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Um protocolo rápido para integrar matrizes extracromossômicas com alta taxa de transmissão no genoma de C. elegans

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DOI:

10.3791/50773

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9 de dezembro de 2013

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1Université Claude Bernard Lyon, 2Centre de Génétique et de Physiologie Moléculaires et Cellulaires, CNRS UMR 5534

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um procedimento rápido e de baixo consumo de material para a integração de matrizes extracromossômicas transgênicas no genoma de Caenorhabditis elegans usando irradiação ultravioleta (UV). Além disso, este protocolo é particularmente adequado para linhas transgênicas que transmitem matrizes extracromossômicas em alta taxa.

Resumo

Microinjetar DNA no citoplasma da gônada sincicial de Caenorhabditis elegans é a principal técnica utilizada para estabelecer linhagens transgênicas que exibem taxas de transmissão parciais e variáveis de arranjos extracromossômicos para a próxima geração. Além disso, os animais transgênicos são mosaicos e expressam o transgene em um número variável de células. Arranjos extracromossômicos podem ser integrados ao genoma de C. elegans usando irradiação UV para estabelecer cepas transgênicas não mosaicas com taxa de transmissão de 100% do transgene. Nessa medida, as progênies F1 de animais transgênicos irradiados com UV são rastreadas para animais portadores de uma integração heterozigótica do transgene, o que leva a uma taxa de transmissão mendeliana de 75% para a progênie F2. Um dos desafios deste método é distinguir entre a porcentagem de transmissão transgênica em uma população antes (X% de animais transgênicos) e depois da integração (≥75% de animais transgênicos F2). Assim, este método requer a escolha de uma linhagem transgênica não integrada com uma porcentagem de animais transgênicos significativamente menor que a segregação mendeliana de 75%. Consequentemente, linhagens transgênicas não integradas com uma taxa de transmissão de arranjo extracromossômico para a próxima geração ≤60% são geralmente preferidas para integração, e a integração transgênica em cepas altamente transmissoras é difícil. Aqui mostramos que a eficiência da integração de arranjos extracromossômicos no genoma é aumentada quando se utilizam linhagens transgênicas altamente transmissoras (≥80%). O protocolo descrito permite a fácil seleção de várias linhagens independentes com integração de transgenes homozigotos no genoma após irradiação UV de vermes transgênicos exibindo uma alta taxa de transmissão por arranjo extracromossômico. Além disso, este método é bastante rápido e de baixo consumo de material. A possibilidade de gerar rapidamente diferentes linhagens que expressam um transgene integrado específico é de grande interesse para estudos com foco no padrão e regulação da expressão gênica, localização e superexpressão de proteínas, bem como para o desenvolvimento de marcadores subcelulares.

Introdução

Os transgenes são amplamente utilizados em C. elegans para uma ampla gama de aplicações. As cepas transgênicas são tipicamente geradas por injeção de DNA na gônada hermafrodita sincicial1,2. O DNA que carrega o transgene de interesse é coinjetado junto com plasmídeos que codificam marcadores de coinjeção1,3,4. Os marcadores de coinjeção são transgenes estabelecidos que levam à expressão de uma proteína fluorescente ou a um fenótipo comportamental ou morfológico específico. Os DNAs injetados se reorganizam para formar matrizes extracromossômicas de múltiplas cópias; Assim, o transgene de interesse e o marcador de coinjeção são transmitidos juntos5,4. As linhagens transgênicas são selecionadas na geração F2 de animais injetados seguindo o fenótipo induzido pela expressão do marcador de coinjeção (fluorescência ou fenótipo específico)1. As linhagens transgênicas exibem taxas de transmissão parciais e variáveis das matrizes extracromossômicas para a próxima geração. Dependendo da cepa, 10-100% (100% sendo um evento raro) dos animais herdam matrizes extracromossômicas. Além disso, os animais transgênicos são mosaicos e expressam o transgene em um número variável de células. É provável que esse mosaicismo esteja correlacionado com a taxa de transmissão para a próxima geração. De fato, tanto na linha germinativa quanto nas células somáticas, a taxa de transmissão depende da segregação das matrizes extracromossômicas durante as divisões celulares. Uma maneira de evitar esse problema é integrar o transgene ao genoma. Classicamente, a integração de um transgene em um cromossomo depende da irradiação (ultravioleta ou gama) de vermes transgênicos portadores de matrizes extracromossômicas3. Resumidamente, 50-100 animais hermafroditas são irradiados no estágio larval L4. Na geração F1, 200-800 animais transgênicos são selecionados e cultivados individualmente em placas. De acordo com a segregação mendeliana, os animais transgênicos F1 portadores de uma integração heterozigótica do transgene no genoma produziriam 1/2 dos descendentes transgênicos que são heterozigotos para a matriz integrada, 1/4 dos descendentes transgênicos são homozigotos para a matriz integrada e 1/4 dos descendentes que não integraram a matriz (Figura 1). Assim, as placas contendo a geração F2 são visualmente rastreadas para ≥75% de animais transgênicos, conforme observado pela expressão do marcador de coinjeção. Cerca de 1/3 dos animais F2 selecionados para serem candidatos integrantes são considerados homozigotos para a matriz integrada e produzem 100% dos animais F3 homozigotos. Assim, de cada placa selecionada, três a oito animais transgênicos F2 são cultivados individualmente e placas com 100% de descendentes transgênicos são selecionadas. Em seguida, oito animais F3 são cultivados individualmente para confirmar a herança de 100% do transgene.

As principais desvantagens deste método são que

  1. requer uma triagem visual de várias centenas de placas F1 para ≥75% de progênie F2 transgênica, o que consome tempo devido à porcentagem variável e imprevisível de transmissão de matrizes extracromossômicas não integradas. Em alternativa, para evitar o rastreio das placas F1, podem ser realizadas várias etapas subsequentes de inanição após a irradiação dos animais P0; seguido pela escolha de 100 animais transgênicos e triagem para progênie 100% transgênica3.
  2. Não é adaptado para cepas que exibem uma porcentagem de transmissão de matriz extracromossômica superior a 60%, pois essa porcentagem é difícil de distinguir dessa porcentagem de 75%.
  3. como apenas cepas com uma taxa de transmissão relativamente baixa podem ser usadas, é necessário um alto número de animais transgênicos P0 irradiados, bem como a observação de numerosos animais F1 e F2, o que é altamente demorado e requer um número considerável de placas.

A irradiação de vermes presumivelmente induz quebras de fita dupla no DNA e a integração de matrizes extracromossômicas nos cromossomos ocorre durante o reparo do DNA. Assim, é provável que as chances de obter uma integração mediada por irradiação bem-sucedida sejam diretamente proporcionais ao número de células da linha germinativa que carregam uma matriz extracromossômica. Cepas com alta taxa de transmissão podem conter mais matrizes de DNA transgênico do que cepas com baixa taxa de transmissão, conforme sugerido em2, e exibem um número maior de células da linha germinativa carregando matrizes extracromossômicas. Assim, raciocinamos que em linhas altamente transmissoras, os transgenes podem ser mais fáceis de integrar do que em linhas com baixa taxa de transmissão. No entanto, o protocolo padrão exclui a possibilidade de integrar transgenes com alta frequência de transmissão, pois a porcentagem de animais transgênicos com uma matriz extracromossômica não integrada dificilmente pode ser distinguida da progênie de um animal F1 portador de uma integração heterozigótica do transgene no genoma (Figura 1).

Aqui mostramos que, para um transgene específico, o número de linhas integradas recuperadas após a irradiação com luz ultravioleta (UV) depende da porcentagem inicial de transmissão da matriz não integrada. Apresentamos um protocolo aprimorado para integração de transgenes mediada por irradiação UV que é particularmente relevante para linhas que exibem uma alta taxa de transmissão de matriz de transgenes.

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Protocolo

1. Cultura de nematóides transgênicos antes da integração

Linhas transgênicas podem ser geradas conforme descrito em1. Essas linhagens geralmente contêm um plasmídeo marcador de coinjeção que leva à expressão de uma proteína fluorescente ou a um fenótipo comportamental ou morfológico específico em um determinado estágio de desenvolvimento1,3. Este protocolo de integração pode ser aplicado a cepas que expressam marcadores de coinjeção fluorescentes ou não fluorescentes. No exemplo a seguir, foi utilizada uma cepa com marcador de coinjeção fluorescente.

  1. Preparar placas de cultura:
    1. Prepare cerca de 500 placas de Petri grandes de 60 mm derramadas assepticamente com 10 ml de meio de crescimento de nematóides (NGM) 6,7.
    2. Semear 0,3 ml de cultura saturada de Escherichia coli OP50 em cada placa, seguindo o procedimento padrão6,7.
  2. Avaliar a taxa de transmissão da linhagem transgênica a ser integrada:
    1. Para cada linha transgênica, escolha dez adultos grávidas fluorescentes em dez placas de cultura separadas sob um estereoscópio fluorescente usando uma picareta de minhoca, conforme descrito em7.
    2. Cultive os animais em uma incubadora de minhocas a 15-25 ° C (dependendo do histórico genético) para permitir que os vermes se reproduzam.
    3. Observe a progênie todos os dias para avaliar em qual estágio de desenvolvimento o marcador de coinjeção é expresso e pode ser melhor observado. A expressão da maioria dos marcadores de coinjeção atualmente usados é observada no estágio larval L4 ou na idade adulta.
    4. Avaliar a taxa de transmissão da progênie determinando a porcentagem de progênie fluorescente por observação sob um estereoscópio fluorescente.
  3. Escolha uma linha transgênica para integração transgênica:
    1. Selecione a linha transgênica com a maior taxa de transmissão possível (idealmente ≥80%).
  4. Obter uma população de animais transgênicos sincronizados no estágio larval L4 para integração:
    1. Escolha 30 adultos grávidas fluorescentes em cinco placas de cultura (seis animais por placa).
    2. Deixe os vermes botarem ovos por 3-4 horas a 15 °C.
    3. Elimine os adultos dos pratos após verificar a presença de pelo menos 30 ovos por prato.
    4. Cultivar os animais numa incubadora de minhocas a 15-25 °C até que a progenitura atinja a fase larvar L4 (96 horas a 15 °C ou 36 horas a 25 °C).

2. Irradiação UV e Recuperação de Vermes Transgênicos

  1. Irradiação de vermes:
    1. Escolha 30-100 animais transgênicos fluorescentes L4 em placas de cultura separadas (15-20 animais por placa).
    2. Coloque as placas, com as tampas removidas, em um reticulador UV. Irradiar os vermes a 0,012 J/cm2. Observe que as cepas são mais ou menos sensíveis aos raios UV e que os resultados podem variar dependendo do irradiador UV usado. Pode ser testada uma gama de doses entre 0,010-0,015 J/cm2.
  2. Recuperação de vermes após irradiação:
    1. Coloque as placas com vermes irradiados durante a noite a 15 °C para recuperação.
    2. Verifique o número de animais que estão vivos. Em nossas mãos, uma taxa de sobrevivência de cerca de 80-90% é adaptada para uma irradiação eficiente.
    3. Cultivar os animais irradiados a 15-25 °C até que a progenitura atinja a fase de desenvolvimento, permitindo a observação da expressão do marcador de coinjecção, conforme estabelecido na fase 1.2.

3. Isolamento de Linhagens Transgênicas Integradas

  1. Seleção de animais F1:
    1. Um único animal F1 fluorescente 150-200 em placas de cultura separadas. Para linhas altamente transmissoras (≥80%), 100 animais F1 são suficientes.
    2. Manter estas placas F1 a 15-25 °C até que a progenitura atinja uma fase adequada para a observação de animais fluorescentes F2.
    3. Rejeitar todas as placas F1 que apresentem i) ausência de progenitura, indicando que o animal F1 era estéril ou morreu, ou ii) ausência ou apenas alguns animais fluorescentes F2, indicando que o animal F1 não transmitiu o transgene à taxa esperada. Esta etapa é rápida e representa uma vantagem real quando comparada ao protocolo padrão que requer uma estimativa da porcentagem de vermes fluorescentes F2 para selecionar placas F1 exibindo ≥75% de progênie fluorescente (Tabela 1).
  2. Seleção de animais F2:
    1. Um único quatro animais F2 transgênicos fluorescentes de cada placa F1 selecionada. Ao usar transgenes fluorescentes (por exemplo, mCherry8, gfp9 ou dsRed10), escolha vermes F2 com alto nível de fluorescência, pois isso pode indicar que esses animais são homozigotos para a matriz integrada. Observe que, ao escolher animais F2, é fundamental não carregar ovos ou larvas, a fim de evitar falsos negativos na próxima etapa.
    2. Cultive animais F2 a 15-25 °C.
  3. Isolamento e validação de cepas transgênicas integradas:
    1. Filtre as placas F2 para vermes F3 transgênicos 100% fluorescentes. A tela é bastante rápida, pois a presença de um único verme não fluorescente indica que a placa deve ser jogada fora. Um animal homozigoto F2 para o transgene integrado dará uma progênie fluorescente 100% homozigótica.
    2. Oito animais fluorescentes F3 de placas selecionadas para confirmar a herança de 100% do transgene. Em teoria, escolher um animal é suficiente nesta etapa. No entanto, a escolha de oito animais fluorescentes F3 pode ser necessária para evitar a seleção de animais não férteis ou insalubres, pois a irradiação pode induzir aleatoriamente mutações que afetam genes importantes para a fisiologia do verme.
    3. Se possível, manter várias estirpes transgénicas integradas independentes, ou seja, estirpes recuperadas de diferentes animais F1.

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Resultados

Realizaram-se integrações de transgenes em duas linhagens diferentes que transmitem arranjos extracromossômicos com frequência aproximadamente igual (50-60%) utilizando os protocolos padrão e aprimorado (Tabela 1). O protocolo padrão permitiu a obtenção de três linhagens integradas independentes após irradiação com UV de 91 animais transgênicos em estágio L4, enquanto o protocolo aprimorado permitiu a obtenção de uma linhagem integrada após irradiação com UV de 30 animais transgênicos em estágio L4. Isso...

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Discussão

O protocolo descrito aqui fornece um método eficiente para integrar matrizes transgênicas extracromossômicas no genoma de C. elegans. Usando diferentes linhagens não integradas, que transmitiram o mesmo transgene Pdyc-1::d yc-1::gfp (pKG45) em diferentes taxas (10-15%, 50-60% e >80%), mostramos que o número de cepas integradas recuperadas após a irradiação UV é dependente do nível inicial de transmissão da linhagem não integrada (Tabela 2). Portanto, os transgenes são mais fáceis de int...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesse financeiro conflitante.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Claire Lecroisey e Laurent Ségalat por gerarem Pdyc-1::d yc-1::gfp não integrado; Cepas transgênicas Pmyo-2::d sRed e Pmyo-3::gfp. Agradecemos a Andy Fire pelo presente do plasmídeo Pmyo-2::d sRed e a Pamela Hoppe pelo presente do plasmídeo Pmyo-3::gfp. Este trabalho foi fundado pelo Centro Nacional Francês de Pesquisa Científica (CNRS) e pela Universidade Claude Bernard de Lyon.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
ÁgarProlabo20768.292para preparação de NGM (meio de crescimento de nematóides) (6,7)
NaClChimie-Plus40045para preparação de NGM
BactopeptonaBD211820para preparação de NGM
KH2PO4Roth3904-1para preparação de NGM
K2HPO4Prolabo26930.293para preparação NGM
MgSO4RothP027.2para preparação NGM
CaCl2Prolabo22317.297para preparação NGM
ColesterolRectapurpara preparação NGM
LB-caldoSigmaL3022para cultura de OP50 bactérias
EQUIPAMENTO
Reticulador UVFischer ScientificWavelength 254 nm
Microscópio SteREO Discovery V8Carl Zeiss, Inc.
Placas de Petri, 60 mmCMLBPS55E6
Fio de platina 0,25 mmAlfa Aesar7440-06-4Para fazer uma picareta para minhocas (7)

Referências

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