Um método de quantificação sensível e específico para Determinação do Serum miosina cardíaca Binding Protein-C por Imunoensaio electroquimioluminescência

Resumo

Biomarcadores de medição em amostras biológicas complexas é cada vez mais guiando tomada de decisão clínica. Nós descrevemos um método altamente sensível para medir simultaneamente miosina cardíaca binding protein-C, MB da creatina quinase e troponina I em amostras de soro de pacientes com infarto do miocárdio e controle de indivíduos saudáveis.

Resumo

Biomarcadores são cada vez mais importante na tomada de decisão clínica, bem como a ciência básica. Diagnóstico de enfarte do miocárdio (MI) é amplamente determinado por detecção de proteínas cardíacas específicas no soro ou plasma do paciente, como um indicador de lesão do miocárdio. Tendo recentemente demonstrado que a proteína de miosina cardíaca-C (cMyBP-C) é detectável no soro após o IM, propusemos como um biomarcador potencial de MI. Os biomarcadores são tipicamente detectados por sandwich enzyme-linked immunosorbent tradicionais. No entanto, esta técnica requer um grande volume de amostra, tem uma pequena gama dinâmica e pode medir apenas uma proteína de cada vez.

Aqui, mostramos um imunoensaio multiplex no qual três proteínas cardíacas pode ser medida simultaneamente com elevada sensibilidade. Medindo cMyBP-C em Uniplex ou em conjunto com creatina quinase MB e troponina I apresentaram sensibilidade comparáveis. Esta técnica utiliza a Meso Scale Descoberta(MSD) método de multiplexação de uma placa de 96 poços juntamente com electroquimioluminescência para a detecção. Enquanto apenas pequenos volumes de amostra são necessários, elevada sensibilidade e uma grande gama dinâmica são alcançados. Usando esta técnica, medimos cMyBP-C, MB da creatina quinase e os níveis de troponina I em amostras de soro de 16 pacientes com IAM e compararam os resultados com 16 indivíduos de controle. Fomos capazes de detectar todos os três marcadores nestas amostras e encontrou os três biomarcadores para ser aumentado após o IM. Esta técnica é, portanto, adequado para a detecção sensível de marcadores cardíacos em amostras de soro.

Introdução

A medição de baixas quantidades de proteína em amostras biológicas complexas, tal como o soro, é de crescente importância para a gestão clínica do paciente, assim como a ciência básica. Por exemplo, um aumento dos níveis séricos de marcadores cardíacos, tais como a troponina I, num ambiente clínico é consistente com enfarte agudo do miocárdio (MI) ^1. Para detectar proteínas em amostras de soro, padrão de ensaio imunoenzimático (ELISA), é a técnica utilizada na maioria das vezes, uma vez que tem uma elevada sensibilidade e permite a quantificação absoluta de analito. No entanto, os testes ELISA tradicionais exigem uma quantidade relativamente grande de amos....

Protocolo

1. Uniplex cMyBP-C Assay

1. Um dia antes do experimento, casaco da placa padrão nu 96 poços MSD com anticorpo de captura. Para cMyBP-C, usar um volume il de 30 de rato anticorpo anti-cMyBP-C monoclonal (gelatina livre), a uma concentração de 5 ug / ml diluído em tampão fosfato salino (PBS).
2. Uma vez que o poço é hidrofóbico, pipetar a solução para o canto inferior do poço; toque os lados da placa para espalhar a solução ao longo de todo o poço.
3. A placa é coberta com um selante de placa e incubadas O / N a 4 ° C sem agitação.
4. Remover a solução de anticorpo de captura tocando a solução ao longo de um lavatório e, em seguida, sobre u....

Resultados

Os princípios básicos e fluxo de trabalho do ensaio 3-Plex são mostrados na Figura 1, e o fluxo de trabalho geral está descrito na Tabela 1. Ensaios UNIPLEX trabalhar ao longo do mesmo princípio, excepto que toda a parte inferior também é revestida com um anticorpo de captura. A detecção do sinal é feito por ECL em que um sinal eléctrico é aplicado à parte inferior do poço. Isto, por sua vez, inicia uma produção local de luz através de uma reacção química da leitura de tampão, com o rót.......

Discussão

Neste estudo, mostra a aplicabilidade de um imunoensaio multiplex para a detecção de múltiplos marcadores cardíacos no soro de pacientes. Esta técnica tem inúmeras vantagens sobre ELISA tradicional. Primeiro, ECL no kit de ensaio é utilizado em vez de detecção colorimétrica. Em ECL, um sinal eléctrico estimula a produção local de propriedade medida (de luz), desacoplando assim o evento estimulação do sinal, o que reduz o fundo ^14. Isto permite uma elevada sensibilidade, como pode ser visto na Tabela 2.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagents
MSD Read-Buffer T (4X) com surfactante	Meso Scale Discovery	R92TC-2
Tween-20	Acros	9005-64-5
Bloqueador MSD A	Meso Scale Discovery	R93BA-1
Solução salina tamponada com fosfato, 10X	Fisher BioReagents	BP399-4	Filtro antes do uso
Anticorpo de proteína C de ligação à miosina, monoclonal de camundongo (E7), livre de gelatina	Santa Cruz	SC-137180L	Para revestimento, o anticorpo tem que ser livre
Placas e Equipamentos
Multi-Array Placa padrão de 96 poços	Meso Scale Discovery	L15XA-3
Um protótipo de placa de 3 plex, quatro pontos e 96 poços com cMyBP-C, cTnI e CK-MB	Meso Scale Discovery	N452A-1
Filme de vedação ThermaSeal	Life Science Products Inc.	ST-3098
MSD SECTOR Imager 2400A	Descoberta de Escala		Mesológica
Agitador de microtitulação digital MTS 2/4	IKA	3208001