Membrana-COLUNA: Uma Ferramenta bioquímicos na identificação de interações proteína-proteína de Proteínas de Membrana In Vivo

Resumo

A abordagem bioquímica é descrita a identificação in vivo de interacções proteína-proteína (PPI), de proteínas de membrana. O método combina a proteína de ligação cruzada, de purificação por afinidade e espectrometria de massa, e é adaptável para quase qualquer tipo de célula ou organismo. Com esta abordagem, embora a identificação de IPP transientes torna-se possível.

Resumo

As proteínas da membrana são essenciais para a viabilidade celular e, portanto, são alvos terapêuticos importantes ^1-3. Desde que funcionam nos complexos de ^4, métodos para identificar e caracterizar as suas interacções são necessárias ^5. Para isso, desenvolvemos a membrana Strep-proteína experimento interação, chamada de membrana-espinha ^6. Esta técnica combina in vivo de ligação cruzada utilizando o formaldeído reversível de reticulação com a purificação por afinidade de uma proteína de membrana de isca Strep-tag. Durante o procedimento, as proteínas presa reticulados são co-purificados com a proteína de membrana de isca e, subsequentemente, separado por ebulição. Assim, duas grandes tarefas podem ser executadas quando se analisa as interações proteína-proteína (IBP) de proteínas de membrana usando Membrane-espinha: primeiro, a confirmação de um parceiro de interação proposto por immunoblotting e, segundo, a identificação de novos parceiros de interação através da análise de espectrometria de massa . Além disso, mesmo low afinidade PPIs transientes são detectáveis ​​por esta técnica. Finalmente, Membrane-espinha é adaptável a praticamente qualquer tipo de célula, tornando-o aplicável como ferramenta de triagem para identificar poderoso PPIs de proteínas de membrana.

Introdução

Para entender a função de uma proteína que é essencial conhecer os seus parceiros de interação. Várias técnicas clássicas estão disponíveis para a identificação de parceiros de interacção de proteínas solúveis. No entanto, estas técnicas não são facilmente transferíveis para a membrana proteínas, devido à sua natureza hidrofóbica ^4. Para ultrapassar esta limitação, foi desenvolvido o Strep-proteína de membrana interacção experimento (Membrane-SPINE) ^6. Ele baseia-se no método da coluna vertebral, que era apenas adequado para proteínas solúveis ^7.

Benefícios membrana da coluna vertebral de duas vantagens do....

Protocolo

Nota: Informações detalhadas sobre tampões indicados no protocolo está disponível na Tabela 1.

1. Fixação de interações proteína-proteína por formaldeído Cross-ligando em células vivas

1. Para começar a preparar meios de cultura, soluções de reserva e de tampão P1
   1. Prepare 500 ml meio: O meio deve proporcionar condições que suportam a interação entre a proteína isca membrana e proteínas presas. Além disso, um experimento deve ser realizado sob condições em que se espera nenhuma interação (por exemplo, sem cross-linking).
      Nota: Nós comparamos interações proteína-proteína em bactérias estress....

Resultados

A análise da membrana COLUNA permite co-purificação de proteínas da membrana e transitoriamente interagindo parceiros proteicos. O co-purificação é conseguido usando o agente formaldeído cross-linking. Dois parâmetros são críticos para evitar inespecíficas ligações cruzadas: a concentração de formaldeído e o tempo de reticulação. A utilização suficientes, mas não excessivas de formaldeído pode ser facilmente controlada por imunotransferência. Complexos proteicos formaldeído reticulado pode ser separado por ebulição mas .......

Discussão

Análise Membrane coluna vertebral é uma abordagem bioquímica que permite que se confirmar e identificar este ponto parceiros de interação desconhecidos de proteínas de membrana. Membrana COLUNA combina in vivo cross-linking por formaldeído com purificação de uma proteína de membrana isca Strep-marcado. A combinação com imunotransferência facilita a confirmação de parceiros de interacção previstas (Figura 2). Além disso, a combinação com análise MS permite a identificação de parceiros de interac.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
37% de formaldeído	Roth	4979.1	Não deve ter mais de um ano
DNaseI	Sigma	DN25
Kit de ensaio de proteína BCA	Pierce	23225
Haste micromagnética	Roth	0955.2	5 mm de comprimento, 2 mm de diâmetro
Triton X-100	Roth	6683.1	detergente padrão para solubilização
n-Dodecil-β-maltosídeo	Glycon	D97002-C	o melhor detergente para solubilizar CpxA
1 ml de coluna de fluxo gravitacional de superfluxo de estreptococo	tactina IBA	2-1207-050
Conjunto de tampão de purificação de proteínas Strep-tag	IBA	2-1002-001	Contém tampão W e tampão E
Filtro centrífugo Amicon Ultra-4	Millipore	UFC803024
SuperSignal West Pico Substrato quimioluminescente	Pierce	34080
SilverQuest Silverstaining kit	Invitrogen	LC6070
FireSilver Staining	Kit Proteome Factory	P-S-2001
Ultracentrifuge