Usando Click Chemistry medir o efeito da infecção viral sobre a síntese de RNA do Host-Cell

Resumo

Este método descreve o uso de mouse química para medir as mudanças na transcrição da célula hospedeira após a infecção com o vírus da febre do Vale do Rift (RVFV) tensão MP-12. Os resultados podem ser visualizados por meio de microscopia de fluorescência qualitativamente ou quantitativamente, obtido através de citometria de fluxo. Este método é adaptável para utilização com outros vírus.

Resumo

Muitos vírus RNA evoluíram a capacidade para inibir a transcrição da célula hospedeira como um meio para contornar as defesas celulares. Para o estudo destes vírus, é, por conseguinte, é importante ter uma forma rápida e fiável de medir a actividade de transcrição em células infectadas. Tradicionalmente, a transcrição foi medida quer por incorporação de nucleótidos radioactivos tais como ³ H-uridina seguido por detecção através de autoradiograf ia ou contagem de cintilações, ou incorporação de análogos de uridina derivados halogenados tais como 5-bromouridine (BRU), seguido por detecção por imunocoloração. O uso de isótopos radioactivos, no entanto, exige equipamento especializado e não é viável em um certo número de configurações de laboratório, ao passo que a detecção de BrU pode ser complicado e pode sofrer de uma baixa sensibilidade.

A química clique recentemente desenvolvidos, o que envolve uma formação de triazole catalisada por cobre a partir de uma azida e um alcino, proporciona agora uma rápida e highly alternativa sensíveis a estes dois métodos. Instruções química é um processo de dois passos em que ARN nascentes é rotulado pela primeira vez por incorporação do análogo de uridina 5-etiniluridina (UE), seguido de detecção do rótulo com uma azida fluorescente. Estas azidas estão disponíveis como vários fluoróforos diferentes, permitindo uma grande variedade de opções para visualização.

Este protocolo descreve um método para medir a supressão de transcrição em células infectadas com o vírus da febre de Rift Valley (RVFV) estirpe MP-12, utilizando química do clique. Ao mesmo tempo, a expressão de proteínas virais nestas células é determinada por imunocoloração intracelular clássica. Etapas de 1 a 4 detalhar um método para visualizar supressão transcricional via microscopia de fluorescência, enquanto os passos 5 a 8 pormenor um método para quantificar a supressão da transcrição via citometria de fluxo. Este protocolo é facilmente adaptável para utilização com outros vírus.

Introdução

Tradicionalmente, a actividade de transcrição foi medida através da incorporação de qualquer radioactivos ⁽³ H-uridina) ¹ ou halogenados (BRU) em ^dois nucleósidos de ARN nascentes. Estes análogos de uridina são absorvidos pelas células, convertida em uridina-trifosfato (UTP), através da via de recuperação de nucleósido, e subsequentemente incorporada no ARN recém-sintetizado. ^3H-uridina pode ser detectada por auto-radiografia, o que pode ser demorado, ou cintilação de contagem, o que requer equipamento especializado. Além disso, a utilização de isótopos radioactivos podem não ser prático em um certo número de configur....

Protocolo

Análise da transcrição por microscopia de fluorescência

1. Infectar as células com o MP-12 e etiqueta RNA nascentes com a UE

1. Coloque lamínulas redondas de 12 mm na placa de cultura de tecidos de 12 poços, uma lamela por poço.

Nota: Se as células têm dificuldade em aderir a lamelas, casaco com poli-L-lisina (≥ 70.000 MW), antes de colocar em poços. Para este objectivo, lamelas submersas numa solução estéril de 0,1 mg / mL em _H2O de poli-L-lisina, durante 5 min. Enxágüe com lamelas estéril H ₂ O e ar seco por pelo menos 2 horas.

2. Para sem....

Resultados

A protea de NSS RVFV (Bunyaviridae família, género Phlebovírus) ¹¹ inibe a transcrição geral da célula hospedeira através de dois mecanismos distintos: (i) por sequestrar a subunidade p44 do factor de transcrição basal TFIIH ¹¹ e (ii), promovendo a degradação da p62 proteossômica subunidade de TFIIH ^6. O RVFV MP-12 estirpe ^{13 de} vacina tem sido usada para os experimentos descritos neste protocolo, desde MP-12 estirpe pode ser tratado em nível de laboratório d.......

Discussão

O protocolo fornecido descreve um método para medir o efeito da infecção virai em transcrição da célula hospedeira através da incorporação do análogo de uridina UE em ARN nascentes. Este método possui várias vantagens sobre os métodos anteriores: é rápido, sensível e que não contam com a utilização de isótopos radioactivos. Além disso, o método pode ser adaptado para se obter dados qualitativos através de microscopia de fluorescência ou de dados quantitativos através de citometria de fluxo, utilizando essencialmente os .......

Materiais

e.g.

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
5-etinil-uridina	Berry Associates	PY 7563	dissolver em DMSO para estoque de 100 mM
lamínulas redondas de 12 mm	Fisherbrand	12-545-82
Tubos de poliestireno de 5 ml	BD Biosciences	352058
Actinomicina D (ActD)	Sigma	9415	dissolver em DMSO para estoque de 10
mM Alexa Fluor 488 cabra anti-mouse IgG	Invitrogen	A-11029
Albumina de soro bovino (BSA)	Santa Cruz	sc-2323
CuSO4	Sigma	C-8027	dissolver em H2O para estoque de 100 mM
DAPI	Sigma	D-9542	dissolver em H2O para estoque de 5 mg/ml
DMEM	Invitrogen	11965092
FBS	Azida fluorescente Invitrogen	16000044
(acoplada a Alexa Fluor 594)	Invitrogen	A10270
(acoplada a Alexa Fluor 657)	Invitrogen	A10277
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Ácido L-ascórbico	Sigma	A-5960	dissolver em H2O para 500 mM
filtro de papel	VWRbrand	28333-087
paraformaldeído	Sigma	158127
Penicilina-estreptomicina	Invitrogen	15140122
poli-L-lisina (MW ≥ 70000)	Sigma	P1274
Triton X-100	Sigma	T-8787
Trizma base	Sigma	T-1503	dissolver em H2O para estoque de 1,5 M, pH 8,5
de
	e.g. Citômetro

Azida fluorescente Microscópio Fluorescência de Tripsina-EDTA Invitrogen 25200056de Fluxo Olympus IX71 BD Biosciences LSRII Fortessa