Artigo de método

Cultivar e Manter

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DOI:

10.3791/50787

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14 de setembro de 2013

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Emory University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Clostridium difficile é uma bactéria patogênica que é um anaeróbio estrito e causa diarreia associada a antibióticos (DAA). Aqui, os métodos para o isolamento, a cultura e manter C. As células vegetativas difficile e esporos são descritos. Essas técnicas necessitam de uma câmara de anaerobiose, o que requer uma manutenção regular para garantir condições adequadas para melhor C. cultivo difficile.

Resumo

Clostridium difficile é um, anaeróbico, esporogênico bactéria Gram-positiva que é a principal responsável pela diarreia associada a antibióticos (DAA) e é um agente patogénico nosocomial significativa. C. difficile é notoriamente difícil de isolar e cultivar e é extremamente sensível ao mesmo níveis baixos de oxigênio no ambiente. Aqui, os métodos para isolar C. difficile em amostras de fezes e subsequentemente cultura C. difficile para a preparação de ações de glicerol para o armazenamento de longo prazo são apresentados. As técnicas para a preparação e enumerando estoques de esporos em laboratório para uma variedade de aplicações a jusante, incluindo estudos de microscopia e animais, também são descritos. Essas técnicas necessitam de uma câmara de anaerobiose, que mantém um ambiente anaeróbico consistente para assegurar condições adequadas para melhor C. crescimento difficile. Nós fornecemos protocolos para a transferência de materiais dentro e fora da câmara sem causando contaminação significativa de oxigênio, juntamente com sugestões para a manutenção regular necessária para sustentar o ambiente anaeróbico adequado para eficiente e consistente C. cultivo difficile.

Introdução

Clostridium difficile é uma bactéria formadora de esporos, Gram-positiva que é um anaeróbio obrigatório e um agente patogénico gastrointestinal potencialmente fatal dos seres humanos e animais. Inicialmente descrita em 1935 como um organismo comensal encontrada em amostras de fezes de recém-nascidos 1, C. difficile foi mais tarde demonstrado ser o agente causador de colite pseudomembranosa associada ao tratamento com antibióticos 2. C. infecções difficile (CDI) são tipicamente precedido por tratamento com antibióticos, que resulta na interrupção da flora do cólon normais, criando um nicho para C. difficile prosperar 2. C. difficile é transmitida como um esporo dormente através da via fecal-oral e, posteriormente, germina no interior do trato gastrintestinal, produzindo células vegetativas capazes de gerar diversas toxinas e causar doença grave e colite 3. CDI são muitas vezes refractária aos tratamentos convencionais e estes emperfeições são freqüentemente recorrentes 4. Como resultado, o CDI é responsável por até US $ 4,8 bilhões em custos de saúde nos Estados Unidos 5-7.

O C. difficile é muito sensível mesmo a baixos níveis de oxigénio no ambiente. Para C. difficile a persistir no meio ambiente e ser eficientemente transmitida de um hospedeiro para outro, a formação de um esporo metabolicamente inativas é fundamental 8. Porque a manutenção de laboratório e manipulação de C. difficile requer um ambiente anaeróbio controlada, estas técnicas requerem a utilização de uma câmara anaeróbica. O uso de câmaras anaeróbias resultou num aumento da recuperação e isolamento de anaeróbios obrigatórios 9-11, e permitiu que um número de técnicas de biologia molecular para ser realizado em uma atmosfera anaeróbia.

Além C. difficile, o uso da câmara anaeróbia e manutenção descritas aqui são aplicáveispara outros anaeróbios obrigatórios, como outras espécies Clostridium (por exemplo, C. perfringens), outras espécies gastrointestinais (por exemplo, espécies de Bacteroides 12) e patógenos periodontais (por exemplo, espécies Peptostreptococcos 13).

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Protocolo

Nota: C. difficile é um agente patogénico humano ou animal, que pode causar a doença gastrointestinal. Experimentos envolvendo C. difficile deve ser realizada com medidas de biossegurança adequadas (BSL-2).

1. Anaerobic Câmara Uso e Manutenção

O C. difficile é um anaeróbio estrito e é extremamente sensível mesmo a baixas concentrações de oxigénio na atmosfera. Portanto, um ambiente anaeróbio controlada é necessária para a sua manipulação com sucesso. A utilização de uma câmara anaeróbica (Figura 1A) proporciona o ambiente mais estável e as condições ideais para a cultura eficaz de C. difficile e outras bactérias anaeróbicas 14. Aqui, numa atmosfera contendo uma mistura de gás (5% de CO 2, 10% de H 2, 85% N 2) pode ser mantida de forma estável.

Para apresentar todos os itens para a câmara sem contaminação significativa de oxigênio,uma câmara de vácuo devem ser usadas (Figura 1B). Este dispositivo funciona como um intercâmbio de gás e funciona automaticamente, semi-manual ou manualmente. A câmara de vácuo tem duas portas: uma que dá acesso ao lado de fora da câmara de compressão e o outro fornecendo acesso ao interior da câmara de anaerobiose. Dependendo do modelo, a câmara pode ter uma porta adicional, que pode oferecer acesso a uma câmara de anaerobiose adjacente, economizando assim o custo de uma câmara separada. A menos que os itens dentro ou fora da câmara movendo ativamente, ambas as portas devem permanecer fechadas em todos os momentos para evitar a contaminação de oxigênio. A câmara possui um botão liga / desliga na parte frontal e um painel contendo quatro botões. As linhas de gás e mangueira da bomba de vácuo está ligada na parte de trás da câmara de ar, próximo do painel, onde os interruptores para a operação manual completa da unidade estão localizados. Recomenda-se que dois ciclos de purga, a utilização de gás de azoto (N 2), são usados antes de encher o intercâmbio com mistura de gás (5% de CO 2, 10% de H 2, 85% N 2), para reduzir a quantidade de oxigénio introduzida no interior da câmara. Também é importante para não deixar qualquer porta aberta durante mais tempo do que o tempo total necessário para mover itens dentro e para fora do intercâmbio e planejar cuidadosamente experimentos para reduzir a freqüência de mover itens dentro e para fora da câmara. Os diferentes procedimentos operacionais para câmaras anaeróbias vinil são descritos abaixo. Antes de seguir estes protocolos, assegurar que estas sejam compatíveis com as instruções do fabricante fornecidas com a câmara.

  1. Modo Automático
    Este é um modo programável e personalizável e é realizada inteiramente pela câmara. Para programar a câmara, consulte as instruções do fabricante. Um programa recomendado para entrada típica para a câmara envolve dois ciclos de purga usando gás nitrogênio seguido de recarga a câmara com uma mistura de gases que se aproxima a atmosfera mantida dentro da chamber. Durante cada ciclo de vácuo, os procedimentos industriais padrão sugerem que puxa um vácuo de 20 Hg e purgar a 1 Hg.
    1. Certifique-se de que a porta da câmara interna é totalmente fechado.
    2. Abra a porta da câmara exterior.
    3. Coloque os itens em câmara e fechar a porta câmara exterior. Se a introdução de líquidos, retire as tampas no meio do caminho para garantir a troca gasosa eficiente. Embalagens e recipientes fechados deve ser aberto antes de começar o ciclo, abstendo-se de fazê-lo pode entortar e danos plasticware e containers. Para manter a esterilidade, abra os pacotes suficientes para permitir que apenas a troca gasosa eficiente.
    4. Pressione o botão Iniciar.
    5. Aguarde até que a câmara tem um ciclo através do programa eo visor apresenta "Anaeróbica".
    6. Abra a porta câmara interior.
    7. Mover itens para a câmara.
    8. Feche a porta interior.
  2. Modo Semi-manual
    Este modo pode ser usado quando se desloca itens dentro ou para fora da câmara, e é necessário, quando cycling o gás no interior da câmara é necessária.
    1. Certifique-se de que a porta da câmara interna é totalmente fechado.
    2. Abra a porta da câmara exterior.
    3. Coloque os itens em câmara e fechar a porta câmara exterior. Se a introdução de líquidos, retire as tampas no meio do caminho para garantir a troca gasosa eficiente. Pacotes fechados, tais como ansas de inoculação e as placas de 96 poços, tem de ser aberto antes de se iniciar o ciclo.
    4. Prima Menu.
    5. Press Start. A câmara irá mostrar a função de cada botão e não responderá até que isso seja concluído:
      • Seta para cima: ativa a bomba de vácuo.
      • Seta para baixo: inicia o nitrogênio (expurgo) fluxo de gás.
      • Início: inicia o fluxo de mistura de gás.
      • Menu: retornar à tela padrão.
    6. Pressione o botão "Up", a remoção de gás da câmara, até que seja exibido 20 inHg.
    7. Pressione o botão "Down", enchendo a câmara com nitrogênio, até que o display lê menos de 1 inHg. Não overshoot, pois isso irá criar uma pressão positiva dentro da câmara de vácuo, que pode afetar a sua integridade.
    8. Repita os passos 6 e 7 para executar um ciclo de purga adicional.
    9. Pressione o botão "Up" até que seja exibido 20 inHg.
    10. Pressione o botão "Iniciar", enchendo o intercâmbio com mistura de gás, até que o display lê menos de 1 inHg.
    11. Abra a porta câmara interior.
    12. Mover itens para a câmara.
    13. Feche a porta interior.
  3. Modo Manual
    Este modo pode ser usado sempre que os modos automáticos ou semi-manuais não estão funcionando ou não há energia para a câmara. Este modo não funcionar quando a câmara está em, portanto, é difícil de determinar a pressão no interior da câmara de vácuo. Porque o vácuo puxa e os tempos de purga de gás depende de taxas de vácuo e fluxo de gás, respectivamente, o uso de um medidor de pressão dentro do intercâmbio é necessário para controlar a pressão e reduzir o risco de danos pessoais e danos na câmara.
    1. Certifique-se de que a porta da câmara interna é totalmente fechado.
    2. Abra a porta da câmara exterior.
    3. Coloque itens, incluindo o medidor de pressão, em câmara de vácuo e feche a porta câmara exterior. Se a introdução de líquidos, retire as tampas no meio do caminho para garantir a troca gasosa eficiente. Pacotes fechados, tais como ansas de inoculação e as placas de 96 poços, tem de ser aberto antes de se iniciar o ciclo.
    4. Localize os três interruptores na parte de trás da câmara denominada "Chaves de Controle Manual". Estes são rotulados individualmente como:
      • Para Vácuo
      • Nitrogênio
      • Mix Gas
    5. Acione o interruptor para aspirar alternância até o medidor de pressão lê aproximadamente 20 inHg.
    6. Virar o interruptor de nitrogênio até que o manômetro lê aproximadamente 1 inHg.
    7. Acione o interruptor para aspirar alternância até o medidor de pressão lê aproximadamente 20 inHg.
    8. Virar o interruptor de nitrogênio até que o manômetro lê aproximadamente 1 inHg.
    9. Acione o interruptor para aspirar alternância até o medidor de pressão lê aproximadamente 20 inHg.
    10. Virar o interruptor Mix gás até que o medidor de pressão lê aproximadamente 1 inHg.
    11. Abra a porta câmara interior.
    12. Mover itens para a câmara.
    13. Feche a porta interior.

2. A cultura, enumerando e Armazenamento C. difficile a partir de amostras de fezes

Este procedimento destina-se a recuperar C. difficile a partir de amostras fecais contendo esporos e, posteriormente, manter colônias isoladas como as células vegetativas ou esporos em armazenamento a longo prazo como ações de glicerol. Em alternativa, este processo pode ser usado para enumerar o número de C. presente difficile em amostras de fezes (por exemplo, de estudos em animais). Para seletivamente e diferencialmente para enriquecer C. difficile, taurocolato-cefoxitina-frutose cicloserina-agar (TCCFA) é usado para inibir o crescimento da flora fecal normais 15-16. A cicloserina é bacteriostática para as bactérias Gram-negativas, enquanto cefoxitina inibe mais amplamente o crescimento de bactérias Gram-negativas e positivas, com a excepção de C. difficile e mais entrar cepas cocos. Um indicador de pH, de vermelho neutro, pode ser incluída no meio, como a fermentação de frutose resultarão numa diminuição do pH e uma subsequente mudança de cor do vermelho / laranja para amarelo. Para recuperar eficientemente esporos de C. difficile como bactérias vegetativas, o taurocolato de sódio sal de bile é utilizado para induzir a germinação 17-18. Porque C. difficile forma esporos, o álcool ou o tratamento térmico de amostras pode ser utilizada para reduzir ou eliminar as células vegetativas, limitar o crescimento de contaminantes flora, o que pode aumentar a eficiência de C. recuperação difficile 19. Como mencionado acima, é fundamental para a pré-reduzir todas as placas durante pelo menos 1-2 horas na câmara anaeróbica antes da utilização para assegurar a remoção do oxigénio residual. Secagem de arng as placas antes da utilização na câmara pode reduzir a condensação. O meio líquido pode necessitar de até 24 horas para reduzir dependendo do volume e da proporção superfície-de-ar do recipiente utilizado.

Antes de começar, os seguintes itens devem ser colocados na câmara anaeróbia:

  • Amostra de fezes
  • Compressas estéreis
  • Loops de inoculação estéril
  • 1x PBS (ver Materiais)
  • Placas TCCFA (veja Materiais)
  • BHIS (Brain Heart Infusion meio com extrato de levedura) placas e caldo (veja Materiais)
  • Glicerol a 50% (esterilizada)
  • 10% de L-cisteína (esterilizada)
  • Frascos de armazenamento criogênico

* Alternativamente, as colónias isoladas podem ser espalhadas em placas de agar BHIS, e subsequentemente raspadas e ressuspensas em meio líquido BHIS com glicerol a 15% para o armazenamento a longo prazo a -80 ° C. ** É importante notar que a coloração de Gram não é uma estratégia eficaz para identificar C. difficile diretamente de amostras de fezes 23 ; C. difficile deve primeiro ser isolado a partir de outros flora presente nas fezes.

  1. Ressuspender a amostra de fezes em 1x PBS (este pode ser realizado em condições aeróbicas), e assegurar que a amostra de fezes é totalmente ressuspenso em PBS 1x com vórtex. Se enumerar C. difficile das fezes, pesar a amostra de fezes antes da adição de PBS 1x.
  2. Faça diluições em série das amostras de fezes ressuspenso em 1x PBS para o isolamento ou enumeração apropriado de unidades formadoras de colônia (UFC) por grama de fezes.
  3. Utilizando uma técnica asséptica, aplicar 100 ml de cada diluição em série de placas TCCFA.
  4. Usando uma série de laços de inoculação estéril, raia da cultura aplicado para colónias isoladas ou espalhar uniformemente a cultura aplicado sobre a superfície da placa TCCFA por enumeração de colónias.
  5. Incubar a placa anaerobicamente durante 48 horas a 37 ° C. É possível detectar e identificar C. difficile colónias dentro de 24 horas com base nao irregular, aparência plana, em vidro fosco das colônias 15, apesar de identificação mais precisa e enumeração é alcançado após 48 horas.
  6. Usando loops de inoculação estéreis, subcultura quaisquer colônias que parecem ser C. difficile em pré-reduzidos placas de agar BHIS, suplementado com 0,03% de L-cisteína 20. Escolha uma colônia individual, e raia para a placa em quadrantes, utilizando um novo ciclo de inoculação estéril para cada quadrante, para obter colônias isoladas. Alternativamente, contar o C. difficile colónias de cada diluição (este pode ser realizado em condições aeróbicas), e calcular o número de unidades formadoras de colónias por grama de amostra de fezes.
  7. Confirme C. identificação difficile através coloração de Gram. Após a coloração de Gram, C. difficile aparecerá como hastes roxas e algumas células podem conter endospores terminais. Reacção em cadeia da polimerase (PCR), a identificação dos genes que codificam a toxina B pode proporcionar uma confirmação adicionalcepas toxigênicas de C. difficile 21 enquanto digitação seqüência multilocus (MLST) é bem-sucedida para a identificação e tipagem de cepas precisas desconhecidas e nontoxigenic de C. difficile 22.
  8. Para manter um estoque de C. difficile a -80 ° C, escolher um indivíduo, isolado de colónias da placa de agar BHIS usando uma ansa de inoculação estéril e ressuspender a colónia em 10 ml de BHIS pré-reduzidos meio líquido suplementado com 0,03% de L-cisteína. *
  9. Incubar durante a noite em condições anaeróbias a 37 ° C, ou até que a cultura se torna turva.
  10. Adicionar 333 ul de glicerol a 50% e 666 ul da C. difficile cultura para um tubo de 1,8 ml criogénico para criar um stock de glicerol de 15% da estirpe isolada.
  11. Tapar bem o tubo criogênico, misture bem e retire imediatamente as ações da câmara anaeróbia e coloque em um congelador -80 ° C para armazenamento de longo prazo.

3. Cultivar C. difficile de Stocks Congelado glicerol

Este procedimento prevê recuperação de C. difficile de estoques de glicerol armazenada a -80 ° C. Porque os ciclos de congelamento e descongelamento repetidos podem matar as células vegetativas, é importante para manter os stocks de glicerol congelado em todos os momentos. Nós não recomendamos o uso de gelo seco para a transferência de tensões dentro e fora da câmara como a evaporação de gelo seco podem mudar o ambiente dentro da câmara. Em vez disso, recomendamos o uso de racks de refrigeração congelados para manter os estoques de glicerol congelados durante o transporte. Para várias finalidades selectivos e diferenciais, três meios são vulgarmente utilizados para a cultura de C. difficile. TCCFA, como discutido acima, é selectiva para C. difficile e contém taurocolato de sódio, um germinativo. Infusão de cérebro e coração suplementado com extracto de levedura (BHIS) é um, com meio de enriquecimento normalmente utilizados, não selectivo que permita o crescimento de uma grande variedade de organismos (Figura 2A) 24. Freqüentemente, L-cisteínae é adicionado à BHIS como um agente redutor 20. Finalmente, a adição de sangue para o meio (Figura 2B) permite a esporulação mais eficiente do que em TCCFA e fornece para a detecção da fluorescência esverdeada ou chartreuse única exibiu por C. difficile sob luz ultravioleta de onda longa (UV) 15 (Figura 2C). Quando cultura C. difficile de estoques de esporos, é importante lembrar que o taurocolato de sódio deve ser adicionado ao meio para assegurar a germinação.

Antes de começar, os seguintes itens devem ser colocados na câmara anaeróbia:

  • Estoque de glicerol congelado (em rack de arrefecimento)
  • Loops de inoculação estéril
  • Placas TCCFA ou BHIS (veja Materiais)
  • BHIS caldo (veja Materiais)
  • Glicerol a 50% (esterilizada)
  • Frascos de armazenamento criogênico
  1. Coloque o estoque de glicerol congelado de C. difficile num suporte de arrefecimento que foi armazenado a -80 ° C prior a usar para prevenir o descongelamento.
  2. Trazer o estoque de glicerol congelado em gelo seco na câmara anaeróbia.
  3. Utilizando uma técnica asséptica e uma ansa de inoculação estéril, colocar uma pequena quantidade do material sobre a placa e riscam um quadrante da placa.
  4. Gire a placa de 90 ° e, usando um novo loop inoculação estéril, continuar a raia em todo o segundo quadrante.
  5. Repetir para os terceiro e quarto quadrantes para assegurar o isolamento de colónias individuais.
  6. Imediatamente remover o stock de glicerol congelado da câmara anaeróbica e retornar para o -80 ° C.
  7. Incubar a placa durante a noite em condições anaeróbias a 37 ° C. Colônias individuais isolados devem ser observados após o crescimento durante a noite.

4. Purificando Esporos de C. difficile

Como esporulação é necessário para a sobrevivência em ambientes ricos em oxigênio e para a transmissão eficiente da doença 8, a preparação de ações de esporos é often necessário para aplicações a jusante, não se limitando a estudos de microscopia e animais. É importante notar que enumerando esporos requer repetição para assegurar a reprodutibilidade das contagens. Pipetando para cima e para baixo várias vezes, entre diluições também reduz a perda desde esporos aderem ao plástico também.

A esporulação de C. difficile não é tão rápida ou homogêneo como outras espécies esporogênico. Para otimizar a produção e recuperação de esporos, ou meio de esporulação (SMC) 17,25 ou 70:30 médio 26 é recomendado. Outros meios de comunicação utilizados são BHIS, que requer 4-5 dias de crescimento, antes de esporulação eficiente é visto 27, e Clospore, um meio líquido que produz títulos elevados de esporos (10 julho-10 agosto esporos por mililitro), após 72 horas de crescimento. Outros protocolos de usar água gelada em vez de 1x PBS 20, no entanto, o uso de uma solução isotónica pode reduzir os esporos se colem umas às outras e de plástico superfícies. Alternativamente,alguns investigadores purificar ainda mais os seus esporos, usando um gradiente de sacarose de remover completamente as células vegetativas e de detritos 29.

Antes de começar, os seguintes itens devem ser colocados na câmara anaeróbia:

  • Loops de inoculação estéril
  • BHIS, SMC e / ou 70:30 placas (veja Materiais)
  • BHIS caldo (veja Materiais)
  • 1x PBS, filtro esterilizado (veja Materiais)
  1. Cultura cepas do estoque de glicerol congelado em pré-reduzidos placas BHIS e incubar em condições anaeróbias durante a noite a 37 ° C.
  2. Restreak para vários pré-reduzida ou SMC 70:30 placas e incubar em condições anaeróbias a 37 ° C durante 24-48 horas. A formação de esporos pode ser seguido através de microscopia de contraste de fase. Esporos aparecerá fase vegetativa e brilhante, enquanto células-mãe aparecerá escuro fase. * Como uma alternativa, os esporos podem ser purificados a partir de 70:30 meio líquido, após 24-48 horas, o que produz 10 5 -10 6 esporos por mililitro, dependendo do strain usado.
  3. Utilizando uma ansa de inoculação estéril, raspar placas e ressuspender as células em 10 ml estéril 1x PBS.
  4. Descartar as placas e retirar a suspensão de esporos a partir da câmara de anaerobiose. Agregar as células a 3000 xg durante 15 minutos. Lave as células duas vezes em 1x PBS, ressuspender completamente o sedimento celular de cada vez.
  5. Incubar durante a noite a 4 ° C para ajudar na lise de células-mãe e vegetativo.
  6. Incubar a 70 ° C durante 20 minutos para matar quaisquer células vegetativas residuais.
  7. Para determinar unidades formadoras de colónias (CFU) por mililitro, em série diluir cada preparação de esporos em 1x PBS e placa BHIS + 0,1% de taurocolato de sódio. Incubar as placas durante um período mínimo de 24 horas antes de enumerar as colónias.
  8. Os esporos podem ser armazenados em 1x PBS a quer à temperatura ambiente ou a 4 ° C para armazenamento a longo prazo. Se for armazenada a 4 ° C, pode ser útil para reaquecer a preparação de esporos a 55 ° C durante 15 min para recuperar a germinação eficiente.

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Resultados

Um exemplo de C. difficile cultivadas em BHIS e Columbia anaeróbio ovelhas meios de agar de sangue pode ser visto na Figura 2. C. difficile forma colônias irregulares que são planas e possuem uma aparência de vidro fosco que é evidente em ambos os meios. Aqui, um isolado clínico sensível à eritromicina de C. difficile, 630E 30, é cultivada em BHIS agar, num meio não-selectivo enriquecido, durante 24 horas a 37 ° C (Figura 2A). As colónias no ágar Co...

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Discussão

Os métodos descritos aqui permitir a recuperação simples e rápida de C. difficile a partir de uma variedade de amostras fecais, incluindo seres humanos, ratos e hamsters, bem como o armazenamento a longo prazo de C. difficile como ações de glicerol ou de esporos. C. difficile pode ser um organismo difíceis de cultivar, mas a manutenção cuidadosa de um ambiente anaeróbico e a aplicação de técnicas de assepsia pode proporcionar para um crescimento robusto e uma redução na contaminação.

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Coy Laboratories por gentilmente fornecer imagens da câmara de anaerobiose. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health DK087763 concessão (SMM) e um Curriculum STEP / HHMI Desenvolvimento da Irmandade (ANE).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Peptona de proteose nº 2BD212120
Na2HPO4FisherS373
KH2PO4FisherBP362
NaClFisherS27
MgSO4 (anidro)FisherM65
...-FrutoseFisherL96
Taurocolato de sódioSigmaT4009
CicloserinaSigmaC6880
CefoxitinaFlukaC4786
Meio de infusão de coração cerebralBD237300
Peptona de Proteose BD211684
(NH4)2SO4SigmaA5132
Tris baseFisherBP152
ÁgarBD214010
L-cisteínaSigmaC7755
BactoPeptonaBD211684
Ágar sangue de ovelha colombianoFisherL21928
NaClFisherS27
KClFisherP217
GlicerolFisherBP2291
Alças de inoculação estéreisFisher22363596
Cotonetes estéreisCâmara1495990
Coy e acessóriosCoy Laboratory Products, IncEspecificado pelo clienteEsses itens são encomendados de acordo com as necessidades
Materials
TCCFA ágar

Peptona de proteose nº 2 (Difco) 40 g
Na2HPO4 5 g
KH2PO4 1 g
NaCl 2 g
MgSO4 (anidro) 0,1 g
Frutose 6 g
Ágar 20 g

Levar a 1 L com água deionizada e autoclave a 121 &graus; C por 20 min para esterilizar.

Após a autoclavagem, adicionar:
10 ml de taurocolato de sódio a 10% (p/v), esterilizado por filtro (dissolver em água; concentração final, 0,1%)
25 ml de 10 mg/ml de á'...-cicloserina, esterilizado por filtro (dissolver em água; concentração final, 250 μ g/ml)
1,6 ml de cefoxitina 10 mg/ml, esterilizado por filtro (dissolver em água; concentração final, 16 μ g/ml)

BHIS Médio

Infusão de coração cerebral 37 g
Extrato de levedura 5 g

Para pratos, adicione 15 g de ágar. Leve a 1 L com água deionizada e autoclave a 121 &graus; C por 20 min para esterilizar.

Opcional (adicionar após autoclavagem):

3 ml de L-cisteína a 10% (p/v) (dissolver em água; concentração final, 0,03%)
10 ml de taurocolato de sódio a 10% (p/v) (dissolver em água; concentração final, 0,1%)

Meio de esporulação SMC

BactoPeptona 90 g
Peptona de protease 5 g
(NH4)2SO4 1 g
Tris base 1,5 g
Ágar 15 g

Leve a 1 L com água deionizada e autoclave a 121 ° C por 20 min para esterilizar.

Opcional (adicionar após autoclavagem):
3 ml de L-cisteína a 10% (p/v) (dissolver em água; concentração final, 0,03%)

70:30 Médio

BactoPeptona 63 g
Peptona protease 3,5 g
Infusão cérebro coração 11,1 g
Extrato de levedura 1,5 g
(NH4)2SO4 0,7 g
Tris base 1,06 g

Para pratos, adicione 15 g de ágar. Leve a 1 L com água deionizada e autoclave a 121 &graus; C por 20 min para esterilizar. Após a autoclavagem, adicione 3 ml de L-cisteína a 10% (p/v) (concentração final, 0,03%).

ágar sangue

Recomenda-se o uso de placas de ágar sangue de ovelha anaeróbicas Columbia pré-fabricadas (Fisher Scientific, L21928)35.

1X Solução salina tamponada com fosfato (PBS)

NaCl 8,01 g
KCl 0,2 g
Na2HPO4 1,44 g
KH2PO4 0,27 g

Leve a 1 L com água deionizada e ajuste o pH para 7,4 com HCl. Filtrar esterilize antes de usar.
anaeróbica de vinil Fisher do laboratório

Referências

  1. Hall, I. C., O'Toole, E. Intestinal flora in new-borin infants - With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).
  2. Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. Clindamycin-Associated Colitis - Prospective Study. Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).
  3. Gerding, D. N. Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).
  4. Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. Treatment of Clostridium difficile infection. Clin. Infect. Dis. 46, Suppl 1. 32-42 (2008).
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