Summary
Bu yöntem, Rift Valley vebası virüsü (RVFV) suşu, MP-12 ile enfeksiyon sonrası konakçı hücre transkripsiyon değişiklikleri ölçmek tıkırtı kimya kullanımı açıklanmaktadır. Sonuçlar floresan mikroskobu ile nitel görüntülendi veya akım sitometri ile kantitatif elde edilebilir. Bu yöntem, diğer virüs ile kullanılmak üzere uyarlanabilir.
Abstract
Birçok RNA virüsleri hücresel savunma aşmak için bir araç olarak konakçı hücre transkripsiyonu inhibe etme yeteneği gelişmiştir. Bu virüslerin Çalışma için, enfekte olmuş hücrelerde transkripsiyonel aktivitesini ölçmek için bir hızlı ve güvenilir bir şekilde olması için bu nedenle önemlidir. Geleneksel olarak, transkripsiyon H-üridin gibi immün ile tespit takiben 5-bromouridine (BRU) gibi halojenlenmiş üridin analoglannın Otoradyografi veya sintilasyon sayımı veya birleşme ile tespit takiben 3 gibi radyoaktif nükleosidlerin ya da eklenmesi ile ölçülmüştür. BrU tespiti külfetli olabilir ve düşük hassasiyet muzdarip olurken radyoaktif izotopların kullanımı, ancak, özel ekipman gerektirir ve laboratuvar bir dizi mümkün değildir.
Bir azid ve alkin bir bakır-katalize triazol oluşumu içerir yeni geliştirilen tıklayın kimya, şimdi hızlı ve highl sağlarBu iki yöntem y duyarlı bir alternatif. Click kimyası Yeni oluşan RNA önce bir floresan azid ile etiketin saptanması, ardından üridin analog 5-ethynyluridine (AB) eklenmesi ile etiketlenmiş olduğu, iki aşamalı bir işlemdir. Bu azidler görselleştirme için seçenekleri geniş bir yelpazede için izin, birkaç farklı fluorophores olarak mevcuttur.
Bu protokol, MP-12 suşu tıklama kimya kullanılarak Rift Valley vebası virüsü (RVFV) ile enfekte edilmiş hücrelerde transkripsiyonel bastırma ölçmek için bir yöntem açıklanır. Aynı zamanda, bu hücrelerde viral proteinlerin ekspresyonu klasik immün hücre içi tarafından belirlenir. 8 detay akım sitometri ile transkripsiyonel bastırma ölçmek için bir yöntem ile 5 arasındaki adımları ise, 4 ayrıntılı floresan mikroskobu ile transkripsiyonel bastırma görselleştirmek için bir yöntem adım 1. Bu protokol, diğer virüsler ile kullanıma kolaylıkla adapte edilebilir.
Introduction
Geleneksel olarak, transkripsiyonel aktivitesini radyoaktif (3H-üridin) 1 ya dahil edilmesi ile ölçülür ya da doğmakta olan RNA içine (BrU) 2 nükleosidlerin halojenli edilmiştir. Bu üridin analoglan, hücreler tarafından alınır nükleosit kurtarma yolu ile üridin trifosfat (UTP) haline dönüştürüldü ve daha sonra yeni sentezlenen RNA'nın dahil edilmiştir. 3H-üridin zaman alıcı olabilir otoradyografi, veya parıldama ile tespit edilebilir edilir özel ekipman gerektiren, sayma. Ayrıca, radyoaktif izotopların kullanımı yüksek çevreleme biyogüvenlik laboratuarları dahil olmak üzere, laboratuvar ortamlarında bir dizi pratik olmayabilir. BrU RNA ikincil yapı antikor bağlayıcı bir sterik engel olabilir olarak çekirdek ya da RNA'nın kısmen denatüre, ve antikorun erişimi sağlamak için sert geçirgenliği gerektirebilir anti-BrU antikorları ile immüno-boyama yoluyla tespit edilebilir.
_content "> Burada açıklanan protokol en son gerilme RVFV MP-12 ile enfekte edilmiş hücrelerde transkripsiyonel aktivitesini ölçmek için kimya 3 tıklayın geliştirilmiştir. Click kimyası, son derece seçici ve etkili bir bakır (I) katalizli bir alkin arasındaki siklo-ilave reaksiyonu dayanır kullanır 4,5-bir azid yarımı. Bu protokol, enfekte olmuş hücrelerde Yeni oluşan RNA ilk üridin analog AB dahil edilmesi yoluyla etiketlenir. ikinci bir adımda, kurulmuş AB, floresan azit ile reaksiyona sokulması ile tespit edilir. Bu yöntemin en önemli avantajları , (1) bunun radyoaktif izotopların kullanımını gerektirmeyen ve (2) bu kadar sert geçirgenliği veya RNA denatürasyon gerektirmez. yetersiz tarafından engellenir değildir az 50 Da, floresan azid ile erişim arasında bir moleküler ağırlığa sahip Bir sınıf ile RNA'nın tespiti birleştirirken geçirgenliği veya RNA sekonder yapısı. Dahası, araştırmacıların birincil antikor seçiminde sınırlı değildirviral proteinler için ical immün.Iki farklı yöntem, bu protokolde tarif edilmektedir: floresan mikroskobu (1-4), ve akış sitometrisi (adım 5-8) aracılığıyla transkripsiyon miktarının belirlenmesi için, bir transkripsiyon ile görüntülenmesi için, bir. Bu yöntemlerin her ikisi bir hücre-by-hücre olarak transkripsiyonel aktivite ve viral enfeksiyon arasında bir ilişki sağlar viral proteinler, bir hücre içi immün ile doğmakta olan RNA etiketleme birleştirir.
Yazarlar, başarılı bir protokol RVFV suşu MP-12 6, Toscana virüsü (TOSV) 10 ile enfekte olan farklı MP-12 mutantları 7,8, 9, ve hücreler ile enfekte olmuş hücrelerin ile enfekte olmuş hücrelerin içinde transkripsiyonel aktiviteyi belirlemek için burada açıklanan kullandık. Burada tarif edilen protokol kolayca farklı virüs ile kullanılmak üzere adapte edilmiş ve belirli viral veya hücresel proteinlerin immünofloresan boyama içermek üzere modifiye edilebilir potansiyeline sahip olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Floresan mikroskobu ile transkripsiyon analizi
1. MP-12 ve AB ile Etiket Doğan RNA ile hücreler enfekte
- 12-iyi doku kültürü plakası içine Sıra 12-mm yuvarlak lamelleri, iyi başına bir lamel.
Not: hücreleri kuyularda yerleştirmeden önce sorun lamelleri bağlı kalarak, poli-L-lisin (MW ≥ 70.000) ile kat var. Bu amaçla, 5 dakika boyunca poli-L-lisin H2O içinde steril, 0.1 mg / ml çözelti daldırmak lamelleri. En az 2 saat süreyle steril H 2 O ve hava-kuru ile lamelleri durulayın.
- Lamelleri üzerine tohum 293 hücreleri için, oyuk başına 1 ml büyüme ortamı (DMEM,% 10 fetal sığır serumu, 100 U / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin ihtiva eden) 5 x 10 4 hücre ekleyin. 37 nemlendirilmiş bir inkübatör inkübe ° C ve% 5 CO 2 O / N
- 3 'lik bir enfeksiyon çokluğu (İB) de MP-12 hücreleri enfekte. Dahil, en az iki bulaşmamış kuyu: iki kuyu biri enfekte olmayan kontrol olarak hizmet verecek, diğer transkripsiyonel bastırma için bir kontrol olarak adım 1.5 de aktinomisin D (ActD) ile tedavi edilecektir. Büyüme ortamı çıkarın ve virüs stokunun seyreltmek böylece toplam hacim, her bir oyuğa ilave bir 200 ml 'dir. 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatör içinde 1 saat boyunca inkübe ° C ve% 5 CO2.
Not: yerine hücrelerin enfekte arasında, hücreler de plasmid DNA ile transfekte ya da in vitro olarak, belirli bir viral proteini kodlayan bir RNA sentez edilebilir. Bu amaçla, üreticinin talimatlarına göre uygun bir kimyasal transfeksiyon reaktif ile hücreleri transfect ve 16 saat sonrası transfeksiyon 1.5 adıma geçin. Bu RNA etiketleme ve sabitleme önce transfeksiyon koşulları ve inkübasyon süresi optimize etmek için tavsiye edilir.
- Inokulum kaldırmak ve iyi başına 1 ml taze besi ekleyin. 15 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- 15 saat sonrası enfeksiyon (hpi), 1 mM AB içeren orta büyüme orta yerine. Sahte enfekte kuyu biri olan, aynı zamanda 5 ug / ml ActD ekleyin. ActD DNA-bağımlı RNA sentezini inhibe eder gibi bu, transkripsiyonel bastırma için kontrol olarak görev yapacak. Inkübatör hücreleri dönün.
- 16 hpi olarak, orta kaldırmak ve 1 ml PBS (KCI 0.20 g / l, KH 2 PO 4 0.20 g / L NaCl, 8.00 g / L Na 2 HPO 4 1,15 g / l, pH 7.4) ile bir kere yıkayın lamelleri de başına. Oyuk başına% 4 paraformaldehid, 1 ml (PFA) eklenerek ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edilerek hücreleri saptamak.
Not:% 4 PFA sabitleme solüsyonu hazırlamak için, ° C ısıtılmış bir manyetik karıştırıcı üzerinde 60 kadar ısıtılır 150 ml H 2 O 10 g paraformaldehid çözülür. 1M NaOH 500 ul ekleyin ve çözüm berrak hale gelinceye kadar karıştırmaya devam edin. Partikülleri kaldırmak ve 62.5 ml fosfat tampon eklemek için bir kağıt filtre ile filtre PFA çözeltisi (77 mM NaH 2 PO 4, 287 mM 2-Na HPO 4, pH 7.4). 250 ml toplam hacme H2O ekleyin. Tek kullanımlık alikotları -20 ° C'de dondurun.
- Oyuk başına 1 ml PBS ile bir kez yıkayın. Resim inkübasyon süresi bu ve daha sonraki tüm yıkama adımları için gereklidir. 2. adıma hemen geçin.
Not: Uzun süre için bu aşamada tutulması durumunda RNA dejenere gibi, hemen tıklama reaksiyon devam etmek açısından önemlidir; hücreler, 4, 1 saat boyunca tutulur, RNA flüoresan sinyal kaybı önceden tespit edilebilir ° C . Benzer şekilde, eğer başıBir süre ders deney oluşturan, etiket emin olun düzeltmek ve aynı zamanda tüm örnekler leke.
2. Etiketli RNA Algılama Reaksiyon tıklayın
- 1 ml PBS içinde% 0.2 Triton X-100 eklenmesi ile hücre geçirgenliği. Oda sıcaklığında 10 dakika süreyle inkübe edilir.
Not: adımda kullanılan tüm çözümler 2.1 ile 2.3 nükleaz ücretsiz olması gerekir.
- Oyuk başına 1 ml PBS ile üç kez yıkayın.
- Nemli odasına 12-plaka ve transfer lamelleri çıkarın. Her: 100 ul tıklayın boyama solüsyonu (100 mM askorbik asit 100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO 4, 20 mcM floresan azid [590/617 nm uyarma / emisyon maksimum]) - 50 ile her lamel örtün. Karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
Not: Plastik parafin film ile 10 cm çapında nemli odası, çizgi bir hücre kültürü veya petri altına monte etmek için. Di kenarının iç çizgiyinemli kağıt havlu ile sh. Plastik parafin film üzerine lamelleri yerleştirin.
Not: lamelleri bu veya protokolde başka bir adımı sırasında kurumasına izin vermemek için dikkatli olun. Bu nemli odasına yerleştirildi kuruluşuna her lamel boyama çözüm eklemek için en iyisidir.
Not: Bu adımı hemen önce taze tıklama boyama çözüm hazırlayın. 1.5 M Tris, pH 8.5, 100 mM CuSO 4 ve 500 mM askorbik asit stok çözeltileri 4 ° C de muhafaza edilebilir Ancak, sarı döndü herhangi bir askorbik asit stok solüsyonu atın.
Not: floresan mikroskop filtreleri eşleşen bir fluorofor seçtiğinizden emin olun.
- Yeni bir 12-plaka içine nemli odası ve yerden lamelleri çıkarın ve iyi başına 1 ml PBS ile üç kez yıkayın.
Not: de iseviral proteinlerin koruması, istenen lamelleri monte edilebilir ve bu adımı (3.3 adıma geçin) sonra görüntülenmiş.
3. Viral Proteinlerin İfade bulmak için İmmünofloresan
- Her bir kuyucuğa engelleme tamponu, 1 ml (% 3 (w / v) sığır olarak albumin (BSA), serum PBS) ekleyin ve karanlıkta, oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edin.
- Nemli odasına, 12 plaka transfer lamelleri çıkarın ve 50 ile kapak - tampon (1:500) engelleme seyreltilmiş primer antikor 100 ul (anti-RVFV, Dr RB Tesh bir tür hediye, UTMB). Karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
Not: Farklı bir virüs ile kullanmak için bu protokolü adapte olduğunda, önce primer antikor için en uygun seyreltme belirler.
Not: Alternatif olarak, bu adım, karanlıkta 4 ° C'de O / N gerçekleştirilebilir.
- 12 plaka geri nemli odası ve yerden lamelleri çıkarın ve yıkayınüç 1 ml PBS ile kat başına iyi.
- 50 ile nemli odası ve kapağı içine 12-iyi bir yerde, yerden lamelleri çıkarın - ikincil antikor 100 ul (anti-fare IgG floresan boya [uyarma / emisyon maksimum: 495/519 nm] konjuge) (1 tampon engelleme seyreltilmiş: 500). Karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
Not: Birincil antikor tanımak ve floresan mikroskop filtreleri uygun bir ikincil antikor seçtiğinizden emin olun.
Not: Arzu edildiği takdirde, 200 ng / ml 'DAPI çekirdekleri görselleştirmek için ikincil antikor seyreltme eklenebilir.
- Geri 12 plaka içine nemli odası ve yerden lamelleri çıkarın ve iyi başına 1 ml PBS ile üç kez yıkayın.
- Bir mikroskop lamı üzerine Fluoromount-G bir damla (ca. 15 ul) koyarak lamelleri monte edin. H 2 O içine lamel batırın, inci dokunarak fazla H 2 O çıkarınFluoromount-G açılan aşağı bir kağıt havlu ve yerine hücre tarafı karşı e tarafı. 5 dakika boyunca hava kuru.
Not: ters bir mikroskop görüntüleme ise, Fluoromount-G 4 katılaşmaya izin ° mikroskop lamı CO / N veya yapıştırın lamelleri şeffaf oje ile kenar sızdırmazlık tarafından.
Not: bir hafta için Slaytlar hemen görüntülü veya karanlıkta 4 ° C'de saklanabilir.
4. Veri Toplama
- Bir floresan mikroskop kullanılarak görüntü.
Not: mikroskop kullanılarak görüntülendi olabilir uygun fluorophores seçtiğinizden emin olun. Başvuru için, aşağıdaki bu yayında gösterilen görüntüler elde etmek için kullanılan fluorophores ve filtre setleri.
DAPI:
Tahrik olma filtresi: BP 330-385
Iki renkli ayna: DM 400
Emisyon filtresi: LP 420
Iki renkli ayna: DM 505
Emisyon filtresi: LP 510
590/617 bir uyarma / emisyon maksimum fluorofor:
Tahrik olma filtresi: BP 545-580
Iki renkli ayna: DM 600
Emisyon filtresi: LP 610
Akış sitometrisi ile transkripsiyon analizi
5. MP-12 ve AB ile Etiket Doğan RNA ile hücreler enfekte
- Büyüme ortamı (DMEM,% 10 fetal sığır serumu, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ihtiva eden) içinde 6-çukurlu bir doku kültür levhası içine Tohum 293 hücreleri. % 100 confluency - 37 ° C ve% 5 CO 2 hücreleri 80 ulaşana kadar nemlendirilmiş bir inkübatör inkübe edin.
- Bir moi 3 de MP-12 ile hücreleri enfekte. En az iki bulaşmamış kuyu şunlardır: iki kuyu biri enfekte olmayan kontrol olarak hizmet verecek, diğer adımda ActD ile tedavi olacak5.4. Büyüme ortamı çıkarın ve toplam hacim, her bir oyuğa ilave böylece virüs stokunun seyreltik 400 ul. 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatör içinde 1 saat boyunca inkübe ° C ve% 5 CO2.
- Inokulum çıkarın ve 2 ml taze besi başına iyi ekleyin. 12 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
Not: başka bir virüs ile kullanmak için bu protokolü adapte, bu etiketleme ve hasat için en uygun zaman noktası belirlemek için bir süre ders deney gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Enfeksiyon kez incelirler ve tüm örnekler hasat, etiketlenmiş ve aynı zamanda boyanmış olabilir, böylece bu zaman aralığının ayarlayın.
- 12 hpi de, 0.5 mM AB içeren orta büyüme orta yerine. Sahte enfekte kuyu biri olan, aynı zamanda 5 ug / ml ActD ekleyin. ActD DNA-bağımlı RNA sentezini inhibe eder gibi bu, transkripsiyonel bastırma için kontrol olarak görev yapacak. Inkübatör hücreleri dönün.
- 13 hpi de, zekâ kez hücreleri yıkayınhücreler tripsinizasyon ile saat PBS ve hasat. PBS, 1 mM EDTA (PBS-EDTA) içeren hasat edilmiş hücreler üç kez yıkayın.
Not: Bu ve daha sonraki adımları sırasında, 500 daha hızlı hücreler santrifüj yok - 1.000 x g hücre kırılması önlemek için. 1 hücreleri santrifüj - sediment için 2 dk.
Not: bir yüzey immün yerine lastik polis veya tek hücre kazıyıcı kullanarak tıklama reaksiyon, hasat sonrasında planlanmış ise.
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 4 PFA ve inkübe 1 ml bunları yeniden süspansiyona hücreleri saptamak. % 4 PFA hazırlamak için nasıl talimatlar için 1.6 adıma bakın.
- Oyuk başına 1 ml PBS-EDTA ile bir kez yıkayın. 6. adıma hemen geçin.
Not: uzun süre için bu aşamada muhafaza edilmesi durumunda RNA bozulur gibi, hemen tıklama reaksiyon devam etmek önemlidir. Benzer şekilde, bir zaman c yerine iseourse deney, aynı zamanda tüm örnekler, etiket düzeltmek ve leke emin olun.
6. Etiketli RNA Algılama Reaksiyon tıklayın
- PBS içinde% 0.2 Triton X-100, 0.5 ml 'si içinde yeniden asılı hücreleri geçirgenliği. Oda sıcaklığında 10 dakika süreyle inkübe edilir.
Not: adımda kullanılan tüm çözümler 6.1 to 6.3 nükleaz ücretsiz olması gerekir.
Not: hücreleri bu adımı sırasında tortu düzgün yapmazsanız, 5 dakika için santrifüj süresi artar. Sedimantasyon davranış kez hücreleri FACS tampon (adım 6.4) olarak askıya alınır açısından yararlı olacaktır.
- 1 ml PBS ile bir kez yıkayın.
Not: Bu Cu 2 + iyonları tıklama reaksiyon için gerekli şelat gibi bu adımda EDTA kullanmayın.
- 200 ul tıklayın boyama çözüm içinde süspanse edin hücreleri (100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO 4, floresan boya [hariç etiketli 200nM azidaktif rehabilitasyonu amaçlayan / emisyon maksimum, 650/665 nm], 100 mM askorbik asit). Karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
Not: Bu adımı hemen önce taze tıklama boyama çözüm hazırlayın. 1.5 M Tris, pH 8.5, 100 mM CuSO 4 ve 500 mM askorbik asit stok çözeltileri 4 ° C de muhafaza edilebilir Ancak, sarı döndü herhangi bir askorbik asit stok solüsyonu atın.
Not: Bu adımı sırasında birlikte hücreleri yığın ise, birkaç kez aşağı yukarı pipetleme ve ile tekrar süspansiyon.
Not: akış sitometresinde ile tespit edilebilir bir fluorofor seçtiğinizden emin olun.
Not: Ayrıca tıklama boyama işlemi tabi değildir enfekte hücrelerin bir örneği hazırlamak, bu akış sitometresinin kalibrasyonu için gerekli olacaktır. Ya enfekte hücrelerin yarısı kullanabilir veya adım 5.2 de iyi enfekte ek içerir. Bu control hücreleri adım 7.1 olarak boyanmış olacaktır.
- FACS tampon maddesi (PBS, 1 mM EDTA ve% 0.5 (w / v) BSA içeren) ile iki kez yıkanır.
Not: viral proteinlerin herhangi bir immün isteniyorsa, hücreler analiz edilebilir hemen (8 adıma).
7. Viral Proteinlerin İfade bulmak için İmmünofloresan
- Primer antikor, 200 ul süspansiyon hücreleri (anti-RVFV) FACS tamponu (1:10,000) içinde seyreltilmiş ve karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
Not: Alternatif olarak, bu adım, karanlıkta 4 ° C'de O / N gerçekleştirilebilir.
Not: Ayrıca tıklama boyama işlemi tabi ama boyanmış olmayacaktır enfekte olmamış hücrelerin bir örneği hazırlamak, bu akış sitometresinin kalibrasyonu için gerekli olacaktır. Ya sahte enfekte hücrelerin yarısı kullanabilir veya ek bir bulaşmamış iyi de dahil5.2 adım.
Not: Farklı bir virüs ile kullanmak için bu protokolü adapte olduğunda, önce primer antikor için en uygun seyreltme belirler.
- FACS tamponunda iki kez hücreleri yıkayın.
- İkinci antikor, 200 ul süspansiyon hücreleri (anti-fare IgG, floresan boya [uyarım / emisyon maksimum: 495/519 nm] konjüge) FACS tamponu (1:1,000) içinde seyreltilmiş ve karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
- FACS tamponunda bir kez hücreleri yıkayın.
Not: Bu noktada, hücreler, karanlıkta 4 ° C'de O / N saklanabilir.
8. Veri Toplama
- 5 ml polistiren tüpler içine 500 ul FACS tampon, transfer hücrelerin yeniden süspanse ve akış sitometresi kullanılarak analiz. Alet kalibre MP-12 enfekte hücreleri (sadece bir tıklama tepki, anti-RVFV boyama) ve sahte enfekte hücreleri (sadece tepki tıklayın) kullanın.
Değile: Cihazınızın ile tespit edilebilir uygun fluorophores seçtiğinizden emin olun. Referans için, aşağıdaki Bu yayında gösterilen veriler elde etmek için kullanılan lazer çizgi ve filtre kümesi vardır.
495/519 bir uyarma / emisyon spektrumu ile fluorofor:
Lazer: 488 nm
Filtre: 530/30
650/665 bir uyarma / emisyon spektrumu ile fluorofor:
Lazer: 640 nm
Filtre: 670/20
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RVFV bölgesinin NSS proteini (Bunyaviridae ailesi, cins Phlebovirus) 11 iki ayrı mekanizma ile konak hücre genel transkripsiyon inhibe eder: (i) kenetleme ile P62 arasında proteozomal degradasyonu teşvik, bazal transkripsiyon faktörü TFIIH 11 ve (ii) bir p44 alt birimi TFIIH 6 alt birimi. MP-12 suşu bir biyogüvenlik düzeyi 2 laboratuarda ele alınabilir ve diğer vahşi geçerlidir ABD'de seçim aracı kural, dışında olduğundan RVFV MP-12 aşı suşu 13 Bu protokol açıklanan deneyler için kullanılmıştır RVFV suşları yazın. MP-12 suşu NSS protein tamamen işlevseldir ve ev sahibi transkripsiyon 6 bastırmak için yeteneği korur. NSS gen 14% 69 kapsayan bir silme taşıyan virüs rMP12-C13type, konak hücre transkripsiyon bastırmak için yeteneği dahil olmak üzere tüm NSS fonksiyonları, eksik bir kontrol virüs olarak dahil edilmiştir.
Şekil 3A akım sitometri ile elde edilen nicel veriler gösteriyor. Veriler, x-ekseni üzerinde çizilen bir anti-RVFV boyama için y-ekseni üzerinde ve çizilen Yeni oluşan RNA AB içine dahil edilmesi için floresan sinyali ile saçılım olarak temsil edilir. Kadranda kapıları sahte enfekte hücrelerin çoğunluğu sol üst kadranda yer o kadar kuruldu, ActD tedavi hücrelerin çoğunluğu sol alt kadranda yer alıyordu, ve enfekte hücrelerin çoğunluğu arsa sağ yarısında yer alıyordu . Hücreler MP-12 ile enfekte edilmiştir, toplam hücrelerin% 81.5 'i, ya da anti-RVFV pozitif hücrelerin% 93, daha az transkripsiyonel aktivite göstermiştir. Buna karşılık, wheN hücreleri rMP12-C13type ile enfekte edilmiştir, toplam hücrelerin% 91.6, ya da anti-RVFV pozitif hücrelerin% 97, sahte enfekte edilmiş hücre ile karşılaştırılabilir olmuştur transkripsiyonel aktivite göstermiştir. Şekil 3B şeklinde Şekil 3A ile aynı veri tasvir AB dahil edilmesi ile etiketleme floresan RNA için bir histogram.
Şekil 1. MP-12 ve rMP12-C13type. 293 hücreleri ile enfekte hücrelerin floresan mikroskobu enfekte veya MP-12 veya NSS silme mutant RMP-12-C13type ya bulaşmış alay vardı. 15 ve 16 hpi arasında, hücreler 1 mM AB ile işaretlendi. Transkripsiyonel bastırılması için bir kontrol olarak, sahte enfeksiyonlu hücreler 5 mg / ml AB tedavi ile eş zamanlı ActD ile tedavi edildi. Çekirdekler DAPI boyama (mavi), viral proteinlerin ifade anti-RVFV antikorları (yeşil) ile boyanarak görüntülenmiştir ve RNA ile görüntülenmiştir görselleştirmek olduğunu(kırmızı): floresan boya (590/617 nm uyarma / emisyon maksimum) ile etiketli azid ile anonim AB tespiti ile d.
Şekil 2. Hücrelerinin floresan mikroskobu 293 hücreleri transfekte sahte edildi. GFP veya MP-12 NSS biri için, in vitro sentez RNA ile transfekte edilen ya da RNA GFP veya MP-12 için kodlama ya da NSS sentez, in vitro transfekte. 15 ve 16 saat posttransfection arasında, hücreler 1 mM AB ile işaretlendi. Transkripsiyonel bastırılması için bir kontrol olarak, sahte transfekte hücreler 5 mg / ml AB tedavi ile eş zamanlı ActD ile tedavi edildi. GFP ekspresyonu bir anti-GFP antikoru (GI) ile boyanarak görünür olduğu, NSS ifadesi floresan boya (uyarım / emisyon ile konjuge edilmiş anti-fare IgG takibeder (af, Km), anti-RVFV antikorlar ile boyanarak görünür olduğu Çok büyükm: 590/617 nm) (kırmızı): 495/519 nm) (yeşil) ve RNA floresan boya (uyarma / emisyon maksimum etiketli azid ile anonim AB'nin tespiti ile görüntülenmiştir.
Şekil 3,. MP-12 veya rMP12-C13type ile enfekte olmuş hücrelerin (A), akış sitometrik analizi. Hücreleri enfekte veya MP-12 veya rMP12-C13type ile ya da sahte enfekte edildi. 12 ve 13 hpi arasında, hücreleri 0.5 mM AB ile işaretlendi. Transkripsiyonel bastırılması için bir kontrol olarak, sahte transfekte edilmiş hücrelerin, AB tedavi ile eş zamanlı ActD 5 ug / ml ile muamele edildi. (Anti-RVFV) ve RNA azid ile anonim AB'nin tespiti tarafından görüntülenmiştir: viral proteinlerin ifade floresan boya (495/519 nm uyarma / emisyon maksimum) ile etiketli ikincil bir antikor takip anti-RVFV antikorlar ile boyanarak görüntülenmiştir (RNA): floresan boya (650/665 nm uyarma / emisyon maksimum) ile etiketli. Datbir bir dağılım çizim olarak temsil edilir. (B) aynı veri Temsili bir histogram gibi bir gösterildiği. AB birleşme için floresan x-ekseni üzerinde çizilir, hücre sayıları y ekseni üzerinde çizilir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sağlanan protokolü doğmakta olan RNA içine üridin analog AB'nin birleşme ile konak hücre transkripsiyon viral enfeksiyon etkisini ölçmek için bir yöntem açıklanır. Hızlı, hassas olduğunu ve radyoaktif izotopların kullanımı dayanmaz: Bu yöntem önceki yöntemlere göre birçok avantajı vardır. Ayrıca yöntem, floresan mikroskobu veya esas itibariyle aynı reaktifler kullanılarak akış sitometrisi ile sayısal veriler ile niteliksel verileri vermek üzere adapte edilebilir. Viral antijenler için immünofloresan boyama ile birleştirildiğinde, bu yöntem de, araştırmacının enfekte olmamış hücreleri enfekte ayırım yapmaya imkan vermektedir.
Bu ev sahibi transkript, 3 H-üridin veya BrU dahil dayanarak diğer yöntemlerle paylaşılan bir dezavantajı etiketler olarak bu yöntem de aynı oranda yeni sentezlenmiş viral RNA etiketler dikkat etmek önemlidir. RVFV MP-12 enfeksiyonu durumunda en az, ancak, bulduk amofarkla ana transkript UNT'nin viral transkript miktar daha ağır basar ve böylece bu tahlil ile ölçülen toplam RNA, viral RNA'nın etkisi ihmal edilebilir düzeydedir. Başka bir virüs ile kullanmak için bu protokolü adapte olduğunda, araştırmacılar ActD ile enfekte hücrelerin tedavi ile, kendi yerelleştirme yoluyla viral transkript belirlemek isteyen, ya da floresan in-situ hibridizasyon (FISH) 15 olsa olabilir. Virüs, MP-12 gibi sitoplazmasında çoğaltır, daha sonra viral RNA'nın hala kolayca çok etiketleme 1 saat sonra, çekirdekte bulunan hücresel RNA, ayırt edilebilir. Enfekte edilen hücreler, viral RNA sentezi etkilenmeden bırakarak, konak hücre transkripsiyon bastırmak için ActD ile tedavi edilebilir. Çift zincirli DNA bağlayıcı ve 16 tarafından bu nedenle ActD fonksiyonlar sadece DNA'ya bağımlı transkripsiyonunu engelleyen ancak viral RNA-bağımlı RNA polimeraz üzerinde hiçbir etkisi yoktur.
Bu protokol yaparken, bunu önlemek için çok önemlidirAB etiketli RNA olarak permeabilization ve tıklama etiketleme reaksiyon arasında nükleazlar, ile kirlenme RNases 3 tarafından bozulması duyarlı kalır. Ayrıca, araştırmacılar fiksasyon arasında uzun süreli inkübasyon sürelerinde olarak, tıklama etiketleme reaksiyon hemen geçin ve ° C, RNA floresan sinyal kaybına neden sonuçta RNA bozulması yol ve hatta 4 de, reaksiyon etiketleme tıklamanız gerekmektedir. Zaman ders deneyler yaparken bu özel endişe kaynağıdır; araştırmacılar tüm hücreleri, etiketli sabit, ve aynı zamanda boyanmış böylece onların deney tasarlama gerekir. Neyse ki, RNA floresan sinyal tıklayın etiketleme reaksiyon sonra sabit kalır, bu nedenle protokol kolayca bu adımdan sonra durdurulabilir.
Son olarak, araştırmacılar sitopatik etki (CPE) olumsuz herhangi bir transkripsiyon bastırma yokluğunda bile hücresel RNA sentezi etkileyen birçok virüs neden akılda tutmak gerekir. Ohücreleri hala canlı olduğu bir zaman, enfeksiyondan transkripsiyonel aktivitesini ölçmek için önemlidir. Bir mutant virüs gibi RMP-12-C13type (Şekil 1 ve 3) gibi transkripsiyon, bastırmak için yeteneği yoksun varsa, bu transkripsiyon ölçmek için en uygun zaman noktası belirlenmesinde harika bir araç olabilir.
Deneyler, çok sayıda planlama, araştırmacılar, böylece bir ikinci antikor için olan ihtiyacı ortadan kaldırarak ve viral antijenlerin tespiti için gerekli olan süreyi azaltarak, bir fluorokrom ile 17, birincil antikorun doğrudan etiketleme dikkate almak istiyor olabilir.
Özet olarak, bu protokol, konak hücre transkripsiyon viral enfeksiyon etkisini ölçmek için hızlı ve güvenilir bir şekilde sağlar. Kolayca farklı virüs ile birlikte kullanım için uyarlanmış ve belirli viral veya hücresel proteinleri için immunboyanması içermek üzere modifiye edilebilir potansiyeline sahip olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz fare poliklonal anti-RVFV antiserum ve akış sitometri ile yardım için UTMB Sitometrisi Core Tesisi M. Griffin sağlamak için RB Tesh teşekkür ederim. Bu çalışma UTMB.OL de James W. McLaughlin Bursu Fonu desteklenmiştir tarafından desteklenmiştir UTMB.BK de Aşı Geliştirme için Sealy Merkezi'nden Batı Bölgesel Mükemmellik Merkezi, NIH hibe R01 AI08764301 ve finansman ile 5 U54 AI057156 tarafından desteklenmiştir Bir Maurice R. Hilleman Erken-Evre Kariyer Araştırmacı Ödülü.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ethynyl-uridine | Berry Associates | PY 7563 | dissolve in DMSO for 100 mM stock |
| 12-mm round coverslips | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| 5 ml polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Actinomycin D (ActD) | Sigma | 9415 | dissolve in DMSO for 10 mM stock |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO4 | Sigma | C-8027 | dissolve in H2O for 100 mM stock |
| DAPI | Sigma | D-9542 | dissolve in H2O for 5 mg/ml stock |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled) | Invitrogen | A10270 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled) | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A-5960 | dissolve in H2O for 500 mM |
| paper filter | VWRbrand | 28333-087 | |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| poly-L-lysine (MW ≥ 70000) | Sigma | P1274 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trizma base | Sigma | T-1503 | dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Fluorescence Microscope | e.g. Olympus IX71 | ||
| Flow Cytometer | e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa |
References
- Fakan, S. Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus. Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).
- Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies. Cytometry. 14, 455-458 (1993).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15779-15784 (2008).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs protein of rift valley fever virus promotes posttranslational downregulation of the TFIIH subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Kalveram, B., et al. Rift Valley fever virus NSs inhibits host transcription independently of the degradation of dsRNA-dependent protein kinase PKR. Virology. , (2012).
- Head, J. A., Kalveram, B., Ikegami, T. Functional analysis of Rift Valley fever virus NSs encoding a partial truncation. PLoS One. 7, e45730 (2012).
- Lihoradova, O. A., et al. Characterization of Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain Encoding NSs of Punta Toro Virus or Sandfly Fever Sicilian Virus. PLoS Negl Trop Dis. 7, e2181 (2013).
- Kalveram, B., Ikegami, T. Toscana Virus NSs Protein Promotes Degradation of Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase. J. Virol. , (2013).
- Schmaljohn, C., Nichol, S. In Fields Virology. Knipe, D. M., et al. , Lippincott Williams and Wilkins. 1741-1789 (2007).
- Le May, N., et al. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Caplen, H., Peters, C. J., Bishop, D. H. Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development. J. Gen. Virol. 66, 2271-2277 (1985).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. Detection of viral RNA by fluorescence in situ hybridization (FISH). J. Vis. Exp. , e4002 (2012).
- Reich, E., Goldberg, I. H.
- Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).
