Artigo de método

Anticâncer metal Complexos: Síntese e Avaliação de citotoxicidade pelo ensaio MTT

DOI:

10.3791/50767

⸱

10 de novembro de 2013

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Chemistry, The Hebrew University of Jerusalem

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Um método para a síntese de titânio e vanádio anticancerígenos agentes sensíveis ao ar é descrito, juntamente com a avaliação da sua actividade citotóxica no sentido de linha de células de cancro humano por o Ensaio MTT.

Resumo

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De titânio (IV) e vanádio (V) são complexos de agentes anticancerígenos altamente potentes. Um desafio na sua síntese refere-se à sua instabilidade hidrolítica, pelo que a sua preparação deve ser conduzida sob uma atmosfera inerte. Avaliação da actividade anti-cancerígena destes complexos pode ser alcançado através do ensaio MTT.

O ensaio com MTT é um ensaio colorimétrico baseado na viabilidade de redução enzimática da molécula de MTT para formazan, quando ele é exposto a células viáveis. O resultado da redução é uma mudança de cor da molécula de MTT. As medições de absorvância em relação a um controlo de determinar a percentagem de células cancerosas remanescentes viáveis ​​após o seu tratamento com diversas concentrações de um composto de ensaio, que é traduzido para a actividade anti-cancerígena composto e os seus valores de IC 50. O MTT é amplamente comum em estudos de citotoxicidade devido à sua precisão, rapidez e simplicidade relativa.

Aqui nós preenviado um protocolo detalhado para a síntese de medicamentos à base de ar de metal sensível e de medições de viabilidade de células, incluindo a preparação de placas celulares, a incubação dos compostos com as células, medições de viabilidade usando o ensaio de MTT, e determinação dos valores de IC 50.

Introdução

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A quimioterapia ainda é um dos principais cursos de tratamentos utilizados na clínica para várias doenças cancerosas, e, assim, grande quantidade de pesquisa é conduzida em todo o mundo com o objetivo de desenvolver novas e melhores drogas anticâncer. Tais estudos principalmente começar no nível químico, com a concepção e preparação de compostos, seguido de avaliação biológica das propriedades citotóxicas in vitro. A viabilidade celular pode ser avaliada por vários ensaios que fornecem informações sobre a actividade celular 1-2.

A cisplatina é um exemplo de um complexo de platina que é largamente utilizado como um fármaco quimioterapêutico, que é considerado um tratamento eficaz principalmente para testiculares e ovarianos cancros 3-4. No entanto, a sua gama de atividade estreito e efeitos colaterais graves desencadear estudos de outros complexos de metais de transição potente 5-8. Entre outros, de titânio (IV) e vanádio (V) os complexos apresentaram resultados promissores de actividade elevada e reduzidatoxicidade 9-16. Ti (IV) foram os primeiros a entrar em ensaios clínicos após a cisplatina, devido a essas propriedades, no entanto, eles não conseguiram os ensaios devido a dificuldades de formulação e instabilidade hidrolítica. Há, portanto, uma necessidade atual para desenvolver melhores derivados destes complexos metálicos que podem combinar alta atividade anticâncer com resistência à água 15,17-21.

Um desafio para a preparação de Ti (IV) e V (V) refere-se a complexos de a instabilidade hidrolítica dos reagentes precursores e, portanto, a atmosfera inerte deve ser mantida. A preparação de Ti (IV) e V (V) os compostos é realizado sob N 2 ou Ar condições em uma caixa de luvas ou usando técnicas de linha Schlenk.

Um método comum para a avaliação da actividade anti-cancro baseia-se em MTT (3 - (4,5-dimetiltiazolil) -2,5-) ensaio. Este ensaio é um ensaio colorimétrico de viabilidade que foi apresentada, em 1983, por Mosmann22. É extremamente bem estudada e caracterizada, e considera-se altamente eficiente quando se avalia a eficácia de novos compostos citotóxicos devido à sua precisão, rapidez, e sua capacidade de ser aplicada em diversas linhas celulares. Este ensaio de viabilidade é baseado na mudança de cor da molécula MTT quando ele é exposto a células viáveis. A medição da absorbância, a qual é proporcional ao número de células viáveis ​​e, em comparação com controlos não tratados, permite a avaliação da capacidade de inibição do crescimento celular do composto testado.

O teste colorimétrico de MTT é conduzido num formato de placa de 96 poços 23. As células podem exigir pré-incubação dos poços antes da adição da droga testada. Os tempos de pré-incubação pode variar de 0-24 horas de acordo com as propriedades da linha celular. As células são normalmente expostas ao fármaco durante 24-96 horas, dependendo da actividade do fármaco. Solução de MTT é então adicionado às células tratadas, em que o gritoow MTT é reduzido a formazano púrpura por uma variedade de enzimas mitocondriais e citosólicas que são operacionais em células viáveis ​​(Figura 1) 24. A molécula de MTT não é reduzido por células mortas e células vermelhas do sangue (células metabolicamente inactivas), as células de baço (células em repouso) e linfócitos estimulados com concanavalina A (células activadas) 22. Depois de 3-4 horas de incubação com MTT os precipitados formazana. A formação do formazano começa após 0,5 horas de incubação, mas para melhores resultados, é melhor para expor as células à MTT durante pelo menos 3 h 22. Consequentemente, o meio de cultura é removido e o formazano é dissolvido num solvente orgânico, de preferência isopropanol, 25, apesar de DMSO também pode ser usado 26. A eliminação do meio é crucial para a obtenção de resultados precisos desde vermelho de fenol, que é amplamente comum em meio de crescimento, e precipitando proteínas pode interferir com a medição de absorção 25. Quando a formasolução zan atinge homogénea, a absorvância da solução é medida utilizando um espectrofotómetro leitor de microplacas. A absorvância a 550 nm é directamente proporcional ao número de células na gama de 200-50,000 células por cavidade, e, assim, quantidades muito pequenas de células pode ser detectado 22. A absorvância indica a quantidade de células viáveis ​​que permaneceram após o tratamento com a droga, e é comparada com a absorvância de células de controle que não foram expostas ao fármaco. Análise dos resultados por software apropriado proporciona a IC50 (concentração de inibição, 50%) e os seus valores com base em erros estatísticos de várias repetições da medição.

O MTT é amplamente comum em estudos de citotoxicidade para a triagem de novos compostos anti-cancerígenos, devido a sua precisão e simplicidade relativa. No entanto, quando se utiliza o ensaio de MTT, que é dependia da reacção enzimática, deve-se considerar que os vários inibidores de enzimas pode afectar a redução de MTT umd levar a resultados falsos 27. Além disso, o ensaio de MTT não fornece qualquer informação sobre o mecanismo molecular da actividade citotóxica do fármaco 2.

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Protocolo

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  1. Preparação do V (V) complexo (Figura 2); 18 conduta passos 1,1-1,4 em um porta-luvas, se um porta-luvas não está disponível, pule para a alternativa passos 2 (2,1-2,6).
    1. Dissolve-se 0,42 mmol de os ligandos H 2 L de THF seco e adiciona a uma solução em agitação de quantidades equivalentes de VO (OiPr) 3 em THF.
    2. Agita-se a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 15 min e remover os voláteis sob vácuo.
    3. Adicionar hexano frio e removê-lo sob vácuo. Um pó de cor púrpura escura deve ser obtido com um rendimento quantitativo.
    4. Pesar 8 mg do composto obtido em um frasco de Eppendorf. Ir para o passo 3.
  2. Prepare o complexo V (V) utilizando uma linha Schlenk.
    1. Dissolve-se 0,42 mmol do ligando com H 2 L de THF seco, num balão de Schlenk seco com uma tampa de septo, se ligar a uma linha de Schlenk e aplicar ambientes de vácuo / gás inerte (N2 ou Ar) alternadas, recomenda-se a aplicação de três such rodadas e esperar 2-5 minutos sobre os estágios de vácuo.
    2. Adicionar THF seco através de uma seringa através da tampa de septo.
    3. Adicionar quantidades equivalentes de VO (OiPr) 3 em uma solução de THF, o qual tinha sido preparado de modo semelhante ligando um balão de Schlenk seco adequado para a linha, a aplicação de um ambiente inerte e adicionando os reagentes através de uma seringa a partir da solução de vanádio ao do o ligando.
    4. Agita-se a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 15 min e remover os voláteis sob vácuo e, se houver um problema de produtos instáveis, executar tipo Schlenk de destilação dos produtos voláteis sob uma atmosfera inerte; utilizar o fluxo de gás inerte, para fixar o material de vidro necessário que tinha sido pré-seca .
    5. Adicionar hexano frio e removê-lo sob vácuo. Um pó de cor púrpura escura deve ser obtido com um rendimento quantitativo.
    6. Pesar 8 mg do composto obtido em um frasco de Eppendorf.
  3. Preparação do Ti (IV) (Figura 2), sendo que 28 conduta passos 3,1-3,3 em um porta-luvas, se um porta-luvas não está disponível, ajuste as etapas alternativas discutidas para o análogo de vanádio (passo 2) que empregam uma linha Schlenk vez.
    1. Dissolve-se 0,35 mmol do ligando com H 2 L de THF seco e adiciona a uma solução em agitação de quantidades equivalentes de Ti (O i Pr) 4 em THF.
    2. Agita-se a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 2 horas. Remover os voláteis sob vácuo para se obter um produto amarelo com um rendimento quantitativo.
    3. Pesar 8 mg do composto obtido em Eppendorf frasco.
  4. Preparação de células HT-29 placa de 96 poços
    1. Cultura células HT-29 em de 75 cm 2 balão com meio RPMI-1640 que contém 1% de penicilina / estreptomicina antibióticos, 1% de L-glutamina, e 10% de soro fetal bovino (FBS), a 37 ° C com 5% de CO 2 .
    2. Remova o meio quando as células HT-29 a confluência máxima (90-100%, a cada 3-4 dias sem subcultura). Lava-se com 1 mlsolução de tripsina (0,25%) / EDTA (0,05%) e removê-lo.
    3. Adicionar 1 ml de tripsina (0,25%) de solução / EDTA (0,05%) e incubar durante 5 min.
    4. Retire as células HT-29 do frasco e adicionar 10 ml do meio de desativar a atividade de tripsina. Transferir 5 ml da mistura de células para um tubo.
    5. Usar uma pipeta para transferir algumas gotas da mistura de células em câmara de contador. A câmara de contador inclui 5 x 5 quadrados.
    6. Contar as células em 5 quadrados representativos utilizando um microscópio: as quatro quadrados nos cantos e aquele que está no meio.
    7. Calcule a quantidade estimada de células presentes. Soma as células nos 5 quadrados representativos e dividir por 20.
    8. Divida 0,6 pelo resultado do passo 4.7. O número recebido é a quantidade de mistura de células é necessária por placa. Este cálculo refere-se a uma placa que contém 0,6 x 10 6 células (9000 células por poço).
    9. Use pipeta para transferir a quantidade de mistura de células necessária por pfinal (como calculado na secção 4.8) e adicionar 13,2 mL de meio (200 ul por poço × 66 poços).
    10. Adicionar a mistura a placa de 96 poços com uma pipeta de 11 canais (200 ul por poço, 6 linhas, 66 cavidades no total). Um bem de cada linha deve permanecer vazio para o controle em branco.
    11. Incubar a placa a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 24 horas para permitir que as células se fixem à placa.
  5. A inserção dos compostos
    1. Adicionar 200 mL (ou quantidade diferente de acordo com o intervalo de concentração desejada) de THF seco, a 8 mg de cada composto pesados, como descrito no passo 1.4 (ou 2,6) ou 3,3. Pesar 8 mg do ligando H 2 L, também.
    2. Diluir cada solução composto ainda pela adição de 60 mL de THF em 9 tubos Eppendorf diferentes.
    3. Com uma pipeta de 60 uL da mistura na secção 5.1 para o primeiro frasco de Eppendorf, e ressuspender a transferência de 60 uL para a próxima frasco, e assim por diante até 10 concentrações diferentes são obtained (incluindo a mistura de pai na seção 5.1).
    4. Dilui-se 20 ul de cada concentração em THF com 180 ul de meio.
    5. Prepara-se uma solução de controlo com apenas THF, 20 mL de THF, com 180 mL de meio em cada medição.
    6. Adicionar 10 ml da solução resultante (incluindo o controlo de THF), a cada poço, que já contém 200 ul da solução de células no meio acima referido para dar as concentrações finais do composto de até 200 mg / L (a gama de concentração pode ser alterado de acordo com a atividade composto).
    7. Pode observar alguma precipitação na maior concentração aplicada, dependendo da solubilidade do composto.
    8. Repetir a cada medição das 3x compostos (3 linhas na placa do mesmo composto); cada linha contém: células tratadas com o composto em 10 concentrações diferentes, uma bem contendo células tratadas apenas com dissolvente para o controlo e um poço sem células para branco controle.
    9. Incubar a placa carregada durante 3 dias a 37 ° C em 5% de CO2.
  6. Medição da citotoxicidade utilizando o teste de MTT
    1. Preparar a solução de MTT através da adição de 1 g de MTT em pó a uma solução de meio RPMI-1640 de 200 ml, sem vermelho de fenol. A solução-mãe pode ser dividido para tubos de 15 mL e armazenado em -20 ° C.
    2. Adicionar 20 ul de solução de MTT a cada poço utilizando uma pipeta de 11 canais (excepto aos poços de controlo em branco, sem as células do passo 4.10), e incuba-se a placa durante 3 horas adicionais.
    3. Remover a solução de meio de cada poço.
    4. Adicionar 200 mL de isopropanol a cada cavidade para dissolver o formazano. Agita-se a placa, durante 0,5 horas até que a homogeneidade é alcançada.
    5. Medir a absorvância a 550 nm para 200 ul da solução acima referida por um espectrofotómetro leitor de microplacas.
    6. Repita cada medida (que inclui 3 repetições, veja o passo 5.8) em 3 dias diferentes.
    7. Calcule tele percentagem de viabilidade celular, deduzindo o valor de absorvência de controlo em branco a partir do valor medido, dividindo o resultado pela absorvância do valor de controlo de solvente THF e multiplicando por 100%.
    8. Calcular os valores de IC50 utilizando o software GraphPad Prism (ou equivalente).
    9. O IC 50 é reportado a média de todos os valores de IC 50 recolhidos em, pelo menos, três dias diferentes, e o valor de erro é o desvio padrão.

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Resultados

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Os complexos foram elaboradas com base em procedimentos estabelecidos 18,28 e sua pureza pode ser avaliada por análise de RMN e elementar.

Os dados recebidos a partir do ensaio de MTT é analisada para avaliar a citotoxicidade do composto 18,21. Em primeiro lugar, a subtracção do valor de absorvência de controlo em branco a partir de todos os outros valores é realizada. Em segundo lugar, o valor de controlo de solvente THF é definida como 100% de viabilidade, como não fo...

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Discussão

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O método descrito neste manuscrito combina a síntese química, com ensaio de viabilidade de células biológicas. Tal como acontece com todos os métodos biológicos em matéria de células viáveis, é fundamental para o trabalho em uma capa laminar, e manter condições estéreis, incluindo o uso de solventes orgânicos estéreis. Além disso, a preparação e armazenamento de medicamentos à base de metal hidroliticamente instável deve ser realizado sob condições inertes, para o qual devem ser utilizadas técnicas de caixa de luvas ou ...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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O financiamento foi recebido do Conselho Europeu de Investigação no âmbito do Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (FP7/2007-2013) / ERC acordo Grant não [239603]

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagent/Material
Soro bovino fetal (FBS)Biological Industries04-007-1A
Hexano ARGadot830122313Seco usando um sistema de secagem por solvente
Linha celular HT-29ATCCHTB-38
Isopropanol ARGadot830111370
L-glutaminaBiological Industries03-020-1B
MTTSigma-AldrichM5655-1G
Antibióticos penicilina/estreptomicinaBiological Industries03-031-1B
RPMI-1640 com vermelho de fenol com L-glutaminaSigma-AldrichR8758
RPMI sem vermelho de fenolBiological Industries01-103-1A
Tetrahidrofurano (THF) ARGadot830156391seco usando um sistema de secagem por solvente
Ti(OiPr)4Sigma-Aldrich205273-500MLsensível à umidade
Trypsin/EDTABiological Industries03-052-1B
VO(OiPr)3Sigma-Aldrich404926-10Gumidade sensitive
Equipment
pipeta de 12 canais 30-300 μ lPipeta de
5-50 μ lFinnpipeta
75 cm2 frascoNUNC156472
placa de 96 poços com tampa (fundo plano)NUNC167008
CO2 Pasta da incubadoraAPT.line C150
Câmara contráriaMarienfeld-Superior650030
Frasco EppendorfKARTELL
Caixa de luvasM. Braun
Capô de fluxo laminarADS LAMINAIREOPTIMALE 12
Leitor de microplacas espectrofotômetroMicroscópio Bio-TekEl-800
Eclipse TS100
Pipeta 20-200 μ lPipeta Finnpipette
5-50 μ lFinnpipette
12 canais Thermo Scientific Nikon

Referências

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