Membrana-COLUNA: Uma Ferramenta bioquímicos na identificação de interações proteína-proteína de Proteínas de Membrana In Vivo

Para entender a função de uma proteína que é essencial conhecer os seus parceiros de interação. Várias técnicas clássicas estão disponíveis para a identificação de parceiros de interacção de proteínas solúveis. No entanto, estas técnicas não são facilmente transferíveis para a membrana proteínas, devido à sua natureza hidrofóbica ^4. Para ultrapassar esta limitação, foi desenvolvido o Strep-proteína de membrana interacção experimento (Membrane-SPINE) ^6. Ele baseia-se no método da coluna vertebral, que era apenas adequado para proteínas solúveis ^7.

Benefícios membrana da coluna vertebral de duas vantagens do formaldeído agente de reticulação: primeiro, o formaldeído pode facilmente penetrar as membranas e, consequentemente, gera uma imagem precisa da interactoma de uma célula viva ^8. Em segundo lugar, formaldeído ligações cruzadas pode ser revertida por ebulição ^9. Aqui, estas duas vantagens são usados ​​para identificar não só IPP permanentes, mas também transientes de prote membranains ^6.

Em resumo, um Strep-tag está fundido com o terminal C da proteína de membrana integral isca. As células que expressam a proteína de membrana de isca são incubadas com formaldeído, que as ligações cruzadas atacam proteínas para a proteína isco membrana (Figura 1). Modificações de proteínas presas não são necessários. Em seguida, a fracção de membrana é preparado. Portanto, as proteínas da membrana são solubilizados por tratamento com detergente e isca proteínas são co-purificados com suas proteínas presas utilizando a purificação por afinidade. Subsequentemente, a ligação transversal é invertida por ebulição, e o isco e suas proteínas presa co-eluidas são separadas por SDS-PAGE. Finalmente, as proteínas de presa pode ser identificado por análise de imunotransferência ou espectrometria de massa.

Nota: Informações detalhadas sobre tampões indicados no protocolo está disponível na Tabela 1.

1. Fixação de interações proteína-proteína por formaldeído Cross-ligando em células vivas

1. Para começar a preparar meios de cultura, soluções de reserva e de tampão P1
   1. Prepare 500 ml meio: O meio deve proporcionar condições que suportam a interação entre a proteína isca membrana e proteínas presas. Além disso, um experimento deve ser realizado sob condições em que se espera nenhuma interação (por exemplo, sem cross-linking).
      Nota: Nós comparamos interações proteína-proteína em bactérias estressados ​​e não-estressados. Portanto, podemos preparar 500 ml de Luria Bertani (LB) (Tabela 1) que complementar com um agente de indução de stress (por exemplo, NaCl a 0,5 M) num frasco de 2 L de Erlenmeyer. Para o controle, usamos meio LB normal com 0,17 M de NaCl (pH 7,0).
   2. Preparar tampão Tris (20 mM Tris-HCl, pH 8,0) e 0,1 M de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), pH 8,0 solução de estoque (Tabela 1).
   3. Prepare tampão P1. Dissolve-se a sacarose a uma concentração final de 0,5 M em tampão Tris. Esterilizar tampão P1 por filtração e armazená-lo a 4 ° C.
2. Crescer as células que expressam a proteína de membrana de isco com uma fusão C-terminal de Strep-tag de um vector. Induzem a expressão de proteínas de membrana de isco durante um tempo suficiente.
   Nota: Foram induzir a expressão de proteínas de membrana bacterianas isca em fase-log precoce (A ₆₀₀ = 0,3) pela adição de 250 ul de 1 M isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) para 500 ml de meio (concentração final: 0,5 mM) . Para permitir uma expressão suficiente, que incuba-se as bactérias até à fase de fim de registo (A ₆₀₀ = 1,2).
3. Prepare-se para cada uma cultura de duas provetas de centrifugação com um volume mínimo de 300 ml de cada um e colocá-las sobre gelo.
4. Realize formaldeído cross-linking.
   CAUÇÃO: O formaldeído é altamente tóxico Recomendamos trabalhando sob uma coifa de segurança..
   1. Transfira o recipiente de cultura sob uma coifa de segurança. Dividir cada amostra em duas amostras, uma omissão de reticulação (- X) e uma incluindo o formaldeído de reticulação (+ X). Adicionar 4 ml de solução de formaldeído a 37% e 250 ml de cultura para atingir uma concentração final de 0,6%.
5. Transfira os recipientes de cultura para trás e cultivar células por mais 20 min como antes.
6. Preencha seus culturas dentro dos tubos de centrífuga sob uma coifa de segurança. Recolher as células por centrifugação a 3000 xg durante 30 min.
7. Elimine o sobrenadante com cuidado pipetando-lo sob uma coifa de segurança. Colete tóxico sobrenadante contendo formaldeído e descartá-la adequadamente.
8. A fim de atingir o rendimento ideal durante a preparação de proteínas de membrana, preparar esferoplastos primeiro. Aqui, nós fornecemos um protocolo para a formação de esferoplastos de bactérias Gram-negativas:
   1. Prepartampão e P2 (Tabela 1) a partir de pó liofilizado. Suavemente dissolver 2 mg de lisozima em 0,1 M de EDTA, pH 8, num tubo de 1,5 ml. Sempre preparar tampão P2 na hora para o dia do experimento.
   2. Prepare Tris-buffer com inibidor de protease (P3 buffer). A 10 ml de tampão Tris, adicionar 0,1 ml de 1 M de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) (Tabela 1) para uma concentração final de 10 mM. Use o tampão imediatamente, para garantir o funcionamento adequado da PMSF como inibidor da protease.
   3. Os sedimentos de células Ressuspender em 10 ml de tampão Tris com inibidor de protease e solução de transferência para um tubo de 15 ml.
   4. Adicionar 1 ml de tampão P2 e incubar em gelo durante 30 min.
   5. Recolhe esferoplastos por centrifugação a 3000 xg durante 30 minutos e descartar o sobrenadante cuidadosamente.
9. Incubar as pelotas de esferoplastos a noite a -20 ° C.

2. Purificação de Strep-tag Membrane Protein (Bait)

1. Coloque esferoplasto pellet no gelo. </ Li>
2. Durante o tempo dos peletes de esferoplastos descongelar em gelo, 10 ml de preparar P3 tampão para cada preparação de esferoplastos. Suavemente dissolver 1 mg ADNasel em 10 ml de tampão Tris. Adicionar 0,1 ml de 1 M de PMSF imediatamente antes da utilização.
3. Ressuspender o sedimento em 6 ml P3 preparada de fresco. Sonicar a amostra quatro vezes durante 1 min de forma contínua em gelo com 1 min de pausa entre cada explosão, de forma a interromper os esferoplastos.
4. Centrifugar a amostra a 10.000 xg durante 10 minutos para colher os detritos celulares. Transferir o sobrenadante com uma pipeta para um tubo de ultracentrifugação.
5. Sedimentar a fracção de membrana a 100.000 xg durante 30 min. Lavar o sedimento cuidadosamente em Tris-tampão sem dissolver. Seque o tubo com um lenço de papel (por exemplo, lenços de papel). Evitar perturbar o sedimento, em qualquer momento.
6. Ressuspender o sedimento (= membranas) cuidadosamente em 1 ml de tampão Tris. Use uma alíquota de 20 ul para determinar a concentração de proteína pelo ensaio de BCA por exemplo. Neste passo, as membranas podem ser congelados em choque liquid azoto e armazenada a -80 ° C.

3. Purificação de Strep-tag Membrana Isca proteína e SDS-PAGE

1. Normalizar a concentração de proteína da fracção de membrana de 5 mg / ml com tampão Tris. Tome 2,5 ml da fracção de membrana (5 mg / ml) num tubo de ultracentrifugação e adicionar 0,25 ml de 20% Triton X-100 para se atingir uma concentração final de 2%, a fim de solubilizar as proteínas da membrana. Adicionar uma haste de micro-magnético e agita-se em gelo durante 1 hr.
   Nota: Apesar de, em geral, temos bons resultados com o Triton X-100 como detergente, pode ser útil para mudar o detergente para otimização. A este respeito, temos os melhores resultados com os detergentes utilizados para a purificação funcional da respectiva proteína isco membrana.
2. Embora a realização do passo 3.1, preparar 50 ml de tampão W e 5 ml de tampão E (Tabela 1). Encha-se 10 mL de 5x tampão W concentrado para 50 ml e adicionar 150 ul de 20% de Triton X-100.
   1. Encha-se 1 ml de 5x buffer E concentrado para 10 ml e adicionar 30 ul de 20% de Triton X-100. Equilibrar um Strep-Tactin coluna de fluxo de 1 ml superfluxo gravidade com 8 ml de tampão de W.
      Nota: É essencial para adicionar o detergente utilizado para a solubilização em uma concentração de 10 vezes acima da concentração micelar crítica (CMC) em qualquer solução durante o processo de purificação.
3. Retirar a vareta micro-magnético a partir da amostra de solubilização e de ultracentrifugação a 100000 xg durante 30 minutos, para sedimentar a fracção de membrana insolúvel. Retirar o sobrenadante utilizando uma pipeta para purificação adicional.
4. Carrega-se o sobrenadante para a coluna. Executar a coluna só com fluxo por gravidade. Lavar a coluna com 5 ml de tampão W. Repetir esta etapa de lavagem 5x.
5. Eluir as proteínas de membrana de isca com 1 ml de tampão E. Repita este passo de eluição de 4x.
6. Concentra-se as fracções de eluição 2, 3 e 4, até 300 ml, com uma unidade de filtração centrífuga.
7. Misturar 200 ul de cada amostra com 50 mL de 5x de SDS-PAGCorante de carga de E. Divida cada preparação em 125 mL alíquotas. Ferver uma alíquota de cada preparação durante 20 min a 95 ° C, para reverter ligações cruzadas de formaldeído. Deixe as amostras arrefecer para a temperatura ambiente durante pelo menos 10 min, em cima da bancada.
8. Carga de 30 ul de cada amostra para uma única pista de um gel de poliacrilamida-gel adequado para imunoblotting. Use um marcador prestained peso molecular para uma melhor orientação e executar SDS-PAGE ^10.

4. Análise Imunoblot para confirmar parceiros de interação

1. Uma vez que o passo 3.8 for concluída, proteínas de transferência para uma membrana de nitrocelulose por exemplo semidry.
2. Bloquear a membrana para evitar a marcação não específica. Preparar o tampão de bloqueio por pesagem de albumina sérica bovina (BSA) para atingir o peso de 3% por volume em soro fisiológico tamponado com Tris suplementado com uma concentração final de 0,05% de Tween-20 (TBS-T). Utilizar um volume suficiente de tampão de bloqueio para cobrir a membrana. Bloquear a membrana durante 1 hora a RT.
3. Diluir umaª incubar o primeiro anticorpo específico da proteína presa como de costume. Usar um anticorpo ligado a HRP como o segundo anticorpo.
4. Desenvolver a imunotransferência utilizando um kit de detecção quimioluminescente com alta sensibilidade. Monitorar o sinal através de um procedimento de processamento de filmes clássicos ou equipamentos de imagem digital.

5. NanoLC-ESI-MS/MS de alta resolução Experimentos para identificar parceiros de interação

1. No caso em que nenhum anticorpo específico está disponível para a proteína presa ou parceiros de interacção desconhecidos devem ser identificadas, utilizar a espectrometria de massa (MS) para a identificação. A fim de evitar a contaminação da queratina, usar géis precasted para a separação de proteínas.
2. Prata manchar a SDS-PAGE utilizando um kit de coloração MS-compatível de acordo com o protocolo do fabricante. Execute todas as etapas de coloração e lavagem de tanques de vidro.
3. Especiais de Consumo respectivas bandas e analisar estes de alta resolução por LC / MS ^9.

A análise da membrana COLUNA permite co-purificação de proteínas da membrana e transitoriamente interagindo parceiros proteicos. O co-purificação é conseguido usando o agente formaldeído cross-linking. Dois parâmetros são críticos para evitar inespecíficas ligações cruzadas: a concentração de formaldeído e o tempo de reticulação. A utilização suficientes, mas não excessivas de formaldeído pode ser facilmente controlada por imunotransferência. Complexos proteicos formaldeído reticulado pode ser separado por ebulição mas não por meio de tratamento de SDS. Assim, eles podem ser visualizados após a secagem da proteína isca membrana Strep-marcado como mancha na parte superior da imuno-blot de uma amostra não fervida.

Um resultado representativo de um ensaio de membrana de coluna, incluindo todos os controlos necessários, é apresentado na Figura 2. Como a proteína isco a CpxA proteína de membrana integral de Escherichia coli foi usada 6,11. CpxA é um sensor de quinase e consiste numaSensor de domínio N-terminal, com dois domínios transmembranares (DTM) integrando um grande domínio extracitoplasmático do sensor e um altamente conservada do domínio catalítico citoplasmático C-terminal 12. Após a estimulação, CpxA ativa seu cognato CpxR regulador de resposta. Ativado CpxR difunde fora para mediar a resposta. Para Membrana coluna, o Strep-tag foi fundido com o terminal C de CpxA (CpxA-Strep). CpxA-Strep reticulado a outras proteínas ou complexos de proteína é detectado como uma mancha na amostra tratada com formaldeído não fervido (Figura 2, linha 1 versus linha 3) indicando suficiente reticulação. Além disso, uma interacção proteína-proteína directa de CpxA-Strep com o seu cognato regulador resposta CpxR proteína como a proteína de presa é apenas detectável na presença de formaldeído (Figura 2, linha 2 versus linha 4) apoiando a especificidade de formaldeído reticulação.

Um resultado representativo de uma análise de membrana coluna vertebral é apresentado in Figura 3. As amostras que correspondem às da Figura 2 foram corados com prata. A seta assinala uma banda que é específica para a amostra fervida. Devido ao fundo, a análise MS também identificou outras proteínas além CpxR 6. Portanto, a não-formaldeído amostra tratada deverá sempre ser analisada, para atribuir o ruído de fundo e um parceiro de interacção específica.

Tabela 1: Tampões e reagentes necessários para membrana espinha.

Figura 1. Fluxograma do processo de membrana-espinha usando uma proteína da membrana Escherichia coli como proteína isca. A) As bactérias que expressam a Strep-tag proteína isca membrana são tratados com formaldeído. Formaldeído penetra membranas e ligações cruzadas presa proteínas para a isca membrana proteína. B) A fração de membrana é preparado e as proteínas da membrana são solubilizado por tratamento com detergente. Subsequentemente, as proteínas de presa são co-purificados com a proteína isco. C) formaldeído ligações cruzadas são invertidos por ebulição e as proteínas são separadas por SDS-PAGE. Finalmente, as proteínas ou são presas monitorizada por imunotransferência (D) ou identificados por MS-analise (E). Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 2. Immunoblot representativas utilizado para monitorizar um PPI de uma proteína de membrana. Bactérias produtoras CpxA-Strep a partir de um plasmídeo, como isco de proteína de membrana, foram cultivadas em meio LB para uma OD 600 de 1 e expostos ao formaldeído (CH 2 O) durante 20 min. A fracção de membrana interna foi preparada, as proteínas da membrana foram solubilizadas por tratamento com detergente e CpxA-Strep foi purificado (pistas 1 e 2). Bactérias produtoras de qualquer CpxA-Strep, sem tratamento com formaldeído (pistas 3 e 4) ou que transporta o vector vazio, com tratamento com formaldeído (pistas 5 e 5) serviram como controlos. Alíquotas de cada amostra foram fervidas a 95 ° C durante 20 min(faixas 2, 4 e 6) para separar as proteínas com ligação cruzada de CpxA-Strep. As proteínas foram separadas em 12,5% de SDS-PAGE. A imunotransferência foi realizada e o blot foi separado de acordo com o tamanho de CpxA-Strep (51 kDa) e as proteínas respectivas presas CpxR (26 kDa). As duas partes do imunoblot foram incubadas com anticorpos policlonais produzidos contra CpxA e CpxR, respectivamente. Subsequentemente, as transferências foram ainda tratados com um anticorpo anti-coelho, cavalo (HRP) e desenvolvida utilizando o substrato quimioluminescente SuperSignal West Pico. A seta marca produtos de degradação de CpxA. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 3. Representante corado com prata de SDS-PAGE utilizado para a identificação de um iparceiro nteraction de uma proteína de membrana por análise por MS. amostras correspondentes aos da figura 2 foram corados com prata. A seta assinala uma banda que foi analisada por análise MS e que confirmou CpxR como o parceiro de interação de CpxA 5. Pista 7 mostra purificado CpxR-Sua 6 e pista 8 mostra purificado CpxA-6 Sua proteína. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Não temos nada a divulgar.