são observadas há muito tempo, mas os mecanismos de sinalização responsáveis por essas diferenças permanecem obscuros. A cultura neuronal embrionária primária dissociada fornece um modelo experimental simplificado para investigar a sinalização celular neuronal envolvida na morte celular como resultado de isquemia ou doença; No entanto, a maioria das culturas neuronais usadas em pesquisas hoje são de sexo misto. Os pesquisadores podem e testam os efeitos do tratamento com esteróides sexuais em culturas neuronais de sexo misto em modelos de lesão e doença neuronal, mas evidências acumuladas sugerem que o cérebro feminino responde a andrógenos, estrogênios e progesterona de maneira diferente do cérebro masculino. Além disso, roedores machos e fêmeas recém-nascidos respondem de maneira diferente à lesão isquêmica, com os machos apresentando maior lesão após isquemia cerebral do que as fêmeas. Assim, culturas neuronais de sexo misto podem obscurecer e confundir os resultados experimentais; informações importantes podem ser perdidas. Por esse motivo, o Herson Lab da Escola de Medicina da Universidade do Colorado prepara rotineiramente culturas neuronais embrionárias primárias dissociadas estratificadas por sexo do hipocampo e do córtex. Os embriões são sexados antes da colheita do tecido cerebral e os tecidos masculino e feminino são dissociados separadamente, plaqueados separadamente e mantidos separadamente. Usando este método, o Herson Lab demonstrou um papel específico do sexo masculino para o canal iônico TRPM2 na morte celular isquêmica. Neste manuscrito, compartilhamos e discutimos nosso protocolo para sexagem de camundongos embrionários e preparação de culturas de neurônios primários dissociados do hipocampo estratificados por sexo. Este método pode ser adaptado para preparar culturas corticais estratificadas por sexo e o método de sexagem de embriões pode ser usado em conjunto com outros protocolos para qualquer estudo em que o sexo seja considerado um determinante importante do resultado.

Introdução

Os mamíferos são sexualmente dimórficos com machos e fêmeas exibindo diferentes traços e características. As diferenças sexuais se estendem até mesmo ao cérebro e são evidentes na suscetibilidade neuronal a lesões e doenças (revisado em 1-5). Por exemplo, o cérebro masculino é mais suscetível a lesão neuronal isquêmica por acidente vascular cerebral ou parada cardíaca seguida de ressuscitação (revisado em6). A doença de Parkinson (revisada em7) e a esquizofrenia (revisada em8) são mais comuns em homens humanos do que em mulheres, enquanto o cérebro humano feminino parece mais suscetível à doença de Alzheimer (revisado em9) e transtornos de humor, como depressão (revisado em10). Apesar das diferenças observáveis entre os sexos na suscetibilidade a lesões e doenças neuronais, a maioria dos paradigmas de tratamento atuais não considera o sexo e são semelhantes em homens e mulheres. Maior sucesso poderia ser alcançado se as diferenças entre os sexos fossem contabilizadas e compreendidas.

Modelos animais in vivo de lesões e doenças neuronais demonstram dimorfismo sexual semelhante ao dos humanos e são essenciais para melhorar nossa compreensão das diferenças sexuais e como essas diferenças contribuem para a sobrevivência e função neuronal. Evidências demonstraram, por exemplo, que roedores machos são mais suscetíveis do que fêmeas à lesão neuronal isquêmica11-15. Acredita-se que essa diferença seja, pelo menos parcialmente, dependente da sinalização molecular da testosterona, o principal hormônio esteróide sexual masculino, e do estrogênio, o principal hormônio esteróide sexual feminino. Estudos com roedores machos e fêmeas gonectomizados revelam que a testosterona e o metabólito da testosterona, a diidrotestosterona (DHT) exacerbam e o estrogênio diminui a lesão neuronal após isquemia cerebral12-14,16-18. No entanto, as diferenças sexuais na isquemia cerebral estão presentes tanto em animais neonatos quanto em adultos19,20. Os neonatos experimentam surtos de estrogênio ou testosterona no útero durante o desenvolvimento, mas têm níveis relativamente baixos de hormônio após o nascimento até a puberdade (revisado em21). Assim, a presença ou ausência de hormônio sexual primário não é o único determinante da suscetibilidade neuronal influenciada pelo sexo à lesão. De fato, é provável que dimorfismos sexuais sejam estabelecidos durante o desenvolvimento que resultam em diferenças na sinalização celular e na resposta à isquemia, mesmo quando os níveis hormonais estão baixos.

Independentemente de as diferenças sexuais dependerem da presença de hormônio esteróide sexual ou se forem devidas a dimorfismos estabelecidos durante o desenvolvimento, está ficando claro com mais estudos que existem diferenças na sinalização celular entre homens e mulheres no cérebro. No Herson Lab da Escola de Medicina da Universidade do Colorado, identificamos uma dessas diferenças. Descobrimos que o canal iônico permeável ao cálcio, sódio e potássio, TRPM2 (revisado em22,23), induz a morte celular neuronal após insulto isquêmico in vivo no camundongo macho, mas não na fêmea24. Demonstramos que a inibição farmacológica ou knockdown genético do TRPM2 é protetora no camundongo macho, mas não na fêmea, em nosso modelo in vivo de oclusão arterial da carótida média (MCAO) de AVC24.

Apesar de sua utilidade, modelos animais in vivo de lesão neuronal isquêmica podem, às vezes, ser limitados para estudos moleculares de morte neuronal, devido à dificuldade ou incapacidade de direcionar especificamente os neurônios para investigação. Por esse motivo, nosso laboratório usa neurônios corticais ou hipocampais primários dissociados in vitro para complementar nosso trabalho in vivo. As culturas primárias de neurônios dissociados apresentam uma ferramenta útil para investigar as vias de sinalização celular envolvidas na lesão e doença neuronal. Os neurônios em cultura podem ser mantidos em um ambiente rigidamente controlado, com ou sem entrada glial. Na ausência de glia, quaisquer respostas observadas na cultura são neuronais. Os agentes farmacológicos podem ser administrados à cultura sem preocupações com a absorção através da barreira hematoencefálica, permitindo a inibição ou ativação de componentes específicos de uma determinada via de transdução de sinal. A biologia molecular pode ser usada para superexpressar ou derrubar várias proteínas de interesse, e medições eletrofisiológicas podem ser realizadas em células individuais, algo que não seria possível em um sistema modelo in vivo.

O Herson Lab expande a utilidade das culturas neuronais primárias dissociadas, sexando primeiro os embriões usados para preparar as culturas. Culturas de neurônios estratificados por sexo masculino e feminino demonstram claramente que os neurônios masculinos são mais suscetíveis do que os neurônios femininos à morte celular neuronal após a privação de oxigênio e glicose25. A privação de oxigênio e glicose é um modelo in vitro aceito de isquemia neuronal, pois a isquemia reduz a disponibilidade de oxigênio e glicose para o cérebro. Além disso, demonstramos com experimentos eletrofisiológicos em neurônios dissociados e estratificados por sexo que o TRPM2 é ativado em neurônios masculinos, mas não femininos24,26. Atualmente, estamos investigando os reguladores moleculares específicos do sexo da atividade de TRPM224,26. Aqui, compartilhamos e discutimos nosso protocolo para estabelecer culturas de neurônios do hipocampo dissociados embrionários primários estratificados por sexo e apresentamos dados representativos usando este método que sugerem que a enzima de reparo do DNA, PARP-1, contribui para a morte celular isquêmica de uma maneira específica do sexo semelhante ao TRPM2. O PARP-1 é ativado pela quebra do DNA devido ao estresse oxidativo (revisado em27,28). Quando o dano ao DNA é mínimo, a atividade do PARP-1 aumenta a sobrevivência celular, mas quando o dano é excessivo, o aumento da atividade do PARP-1 exacerba a morte celular. O PARP-1 produz poli-(ADP)ribose, um ativador conhecido do canal TRPM228-31, e algumas evidências sugerem que o PARP-1 é ativado preferencialmente no cérebro masculino, mas não feminino, em resposta ao estresse oxidativo32,33. Assim, hipotetizamos que o PARP-1 ativa o TRPM2 no homem, mas não na mulher, induzindo a morte celular neuronal em resposta à privação de oxigênio e glicose.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os procedimentos deste protocolo foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Instituto Nacional de Saúde para o tratamento ético e cuidados com animais e de acordo com um protocolo de uso de animais aprovado pela IACUC.

1. Preparação de placas de cultura de tecidos, meios de cultura e instrumentos de dissecção a serem realizados pelo menos um dia antes da dissecção

  1. Prepare 1 L de tampão borato: 3,1 g/L de ácido bórico e 4,75 g/L de bórax em H2O duplamente destilado. Ajustar o pH para 8,4. Filtrar-esterilizar e conservar a 4 °C até à utilização.
  2. Diluir a poli-D-lisina a 0,1 mg/ml.
    1. Sob uma capa de cultura de tecidos de fluxo laminar, coloque poli-D-lisina diluída suficiente para cobrir generosamente o fundo de cada poço de uma placa de cultura de tecidos estéreis tratada com cultura de vários poços. (Se desejado, lamínulas de cobertura de vidro pré-limpas e estéreis podem ser adicionadas ao fundo de cada poço antes da adição de poli-D-lisina. As lamínulas podem flutuar após a adição de poli-D-lisina, portanto, devem ser empurradas para baixo com pinças estéreis, se necessário.)
    2. Incubar as placas durante a noite na incubadora a 37 °C.
  3. Prepare 1 L de tampão de dissecação: 350 mg/L de NaHCO3, 2,38 g/L de HEPES, 1,44 g/L de MgSO4 e 300 mg/L de BSA em 1x Hanks Solução Salina Balanceada sem Ca, Mg, piruvato de sódio ou vermelho de fenol. Ajuste o pH para 7,3. Filtre-esterilize e armazene a 4 °C até que seja necessário.
  4. Prepare 500 ml de meio de plaqueamento: 10% de soro fetal bovino, 100 unidades/ml de penicilina e estreptomicina e 2,5 mM de glutamina em MEM sem vermelho de fenol. Filtre-esterilize. Conservar a 4 °C até ser necessário. Descarte qualquer meio não utilizado após 1 mês.
  5. Prepare 500 ml de meio de alimentação: 2% de suplemento de B-27, 100 unidades / ml de penicilina e estreptomicina e 2,0 mM de GlutaMAX (não glutamina) em Neurobasal sem vermelho de fenol. Filtre-esterilize. Conservar a 4 °C até ser necessário. Descarte qualquer meio de alimentação restante após 1 mês.
  6. Prepare 10 ml de 100 mM de CaCl2, 500 mM de EDTA e 1 M de NaOH conforme necessário, de acordo com os métodos padrão.
  7. Autoclave os instrumentos cirúrgicos/de dissecção e armazene em condições estéreis até que seja necessário. Este procedimento requer duas pinças angulares de ponta extrafina afiadas, uma pinça curva de ponta fina, uma pinça curva serrilhada, uma pequena pinça dentada de rato, um par de tesouras microcirúrgicas, um par de tesouras cirúrgicas finas e estreitas, um par de tesouras de ponta média e uma sonda de dissecção sem corte. Instrumentos estéreis adicionais podem ser adicionados de acordo com a preferência pessoal.

2. Preparação de placas de cultura de tecidos, meios de cultura, instrumentos de dissecção e área de dissecção a serem realizados no dia da dissecção

  1. Lave as placas de cultura de tecidos revestidas com poli-D-lisina. Sob o gabinete de biossegurança de fluxo laminar, aspire a poli-D-lisina com uma linha de vácuo ou pipeta, adicione água a cada poço e incube em temperatura ambiente por ~ 5 min. Aspire a água e substitua-a por água limpa e estéril. Repita 3x.
    1. Deixe as placas secarem completamente à temperatura ambiente.
  2. Prepare a área de dissecação limpando o contador e o escopo de dissecação com etanol a 70%.
    1. Sature um Kimwipe grande com etanol a 70% e coloque as ferramentas de dissecação autoclavadas. Cubra com outro Kimwipe.
    2. Encha um prato grande e plano com gelo. Rotular e encher um número adequado de placas de cultura de 60 mm com solução de dissecação a frio. Prepare pratos suficientes para manter as cabeças masculinas e femininas, cérebros e hipocampos separados (se aplicável).
    3. Encher duas placas de cultura maiores de 100 mm com tampão de dissecação a frio.
    4. Reserve uma cápsula separada de 100 mm sem tampão (seca).
    5. Estabelecer uma área para resíduos de risco biológico e outra para tecidos animais (a serem descartados adequadamente após a dissecação, de acordo com os padrões institucionais).
  3. Aqueça o meio de plaqueamento de 30 ml em banho-maria a 37 °C. Esta solução quente será usada na fase de dissociação celular do protocolo.
  4. Coloque 1 ml de meio de plaqueamento em cada poço de placa de cultura de tecidos revestida com poli-D-lisina de 24 poços. Use um volume menor apropriado se forem usadas placas menores. Coloque a placa coberta em uma incubadora a 37 °C a 5% de CO2 para aquecer e equilibrar o CO2 durante a dissecação.
  5. Prepare a solução de papaína.
    1. Rotule dois tubos cônicos estéreis de 15 ml, um como "masculino" e o outro como "feminino".
    2. Adicione o seguinte a cada tubo: 10 ml de tampão de dissecção, 150 μl 100 mM CaCl2, 10 μl 500 mM EDTA, 10μl 1 M NaOH e 150 U de papaína.
    3. Misturar delicadamente, invertendo o tubo três vezes e, em seguida, aquecer em banho-maria a 37 °C. Nota: Cada frasco de papaína terá uma unidade de atividade diferente por mg de papaína, portanto, o volume de papaína adicionado à solução será diferente de frasco para frasco. A papaína ficará turva inicialmente, mas a solução ficará clara à medida que a papaína se dissolver completamente.

3. Colheita, sexagem e dissecação de embriões E18

  1. Anestesie a rata grávida com isoflurano ou outra anestesia apropriada. Eutanásia do camundongo sob anestesia profunda por decapitação ou luxação cervical.
  2. Trabalhando rapidamente, limpe o abdômen da fêmea com etanol 70%. Se desejado, o abdômen pode ser raspado antes de ser pulverizado com etanol para reduzir os riscos de contaminação. Levante a pele abdominal com a pinça dentada de rato. Faça uma grande incisão no abdômen com a tesoura de ponta média, cortando a pele e os músculos abdominais, expondo os órgãos internos.
  3. Remova cuidadosamente os embriões, levantando cada corno uterino inteiro do abdômen, tomando cuidado para não deixá-lo entrar em contato com nenhum tecido externo, se possível (para evitar contaminação). Coloque os cornos uterinos contendo os embriões em um prato com solução salina de dissecção fria e transfira para gelo.
  4. Remova cuidadosamente cada filhote dos chifres uterinos e do saco embrionário. Os filhotes são frágeis, então isso é melhor feito cortando o tecido uterino entre cada embrião para expor o saco embrionário e, em seguida, cortando cuidadosamente o saco na superfície com a ponta da tesoura pequena e estreita. O fluido embrionário e o filhote podem então ser empurrados suavemente pela abertura sem danificar o embrião.
    1. Se a incisão no saco embrionário não for grande o suficiente para que o fluido e o filhote saiam facilmente, aumente a incisão com cuidado até que o filhote deslize para fora com o mínimo de força.
    2. Não aperte o saco com muita força para forçar o embrião a sair, pois isso também pode danificar os embriões.
  5. Remova a cabeça de um único embrião. Deixe a cabeça em um prato de dissecção salina no gelo. Colocar o corpo do embrião de costas na placa seca de 100 mM sob o escopo de dissecação. Usando a pinça curva de ponta média em uma mão e a pinça curva serrilhada na outra, alise suavemente o filhote, empurrando as patas traseiras para baixo e ventral, as patas dianteiras para baixo e dorsal.
  6. Remova a cauda com uma tesoura, se necessário; a cauda tende a se enrolar sobre o abdômen e pode atrapalhar a dissecção.
  7. Solte as patas traseiras e aperte o abdômen na raiz do cordão umbilical, chamado umbigo. Levante suavemente. Solte as patas dianteiras e com a outra mão e a microtesoura, faça um pequeno "v" invertido no abdômen logo acima do umbigo com a ponta do "v" apontando para o crânio.
  8. Troque a tesoura pela pinça curva novamente. Vire a pinça para que a ponta fique para cima e longe do animal. Com força suave, empurre para baixo e dorsal na caixa torácica com a borda fechada e arredondada da pinça curva, enquanto puxa para baixo e ventral com a outra pinça, espalhando o filhote ventral para dorsal. Esse movimento de propagação abrirá a cavidade abdominal, expondo os intestinos, fígado e outros órgãos internos.
  9. Usando a pinça curva, empurre suavemente os intestinos e o fígado cranialmente usando movimentos repetidos de varredura. Isso irá expor gradualmente os rins, a bexiga e, o mais importante, os órgãos sexuais internos.
    1. Os filhotes machos são identificados pela presença de testículos estriados encontrados logo abaixo dos rins de cada lado. Os testículos têm aproximadamente 1/3-1/2 do tamanho dos rins e, ocasionalmente, caem para ficar logo acima da bexiga.
    2. As mulheres são mais facilmente identificadas pela falta de testículos, mas também podem ser identificadas pelo pequeno útero que fica acima da bexiga e pelas trompas de falópio que se estendem em direção aos rins. Sob alta potência no escopo de dissecação, os ovários também podem ser identificados como órgãos pequenos e escuros no final das trompas de Falópio imediatamente abaixo e às vezes abaixo dos rins bilateralmente.
  10. Uma vez determinado o sexo, descarte o corpo e coloque a cabeça em um prato devidamente rotulado (masculino ou feminino). Mantenha as cabeças congeladas na solução de dissecação.
  11. Repita as etapas 3.5-3.10 até que cada filhote tenha sido sexado. Para obter melhores resultados, limpe o prato com um Kimwipe entre cada dissecção; O fluido torna os filhotes escorregadios e difíceis de agarrar para a dissecação.
  12. Uma vez que todos os embriões tenham sido sexados e as cabeças masculina e feminina tenham sido separadas, prossiga com o restante da dissecação, tomando cuidado especial para manter todos os tecidos derivados de machos e fêmeas separados.
  13. Transfira um cérebro de cada vez para um prato de 100 mM cheio de tampão de dissecção a frio. Sob o escopo de dissecação, use a pinça curva para perfurar os olhos do embrião para ancorá-lo para dissecação. Usando a tesoura microcirúrgica, faça uma incisão rasa na linha média, dividindo a pele e o crânio na linha média, da base do crânio ao topo da cabeça, logo acima da passagem nasal.
  14. Afaste suavemente a pele e o crânio bilateralmente e extraia o cérebro com muita delicadeza, retirando-o cuidadosamente do prosencéfalo em direção ao tronco encefálico com a base da tesoura microcirúrgica ou com uma pinça fechada e angular.
    1. Use cuidadosamente a pinça para transferir o cérebro extraído para um prato limpo e rotulado cheio de tampão de dissecação a frio. Mantenha o prato no gelo.
    2. Repita esse processo até que todos os cérebros tenham sido colhidos.
    3. Esta etapa deve produzir duas placas de cérebros inteiros em tampão de dissecação, uma para tecido masculino e outra para tecido feminino.
  15. Coloque um prato limpo abaixo do escopo de dissecação e encha com tampão de dissecação. Despeje solução apenas o suficiente para manter os cérebros úmidos durante a dissecção do hipocampo; Muito fará com que o cérebro flutue e dificulte o manuseio. Se desejar, pré-cubra o prato de dissecação com cera estéril. A cera fornece uma superfície antiderrapante sobre a qual trabalhar e protege as pontas de instrumentos de dissecação delicados; Arranhar o fundo de um prato não revestido pode dobrar ou embotar as bordas afiadas das ferramentas.
  16. Altere o escopo de dissecção para uma configuração de alta potência e ajuste o foco de acordo. Transfira cuidadosamente um cérebro de cada vez para o prato de dissecação. Usando a pinça de ponta extrafina, separe cada hemisfério cerebral e retire-os do tronco cerebral.
  17. Com muito cuidado, remova as meninges de cada hemisfério. (As meninges são uma membrana rosada, rica em vasos sanguíneos, e são uma fonte comum de contaminação glial em uma cultura de neurônios.)
    1. Para remover as meninges, belisque, levante e puxe delicadamente a membrana, tomando cuidado para não perfurar o tecido cerebral por baixo.
    2. Puxe as meninges para longe do cérebro, permitindo que o cérebro role um pouco abaixo da pinça, mas mantendo-a no lugar para que a membrana possa ser puxada.
  18. Neste ponto, você pode dissecar ainda mais o cérebro para usar o tecido de sua escolha. Por exemplo, disseque o hipocampo de cada hemisfério. Coloque um hemisfério com o lado lateral voltado para baixo. Observe a grande cavidade ventricular, que cria um retalho cobrindo o hipocampo. Provoque suavemente esta aba para trás até que o hipocampo em forma de meia-lua possa ser observado. O hipocampo é ligeiramente elevado e fica entre o mesencéfalo e o córtex.
  19. Usando dois pares de pinças afiadas e extrafinas, segure o hemisfério cerebral aberto com uma mão e corte o hipocampo do córtex e do mesencéfalo com a outra.
    1. Coloque o hipocampo em um prato corretamente rotulado (masculino ou feminino) cheio de tampão de dissecção e mantido no gelo.
    2. Disseque o hipocampo do hemisfério restante e repita esse processo com cada cérebro.
  20. Transfira o hipocampo para tubos cônicos de 15 ml devidamente marcados.
    1. Lave suavemente duas vezes com tampão de dissecção a frio. Use a sucção a vácuo com muito cuidado nesta fase. Os hipocampos são pequenos e podem ser irrecuperavelmente perdidos no vácuo. Evite isso permitindo que o tecido se acumule no fundo do tubo, remova o máximo de líquido possível do tubo com uma pipeta, descarte a solução e substitua por um tampão de dissecção fresco e limpo.
    2. Repita a etapa 3.20.1.

4. Dissociação Neuronal

  1. Transfira o hipocampo para uma solução de papaína pré-aquecida e devidamente marcada. Coloque em banho-maria a 37 °C e incube por 8-10 min, invertendo suavemente os tubos para misturar a cada 2-3 min.
  2. Remova a mistura de papaína e o lenço de papel do banho-maria. Deixe o tecido assentar e, em seguida, remova cuidadosamente o máximo possível da solução de papaína com uma pipeta, deixando o tecido no fundo do tubo. Lave o lenço 3x com mídia de revestimento. O soro no meio de plaqueamento extingue a digestão enzimática da papaína. O inibidor de tripsina é necessário se o soro não for usado no meio de plaqueamento.
  3. Remova a mídia de revestimento.
    1. Adicione 2 ml de meio neurobasal fresco e dissocie suavemente o tecido usando uma pipeta sorológica de 5 ml ajustada na velocidade mais lenta.
    2. A dissociação é realizada pipetando suavemente para cima e para baixo 8x. Tenha cuidado para não introduzir bolhas na solução. Para obter melhores resultados, pegue a solução e o tecido na pipeta e solte a solução na lateral do tubo cônico, permitindo que o tecido deslize para baixo na lateral e de volta para o fundo do tubo.
  4. Após a 8ª trituração, deixe o tecido assentar e colete a mídia turva por cima. Essa mídia contém células dissociadas.
    1. Transfira-o para um novo tubo rotulado.
    2. Adicionar mais 2 ml ao tecido não dissociado.
    3. Triturar novamente mais 8x.
    4. Colha a mídia turva.
    5. Repita este processo 3-5x. Algum tecido não dissociado permanecerá. Embora seja possível triturar até que todo o tecido esteja dissociado, a trituração excessiva resulta em problemas de saúde neuronal e não é recomendada.
  5. Adicione meio extra aos tubos cônicos conforme necessário para equalizar os volumes e pesos entre o tecido masculino e feminino. Centrifugue as células em um balde giratório centrífuga a 228 x g por 5 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante.
  6. Ressuspenda suavemente as células em um meio de plaqueamento fresco de 2 ml e filtre a solução através de um filtro de células de malha em um tubo cônico limpo e rotulado de 50 ml.
  7. Adicionar 50 μl de suspensão celular a 450 μl de azul de tripano a 0,4%. Incube as células por 2 min em Trypan Blue, misture suavemente e carregue 10 μl em um hemocitômetro. Contar as células excluindo aquelas que absorveram o corante azul de tripano; As células azuis escuras estão mortas ou morrendo.

5. Plaqueamento e Manutenção da Cultura

  1. Calcule o volume correto de suspensão celular para adicionar a cada poço da placa de cultura de tecidos para obter a densidade celular desejada. As culturas de neurônios são muito sensíveis à densidade celular e se dão melhor em densidade média a alta, a menos que sejam cocultivadas com glia ou alimentadas com meios condicionados gliais. Neste protocolo, as células são plaqueadas em 150.000-200.000 células/cm2.
  2. Remova a placa de cultura de tecidos pré-preenchida com meio de revestimento da incubadora (preparada na etapa 2 acima).
    1. Agite suavemente a suspensão celular no tubo cônico de 50 ml e, em seguida, pipete o volume desejado de suspensão celular (calculado acima na etapa 5.1) até o centro de cada poço.
    2. Repita, girando a suspensão celular a cada vez antes de pipetar para garantir a densidade celular igual em cada poço. As células se acomodam rapidamente e a densidade celular pode mudar de poço para poço se a etapa de turbilhão for pulada.
  3. Depois que as células forem adicionadas a cada poço, gire suavemente a placa para dispersá-las e, em seguida, recoloque imediatamente a placa na incubadora. Deixe as células intactas por pelo menos 24 horas.
  4. Pelo menos 24 horas após o plaqueamento das células, aqueça o meio de alimentação neurobasal completo a 37 °C. Aspire o meio de plaqueamento de cada poço e substitua-o por meio de alimentação. Aspire e substitua de um poço de cada vez para minimizar o estresse neuronal e melhorar a sobrevivência celular.
  5. As culturas de neurônios devem ser alimentadas a cada 4-7 dias, removendo cuidadosamente metade do meio e adicionando de volta um volume igual de meio fresco. Nessas condições, as culturas podem ser mantidas por duas semanas. Com culturas neuronais primárias, espera-se alguma morte celular. Assim, à medida que as culturas amadurecem, a densidade diminui. Neste protocolo, a densidade celular diminui em aproximadamente 30% no dia 10 in vitro.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

A sexagem adequada de camundongos embriões é uma etapa crítica no preparo de culturas primárias de neurônios estratificadas por sexo. Para garantir que os hipocampos de machos e fêmeas fossem cultivados separadamente a partir de embriões corretamente sexados, os embriões foram separados por sexo e seus córtex e hipocampo foram coletados. O DNA genômico foi isolado do tecido coletado de cada embrião conforme procedimentos padrão, tomando o cuidado de manter os sexos separados. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi re...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Culturas neuronais primárias dissociadas do hipocampo estratificadas por sexo, nas quais hipocampos masculinos e femininos são dissecados, dissociados e cultivados separadamente, apresentam uma ferramenta útil para investigar a sinalização celular específica do sexo na morte celular de neurônios. Embora os neurocientistas geralmente usem culturas neuronais primárias, os protocolos variam entre os laboratórios, dependendo de seus objetivos e interesses experimentais específicos. Muitos pesquisadores optam por cocultura de...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Trabalho apoiado em parte pela Fundação Walter S. e Lucienne Driskill e NIH R01NS058792.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Suplemento B27Invitrogen17504-044
BóraxSigma71997
Ácido BóricoSigmaB6768
Albumina de Soro BovinoSigmaA4503
Soro Bovino FetalInvitrogen26140-079
GlutaMAXInvitrogen35050-061
GlutaminaInvitrogen25030-081
HBSS, sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenolInvitrogen14175-095
MEM, sem glutamina, sem vermelho de fenolInvitrogen51200-038
Neurobasal, sem glutamina, sem vermelho de fenolInvitrogen12348-017
Penicilina/EstreptomicinaInvitrogen15070-063
Poli-D-lisina, MW 70.000-150.000SigmaP0899
Trypan Blue 0,4%Invitrogen15250-061
EQUIPAMENTO
Dumont # 5/45 Fórceps AnguladoFerramentas de Ciências Finas11251-35
Dumont # 7 - Fórceps Curvados FinosFerramentas de Ciências Finas11274-20
Serrilhado (Londres) Fórcepsde Ciências Finas11080-02
Pinças Graefe Extra Finas 1 x 2 dentesFerramentas de Ciências Finas11153-10
Tesouras de Mola MoriaFerramentas de Ciências Finas15396-00
Tesouras de Operação MédiaRoboz CirúrgicaRS-6812
Tesoura de Microdissecação Extra FinaRoboz SurgicalRS-5880
Placas de Cultura de Tecidos de 24 poçosFisher87721
Cell Strainer, 40 µ M Malha de NylonBD Biosciences352340

Referências

  1. Andreano, J. M., Cahill, L. Sex influences on the neurobiology of learning and memory. Learn Mem. 16, 248-266 (2009).
  2. Arnold, A. P., Burgoyne, P. S. Are XX and XY brain cells intrinsically different. Trends Endocrinol. Metab. 15, 6-11 (2004).
  3. Cahill, L. Why sex matters for neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 7, 477-484 (2006).
  4. Jazin, E., Cahill, L. Sex differences in molecular neuroscience: from fruit flies to humans. Nat. Rev. Neurosci. 11, 9-17 (2010).
  5. Morris, J. A., Jordan, C. L., Breedlove, S. M. Sexual differentiation of the vertebrate nervous system. Nat. Neurosci. 7, 1034-1039 (2004).
  6. Lang, J. T., McCullough, L. D. Pathways to ischemic neuronal cell death: are sex differences relevant. J. Transl. Med. 6, 33(2008).
  7. Van Den Eeden, S. K., et al. Incidence of Parkinson's disease: variation by age, gender, and race/ethnicity. Am. J. Epidemiol. 157, 1015-1022 (2003).
  8. Abel, K. M., Drake, R., Goldstein, J. M. Sex differences in schizophrenia. Int. Rev. Psychiatry. 22, 417-428 (2010).
  9. Vest, R. S., Pike, C. J. Gender, sex steroid hormones, and Alzheimer's disease. Horm. Behav. 63, 301-307 (2013).
  10. Fernandez-Guasti, A., Fiedler, J. L., Herrera, L., Handa, R. J. Sex, stress, and mood disorders: at the intersection of adrenal and gonadal hormones. Horm. Metab. Res. 44, 607-618 (2012).
  11. Hall, E. D., Pazara, K. E., Linseman, K. L. Sex differences in postischemic neuronal necrosis in gerbils. J. Cereb. Blood Flow Metab. 11, 292-298 (1991).
  12. Hawk, T., Zhang, Y. Q., Rajakumar, G., Day, A. L., Simpkins, J. W. Testosterone increases and estradiol decreases middle cerebral artery occlusion lesion size in male rats. Brain Res. 796, 296-298 (1998).
  13. Nakano, T., Hurn, P. D., Herson, P. S., Traystman, R. J. Testosterone exacerbates neuronal damage following cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation in mouse. Brain Res. 1357, 124-130 (2010).
  14. Pan, Y., et al. Effect of testosterone on functional recovery in a castrate male rat stroke model. Brain Res. 1043, 195-204 (2005).
  15. Siegel, C., Turtzo, C., McCullough, L. D. Sex differences in cerebral ischemia: possible molecular mechanisms. J. Neurosci. Res. 88, 2765-2774 (2010).
  16. Uchida, M., et al. Dose-dependent effects of androgens on outcome after focal cerebral ischemia in adult male mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 29, 1454-1462 (2009).
  17. Yang, S. H., et al. Testosterone increases neurotoxicity of glutamate in vitro and ischemia-reperfusion injury in an animal model. J. Appl. Physiol. 92, 195-201 (2002).
  18. Cheng, J., Alkayed, N. J., Hurn, P. D. Deleterious effects of dihydrotestosterone on cerebral ischemic injury. J. Cereb. Blood Flow Metab. 27, 1553-1562 (2007).
  19. Nunez, J. Sex and steroid hormones in early brain injury. Rev. Endocr. Metab. Disord. 13, 173-186 (2012).
  20. Renolleau, S., Fau, S., Charriaut-Marlangue, C. Gender-related differences in apoptotic pathways after neonatal cerebral ischemia. Neuroscientist. 14, 46-52 (2008).
  21. McCarthy, M. M., Konkle, A. T. When is a sex difference not a sex difference. Front Neuroendocrinol. 26, 85-102 (2005).
  22. Aarts, M. M., Tymianski, M. TRPMs and neuronal cell death. Pflugers Arch. 451, 243-249 (2005).
  23. Jiang, L. -H., Yang, W., Zou, J., Beech, D. J. TRPM2 channel properties, functions and therapeutic potentials. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 973-988 (2010).
  24. Jia, J., et al. Sex differences in neuroprotection provided by inhibition of TRPM2 channels following experimental stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 2160-2168 (2011).
  25. Fairbanks, S. L., et al. Mechanism of the sex difference in neuronal ischemic cell death. Neuroscience. 219, 183-191 (2012).
  26. Verma, S., et al. TRPM2 channel activation following in vitro ischemia contributes to male hippocampal cell death. Neurosci. Lett. 530, 41-46 (2012).
  27. Bai, P., Canto, C. The role of PARP-1 and PARP-2 enzymes in metabolic regulation and disease. Cell Metab. 16, 290-295 (2012).
  28. Blenn, C., Wyrsch, P., Bader, J., Bollhalder, M., Althaus, F. R. Poly(ADP-ribose)glycohydrolase is an upstream regulator of Ca2+ fluxes in oxidative cell death. Cell Mol. Life Sci. 68, 1455-1466 (2011).
  29. Buelow, B., Song, Y., Scharenberg, A. M. The Poly(ADP-ribose) polymerase PARP-1 is required for oxidative stress-induced TRPM2 activation in lymphocytes. J. Biol. Chem. 283, 24571-24583 (2008).
  30. Fonfria, E., et al. TRPM2 channel opening in response to oxidative stress is dependent on activation of poly(ADP-ribose) polymerase. Br. J. Pharmacol. 143, 186-192 (2004).
  31. Miller, B. A. Inhibition of TRPM2 function by PARP inhibitors protects cells from oxidative stress-induced death. Br. J. Pharmacol. 143, 515-516 (2004).
  32. Vagnerova, K., et al. Poly (ADP-ribose) polymerase-1 initiated neuronal cell death pathway--do androgens matter. Neuroscience. , 166-476 (2010).
  33. Yuan, M., et al. Sex differences in the response to activation of the poly (ADP-ribose) polymerase pathway after experimental stroke. Exp. Neurol. 217, 210-218 (2009).
  34. Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2496-2500 (1986).
  35. Dumesic, D. A., Renk, M., Kamel, F. Estrogenic effects of phenol red on rat pituitary cell responsiveness to gonadotropin-releasing hormone. Life Sci. 44, 397-406 (1989).
  36. Ernst, M., Schmid, C., Froesch, E. R. Phenol red mimics biological actions of estradiol: enhancement of osteoblast proliferation in vitro and of type I collagen gene expression in bone and uterus of rats in vivo. J. Steroid Biochem. 33, 907-914 (1989).
  37. Hubert, J. F., Vincent, A., Labrie, F. Estrogenic activity of phenol red in rat anterior pituitary cells in culture. Biochem. Biophys. Res. Commun. 141, 885-891 (1986).
  38. Ortmann, O., Sturm, R., Knuppen, R., Emons, G. Weak estrogenic activity of phenol red in the pituitary gonadotroph: re-evaluation of estrogen and antiestrogen effects. J. Steroid Biochem. 35, 17-22 (1990).
  39. Rajendran, K. G., Lopez, T., Parikh, I. Estrogenic effect of phenol red in MCF-7 cells is achieved through activation of estrogen receptor by interacting with a site distinct from the steroid binding site. Biochem. Biophys. Res. Commun. 142, 724-731 (1987).
  40. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Mol. Cell Endocrinol. 57, 169-178 (1988).
  41. Moreno-Cuevas, J. E., Sirbasku, D. A. Estrogen mitogenic action. III. is phenol red a "red herring"? In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 447-464 (2000).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

Determinação do Sexo de Camundongos EmbrionáriosIsolamento de Neurônios HipocampaisPrivação de Oxigênio e GlicoseInibição do Canal TRPM2Camundongos Knockout para PARP1Revestimento com Poli-D-LisinaPreparação de Meio NeurobasalPlaqueamento por Densidade CelularAnálise por Western Blot
Culturas neuronais estratificadas por sexo para estudar vias de morte celular isquêmica
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.