Demonstramos um ensaio de PCR multiplex simples para triagem e tipagem rápidas de Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) tipos I-V para Staphylococcus aureus resistente à meticilina e fornecemos algumas das etapas vitais e nuances processuais que o tornam bem-sucedido na adaptação deste ensaio a laboratórios individuais.
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Artigo de método
Multiplex PCR Ensaio para a digita
Neste artigo
Aviso de errata
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Resumo
Introdução
Staphylococcus aureus resistente
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Protocolo
Esses procedimentos devem ser realizados em um n
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Resultados
Este M-PCR atualizado é capaz de determinar (classificar) os tipos I-V de SCCmec, bem como os principais subtipos de SCCmec IV. O ensaio tem como alvo locos únicos e específicos de SCCmec I, II, III, IVa, IVb, IVc, IVd, IVE e V, com detecção concomitante do gene mecA. A identificação preliminar de SCCmec VI e VIII também é possível, mas exigiria testes adicionais para confirmação. Figura 3 ilustra representações típicas de SCCmec I-VI e VIII e as loca...
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Discussão
O ensaio de PCR multiplex descrito aqui fornece um método simples e confiável para classificar os tipos e subtipos principais de SCCmec I-V em estafilococos, com discriminação simultânea de MRSA de MSSA. O ensaio é robusto, convenientemente feito em uma única reação de PCR e os resultados são fáceis de interpretar. O ensaio tem limitações, pois tem como alvo loci individuais dentro de cada tipo demec SCC, mas não oferece tipagem abrangente de ccr e mec complexa e, portanto, não pode se...
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos a T. Ito, K. Hiramatsu, R. Daum, H. de Lencastre e D. Coleman pelo gentil presente de algumas cepas de referência usadas neste estudo. Este trabalho foi em parte apoiado financeiramente pelo Centro de Resistência Antimicrobiana (CAR), Alberta Health Services-Calgary/Calgary Laboratory Services/University of Calgary.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ágar Soja Tríptico | Fisher (BD) | CA90002-700 (236920) | |
| Água destilada estéril | Life Technologies | 10977-015 | |
| Platinum Taq: incluindo tampão PCR 10x e 50 mM MgCl2 | Life Technologies | 10966-034 | |
| 100 mM dNTP | Life Technologies | 10297-018 | |
| Base Tris | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Ácido bórico | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| EDTA | Life Technologies | 15576-028 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Glycerol | Life Technologies | 15514-011 | |
| Azul de bromofenol | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| 1Kb + DNA | ladder Life Tecnologias | 10787-026 | |
| Brometo de etídio | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| 1.5ml Tubos de microcentrífuga | VWR (Axygen Scientific) | 10011-700 | |
| Varetas de cultura | VWR | CA10805-018 | |
| Tubos PCR | Diamed | AD0210-FCN (novo #: DIATEC420-1250) | |
| Centrífuga | Eppendorf | 5417c | |
| Bloco de calor | VWR | 13259-030 / 13259-286 | |
| Thermalcycler | Applied Biosystems (2720) | 4359659 | |
| Câmara de eletroforese em gel horizontal submersível com molde de gel | BioRad | 170-4469 | |
| Fonte de alimentação | BioRad | 164-5050 | |
| Agitador basculante | VWR | 40000-300 | |
| Molecular Imager Gel Doc System | BioRad | 1708170 |
Referências
- IWG-SCC. Classification of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec): guidelines for reporting novel SCCmec elements. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 4961-4967 (2009).
- Ito, T., Hiramatsu, K., Tomasz, A., de Lencastre, H., Perreten, V., Holden, M., et al. Guidelines for Reporting Novel mecA Gene Homologues. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (10), 4997-4999 (2012).
- Okuma, K., Iwakawa, K., Turnidge, J. D., Grubb, W. B., Bell, J. M., O'Brien, F. G., et al. Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community. Journal of Clinical Microbiology. 40 (11), 4289-4294 (2002).
- Kondo, Y., Ito, T., Ma, X. X., Watanabe, S., Kreiswirth, B. N., Etienne, J., et al. Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (1), 264-274 (2007).
- Oliveira, D. C., de Lencastre, H. Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (7), 2155-2161 (2002).
- Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (9), 3374-3377 (2007).
- Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: 'SCCmec IV multiplex'. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (1), 42-48 (2007).
- Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Louie, T., Conly, J. M. Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal of Clinical Microbiology. 43 (10), 5026-5033 (2005).
- Zhang, K., McClure, J. A., Conly, J. M. Enhanced multiplex PCR assay for typing of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Molecular and Cellular Probes. 26 (5), 218-221 (2012).
- de Lamballerie, X., Zandotti, C., Vignoli, C., Bollet, C., de Micco, P. A one-step microbial DNA extraction method using "Chelex 100" suitable for gene amplification. Research in Microbiology. 143 (8), 785-790 (1992).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).
- McClure, J. A., Conly, J. M., Elsayed, S., Zhang, K. Multiplex PCR assay to facilitate identification of the recently described Staphylococcal cassette chromosome mec type VIII. Molecular and Cellular Probes. 24 (4), 229-232 (2010).
- Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Conly, J. M. Novel staphylococcal cassette chromosome mec type, tentatively designated type VIII, harboring class A mec and type 4 ccr gene complexes in a Canadian epidemic strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 531-540 (2009).
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
Posted by JoVE Editors on 3/19/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. There was a typo in Table 1.
In Table 1, the Oligonucleotide sequence for Type III-F5 was updated from:
TTCTCATTGATGCTGAAGCC
To:
GAAACTAGTTATTTCCAACGG
