Summary
Une approche biochimique est décrite in vivo pour identifier les interactions protéine-protéine dans (PPI) de protéines membranaires. Le procédé combine la réticulation des protéines, purification par affinité et la spectrométrie de masse, et peut être adapté à presque n'importe quel type de cellule ou un organisme. Avec cette approche, même l'identification des IPP transitoires devient possible.
Abstract
Les protéines membranaires sont essentielles pour la viabilité des cellules et sont donc des cibles thérapeutiques importantes 3.1. Comme ils fonctionnent dans des complexes 4, méthodes pour identifier et caractériser leurs interactions sont nécessaires 5. À cette fin, nous avons développé l'expérience d'interaction Strep-protéine de membrane, appelée membrane-SPINE 6. Cette technique combine in vivo de réticulation réversible à l'aide du formaldéhyde agent de réticulation avec une purification par affinité de la protéine d'appât de la membrane à étiquette Strep. Au cours de la procédure, les protéines de proies réticulés sont co-purifiés avec la protéine appât de la membrane et ensuite séparées par ébullition. Ainsi, deux grandes tâches peuvent être exécutées lors de l'analyse des interactions protéine-protéine (IPP) de protéines membranaires en utilisant membrane-SPINE: d'abord, la confirmation d'un partenaire d'interaction proposé par immunoblot, et d'autre part, l'identification de nouveaux partenaires d'interaction par spectrométrie de masse . En outre, même low affinité, les IPP transitoires sont détectables par cette technique. Enfin, Membrane-SPINE est adaptable à presque n'importe quel type de cellule, qu'il s'applique à un outil de dépistage pour identifier des IPP de protéines membranaires.
Introduction
Pour comprendre la fonction d'une protéine, il est essentiel de connaître ses partenaires d'interaction. Plusieurs techniques classiques sont disponibles pour l'identification des partenaires d'interaction de protéines solubles. Cependant, ces techniques ne sont pas facilement transférables à des protéines membranaires du fait de leur nature hydrophobe 4. Pour contourner cette limitation, nous avons développé la membrane Strep-protéine interaction expérience (Membrane-SPINE) 6. Il est basé sur la méthode de la colonne vertébrale, qui était uniquement pour les protéines solubles 7.
Membrane-SPINE bénéficie de deux avantages de la formaldéhyde agent de réticulation: d'abord, le formaldéhyde peuvent facilement pénétrer les membranes et donc génère un aperçu précis de l'interactome d'une cellule vivante 8. Deuxièmement, le formaldéhyde liaisons transversales peuvent être inversées en faisant bouillir 9. Ici, ces deux avantages sont utilisés pour identifier non seulement les IPP permanents mais aussi transitoires de prote de la membraneins 6.
En bref, une Strep-tag est fusionnée à l'extrémité C-terminale de la protéine appât membranaire intégrale. Les cellules exprimant la protéine appât de la membrane sont mises en incubation avec du formaldéhyde qui réticule les protéines s'attaquent à la protéine appât de la membrane (Figure 1). Les modifications des protéines de la proie ne sont pas nécessaires. Ensuite, la fraction membranaire est préparée. Par conséquent, les protéines membranaires sont solubilisés par traitement avec un détergent et de l'appât protéines sont co-purifiés avec ses protéines de proie en utilisant une purification par affinité. Par la suite, la liaison réticulée est inversé par ebullition, et l'appât et de proie ses protéines co-éluées sont séparés par SDS-PAGE. Enfin, les protéines de proie peuvent être identifiés par une analyse par immunotransfert ou spectrométrie de masse.
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Protocol
Remarque: Les informations détaillées concernant les tampons indiquées dans le protocole est disponible dans le tableau 1.
Une. Fixation des interactions protéine-protéine par formaldéhyde réticulation dans les cellules vivantes
- Pour commencer la préparation des milieux de culture, solutions mères et de tampon P1
- Préparer 500 ml de milieu: Le milieu doit offrir des conditions qui favorisent l'interaction entre les protéines membranaires de protéines appâts et proies. En outre, une expérience doit être réalisée dans des conditions où l'on prévoit aucune interaction (par exemple, sans réticulation).
Note: Nous comparons les interactions protéine-protéine dans des bactéries stressées et non stressées. Par conséquent, on prépare 500 ml de milieu Luria Bertani (LB) (tableau 1) que nous sommes complémentaires avec un agent inducteur de stress (par exemple NaCl 0,5 M) dans un ballon d'Erlenmeyer de 2 litres. Pour le contrôle, nous utilisons milieu LB normale avec 0,17 M de NaCl (pH 7,0). - Préparer du tampon Tris (20 mM Tris-HCl, pH 8,0) et 0,1 M d'acide éthylènediaminetétra-acétique (EDTA), pH 8,0, solution mère (Tableau 1).
- Préparer tampon P1. Dissoudre le saccharose à une concentration finale de 0,5 M dans du tampon Tris. Stériliser tampon P1 par filtration et stocker à 4 ° C.
- Préparer 500 ml de milieu: Le milieu doit offrir des conditions qui favorisent l'interaction entre les protéines membranaires de protéines appâts et proies. En outre, une expérience doit être réalisée dans des conditions où l'on prévoit aucune interaction (par exemple, sans réticulation).
- Cultiver des cellules exprimant la protéine appât de la membrane avec une Strep-tag fusion C-terminale à partir d'un vecteur. Induire l'expression de protéines d'appât de la membrane pendant une durée suffisante.
Note: on induit l'expression de protéines d'appât de la membrane bactérienne lors de la phase précoce-log (A 600 = 0,3) par addition de 250 ul de 1 M d'isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) à 500 ml de milieu (concentration finale: 0,5 mM) . Afin de permettre une expression suffisante, l'incubation de la bactérie jusqu'à la phase logarithmique tardive (A 600 = 1,2). - Préparer pour chaque culture deux béchers de centrifugation d'un volume minimum de 300 ml chacun et de les placer sur la glace.
- Effectuer formaldéhyde réticulation.
CAUTION: Le formaldéhyde est hautement toxique Nous recommandons de travailler sous une hotte de sécurité..- Transférer le récipient de culture sous une hotte de sécurité. Diviser chaque échantillon en deux échantillons, l'un en omettant de réticulation (- X) et y compris le formaldéhyde une réticulation (+ X). Ajouter une solution de 4 ml de formaldéhyde à 37% à 250 ml de la culture pour parvenir à une concentration finale de 0,6%.
- Transférer les récipients de culture en arrière et cultiver des cellules pour 20 minutes supplémentaires comme avant.
- Remplissez vos cultures dans les tubes de centrifugation sous une hotte de sécurité. Recueillir les cellules par centrifugation à 3000 xg pendant 30 min.
- Rejeter le surnageant par pipetage avec précaution sous une hotte de sécurité. Recueillir toxique surnageant contenant du formaldéhyde et jetez-la.
- Afin d'atteindre un rendement optimal lors de la préparation de protéine membranaire, de préparer d'abord des sphéroplastes. Ici, nous fournissons un protocole pour la formation de sphéroplastes de bactéries à Gram négatif:
- Prepare tampon P2 (tableau 1) à partir de poudre lyophilisée. Dissoudre doucement 2 mg de lysozyme dans 0,1 M d'EDTA, pH 8, dans un tube de 1,5 ml. Toujours préparer fraîchement tampon P2 pour le jour de l'expérience.
- Préparer le tampon Tris avec un inhibiteur de la protéase (P3 tampon). A 10 ml de Tris-tampon, ajouter 0,1 ml de 1 M de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) (tableau 1) à une concentration finale de 10 mM. Utiliser le tampon immédiatement, afin d'assurer le bon fonctionnement de PMSF comme inhibiteur de protéase.
- culots cellulaires d'Remettre en suspension dans 10 ml de Tris-tampon avec un inhibiteur de protéase et de la solution de transfert à un tube conique de 15 ml.
- Ajouter 1 ml de tampon P2 et incuber sur de la glace pendant 30 min.
- Recueillir sphéroplastes par centrifugation à 3000 g pendant 30 min et éliminer le surnageant avec précaution.
- Incuber les pastilles de sphéroplastes pendant une nuit à -20 ° C.
2. Purification de Strep-tag Membrane Protein (Bait)
- Placez sphéroplaste pastille sur la glace. </ Li>
- Pendant le temps des pastilles de sphéroplaste dégel sur la glace, préparer 10 ml de tampon P3 pour chaque préparation sphéroplaste. Dissoudre délicatement 1 mg DNaseI dans 10 ml de Tris-tampon. Ajouter 0,1 ml de 1 M de PMSF juste avant utilisation.
- Reprendre le culot dans 6 ml de P3 fraîchement préparé. Soniquer l'échantillon quatre fois pendant 1 min en continu sur de la glace avec 1 min de pause entre chaque rafale, afin de perturber les sphéroplastes.
- Centrifuger l'échantillon à 10 000 xg pendant 10 minutes à des débris de cellules de la récolte. Transférer le surnageant à l'aide d'une pipette dans un tube d'ultracentrifugation.
- Sédimenter la fraction membranaire à 100 000 xg pendant 30 min. Laver le culot avec soin dans du tampon Tris sans dissolvant. Sécher le tube avec un mouchoir en papier (par exemple Kleenex). Ne pas perturber le culot, à tout moment.
- Reprendre le culot (= membranes) avec précaution 1 ml de Tris-tampon. Utiliser une fraction aliquote de 20 ul de déterminer la concentration en protéine par dosage BCA par exemple. À cette étape, les membranes peuvent être congelés dans un choc lichique azote et conservés à -80 ° C.
3. Purification de Strep-tag Membrane Protein Bait et SDS-PAGE
- Normaliser la concentration en protéines de la fraction membranaire à 5 mg / ml avec du tampon Tris. Prendre 2,5 ml fraction de membrane (5 mg / ml) dans un tube d'ultracentrifugation et ajouter 0,25 ml de 20% de Triton X-100 pour atteindre une concentration finale de 2%, afin de solubiliser les protéines membranaires. Ajouter une tige micro-magnétique et remuer sur de la glace pendant 1 heure.
Remarque: Bien que, en général, nous avons de bons résultats en utilisant du Triton X-100 comme détergent, il peut être utile de modifier le détergent pour l'optimisation. A cet égard, il faut obtenir les meilleurs résultats avec les détergents utilisés pour la purification de la protéine fonctionnelle de l'appât de la membrane respective. - Tout en exécutant l'étape 3.1, de préparer 50 ml de tampon B et 5 ml de tampon E (tableau 1). Remplir 10 ml 5x tampon W concentré à 50 ml et ajouter 150 ul 20% de Triton X-100.
- Remplir 1 ml 5x Buffer E concentré à 10 ml et ajouter 30 ul de 20% de Triton X-100. Equilibrer une colonne de débit 1 ml Strep-Tactin superflow gravité avec 8 ml de tampon W.
Remarque: il est essentiel d'ajouter le détergent utilisé pour la solubilisation dans un facteur 10 de la concentration au-dessus de la concentration micellaire critique (cmc) dans tout le tampon au cours de la procédure de purification.
- Remplir 1 ml 5x Buffer E concentré à 10 ml et ajouter 30 ul de 20% de Triton X-100. Equilibrer une colonne de débit 1 ml Strep-Tactin superflow gravité avec 8 ml de tampon W.
- Retirer la tige de micro-magnétique à partir de l'échantillon de solubilisation et par ultracentrifugation à 100000 g pendant 30 min, pour obtenir un culot de la fraction membranaire insoluble. Retirer le surnageant avec une pipette pour une purification supplémentaire.
- Charger le surnageant à la colonne. Exécutez la colonne uniquement avec écoulement par gravité. Laver la colonne avec 5 ml de tampon W. Répétez cette étape de lavage 5x.
- Éluer protéines appâts de la membrane avec 1 ml de tampon E. Répétez cette étape d'élution 4x.
- Concentrer les fractions d'élution 2, 3, et 4 à 300 ul avec une unité de filtre centrifuge.
- Mélanger 200 ul de chaque échantillon avec 50 pi 5x SDS-PAGE colorant de chargement. Fendez chaque préparation dans 125 aliquotes. Faire bouillir une fraction aliquote de chaque préparation pendant 20 min à 95 ° C, pour inverser formaldéhyde liaisons transversales. Laissez refroidir les échantillons à la température ambiante pendant au moins 10 min au-dessus de banc.
- Charge: 30 ul de chaque échantillon à une seule voie d'un gel de polyacrylamide-adapté à un immunotransfert. Utilisez un marqueur Prestained de poids moléculaire pour une meilleure orientation et exécuter SDS-PAGE 10.
4. Analyse par immunoblot pour confirmer interaction Partenaires
- Une fois l'étape 3.8 est terminée, protéines de transfert sur une membrane de nitrocellulose par exemple demi-sec.
- Bloquer la membrane pour éviter l'étiquetage imprécis. Préparer le tampon de blocage en pesant le sérum-albumine bovine (BSA) pour atteindre 3% en poids par volume dans une solution saline tamponnée au Tris supplémenté avec une concentration finale de 0,05% de Tween-20 (TBS-T). Utiliser un volume suffisant de tampon de blocage pour couvrir la membrane. Bloquer la membrane pendant 1 heure à température ambiante.
- Diluer unend incuber le premier anticorps spécifique de la protéine proie comme d'habitude. Utilisation d'un anticorps HRP-lié en tant que second anticorps.
- Développer l'immunoblot en utilisant un kit de détection de chimioluminescence avec une grande sensibilité. Surveiller le signal en utilisant une procédure de traitement de film classique ou de l'équipement d'imagerie numérique.
5. NanoLC-ESI-MS/MS haute résolution expériences pour repérer interaction Partenaires
- Dans le cas où aucun anticorps spécifique est disponible pour la protéine proie ou partenaires d'interaction inconnus doivent être identifiés, utiliser la spectrométrie de masse (MS) pour l'identification. Afin d'empêcher la contamination de la kératine, en utilisant des gels precasted pour la séparation des protéines.
- Coloration à l'argent du SDS-PAGE en utilisant un kit de coloration MS-compatible selon le protocole du fabricant. Effectuez toutes les étapes de lavage et coloration dans les réservoirs de verre.
- Accise bandes respectives et analyser ceux-ci en haute résolution LC / MS 9.
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Representative Results
Analyse membrane RACHIS permet la co-purification des protéines membranaires et interagissant de manière transitoire partenaires protéiques. La co-purification est réalisée en utilisant l'agent formaldéhyde transversale de liaison. Deux paramètres sont critiques pour éviter des liaisons transversales non spécifiques: la concentration en formaldéhyde et le temps de réticulation. L'utilisation suffisante, mais non excessive de formaldéhyde peut être facilement contrôlé par immuno. Complexes protéiques formaldéhyde réticulées peuvent être séparés en faisant bouillir mais pas par traitement au SDS. Par conséquent, ils peuvent être visualisées après buvard de la membrane protéine appât Strep-étiqueté comme frottis dans la partie supérieure de l'immuno-blot d'un échantillon non bouillie.
Un résultat représentatif d'un dosage à membrane colonne vertébrale, y compris tous les contrôles nécessaires, est présenté à la figure 2. Comme la protéine appât CpxA intégrante de protéine de membrane de Escherichia coli a été utilisé 6,11. CpxA est un capteur kinase et consiste en unDomaine de la sonde N-terminale de deux domaines transmembranaires (TMD) intégrant un grand domaine extracytoplasmique de la sonde et un domaine catalytique hautement conservé cytoplasmique C-terminal 12. Après stimulation, CpxA active son apparenté régulateur de réponse CpxR. Activé CpxR diffuse hors de la médiation de la réponse. Pour Membrane colonne vertébrale, le Strep-tag a été fusionnée à l'extrémité C-terminale de CpxA (CpxA-Strep). CpxA-Strep réticulé à d'autres protéines ou des complexes de protéines est détectée comme un test de l'échantillon en formaldéhyde traité non bouillie (figure 2, ligne 1 par rapport à la ligne 3) indiquant réticulation suffisante. De plus, une interaction protéine-protéine directe de CpxA-Strep avec son apparenté régulateur de réponse protéine CpxR que la protéine proie est uniquement détectable en présence de formaldehyde (Figure 2, ligne 2 par rapport à la ligne 4) de support de la spécificité de formaldéhyde réticulation.
Un résultat représentatif d'une analyse membrane colonne vertébrale est présenté in Figure 3. Les échantillons correspondant à ceux de la figure 2 ont été coloré à l'argent. La flèche indique une bande qui est spécifique pour les échantillons bouillis. En raison de l'arrière-plan, l'analyse MS a également identifié d'autres protéines en plus CpxR 6. Par conséquent, l'échantillon non traité formaldehyde doit toujours être analysé, pour affecter le bruit de fond et un partenaire d'interaction spécifique.
Tableau 1: Tampons et réactifs nécessaires à la membrane colonne vertébrale.
| Buffer / réactif / Medium | Concentration de travail | commentaire | |
|---|---|---|---|
| LB | 10 g Tryptone 5 g d'extrait de levure 10 g de NaCl à 1 L, ajuster le pH à 7,0 | Milieu Luria Broth | |
| IPTG | 1 M isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside | 0,5 mM | |
| Tampon Tris | 20 mM Tris-HCl, pH 8, | Ajuster le pH à 8,0 en utilisant du NaOH | |
| 0,1 M d'EDTA, pH 8, | EDTA 0,1 M | Ajuster le pH à 8,0 en utilisant du NaOH | |
| PMSF | 1 M de fluorure de phénylméthylsulfonyle dans de l'isopropanol à 100% | 10 mM | PMSF est stable dans l'isopropanol à 100% mais pas dans l'eau! La solution stock peut être conservé à -20 ° C; PMSF doit être adaptée à la température ambiante avant de le diluer dans un tampon; PMSF contenant des tampons doit être utilisé dans les 10 minutes de préparation. |
| P1 | 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 0,5 M de saccharose | ||
| P2 | 2 mg / ml de lysozyme dans 0,1 M EDTA, pH 7,5 | ||
| P3 | 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 10 mM de PMSF | Utilisez immédiatementdiatement après préparation | |
| Détergent | 20% de Triton X-100 | 2% pour la solubilisation | |
| Tampon W | Remplir 10 ml 5x concentrer à 50 ml ajouter 150 ul de 20% de Triton X-100 | 100 mM Tris-HCl, pH 8,0 150 mM de NaCl EDTA 1 mM, 0,06% de Triton X-100 | 5x concentré fait partie de Strep-tag purification des protéines jeu de tampons (IBA) |
| Buffer E | Remplir 1 ml 5x concentrer à 10 ml ajouter 30 ul de 20% de Triton X-100 | 100 mM Tris-HCl, pH 8,0 150 mM de NaCl 1 mM d'EDTA Déthiobiotine 2,5 mM 0,06% de Triton X-100 | 5x concentré fait partie de Strep-tag purification des protéines jeu de tampons (IBA) |
| 5x SDS-PAGE colorant de charge | 0,3125 M de Tris-HCl, pH 6,8 SDS à 10% 0,5 M DTT 50% de glycérol |
Figure 1. Diagramme de la procédure membrane-SPINE en utilisant une protéine de membrane d'Escherichia coli comme protéine appât. A) Les bactéries exprimant la protéine de membrane d'appât Strep-marqué sont traités au formaldéhyde. Le formaldéhyde pénètre dans les membranes et les liaisons transversales des protéines s'attaquent à la membrane de la protéine appât. B) La fraction membranaire est préparée et des protéines de membrane sont solubilisés par traitement avec un détergent. Par la suite, les protéines de proies sont co-purifiés avec la protéine appât. Formaldéhyde C) des liaisons transversales sont inversées par ébullition et les protéines sont séparées par SDS-PAGE. Enfin, les protéines proies sont soit contrôlées par immuno-empreinte (D) ou identifiés par MS-analyse (E). Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 2. Immunoblot représentatif utilisé pour surveiller un PPI d'une protéine de membrane. Bactéries productrices CpxA-Strep à partir d'un plasmide tel que protéine appât de la membrane, ont été cultivées dans du milieu LB à une DO600 de 1 et on l'expose à du formaldéhyde (CH 2 O) pendant 20 min. La fraction de membrane interne a été préparé, les protéines membranaires ont été solubilisés par traitement avec un détergent et CpxA-Strep a été purifié (pistes 1 et 2). Les bactéries produisant soit CpxA-Strep sans traitement au formaldehyde (des pistes 3 et 4), ou portant le vecteur vide avec un traitement au formaldehyde (les voies 5 et 5) ont servi de témoins. Des aliquotes de chaque échantillon ont été bouillis à 95 ° C pendant 20 min(pistes 2, 4 et 6) pour séparer les protéines réticulées de CpxA-Strep. Les protéines ont été séparées dans une SDS-PAGE à 12,5%. L'immunotransfert a été réalisé et le blot a été séparée en fonction de la taille de CpxA-Strep (51 kDa) et les protéines de proies respectives CpxR (26 kDa). Les deux parties de l'immunoblot ont été incubées avec des anticorps polyclonaux dirigés contre CpxA et CpxR, respectivement. Par la suite, les blots ont ensuite été traitées avec un anticorps anti-lapin de cheval (HRP) et développés en utilisant le substrat chimiluminescent SuperSignal West Pico. La flèche marque de produits de dégradation de CpxA. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 3. Représentatif coloré à l'argent de SDS-PAGE, utilisé pour l'identification d'un interaction partenaire d'une protéine de membrane par l'analyse MS. échantillons correspondant à ceux de la figure 2 ont été coloré à l'argent. La flèche indique une bande qui a été analysé par analyse MS et qui ont confirmé CpxR que le partenaire d'interaction de CpxA 5. Lane 7 montre purifiés CpxR-His 6 et 8 voies spectacles purifiés CpxA 6-His protéine. Cliquez ici pour agrandir l'image .
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Discussion
Analyse membrane colonne vertébrale est une approche biochimique que l'on permet de confirmer et d'identifier à ce point inconnus partenaires d'interaction de protéines membranaires. Membrane SPINE combine in vivo réticulation par le formaldéhyde à la purification d'une protéine appât de membrane Strep-marqué. La combinaison avec des immuno-empreinte facilite la confirmation de partenaires d'interaction prédites (Figure 2). En outre, la combinaison avec l'analyse MS permet l'identification de partenaires d'interaction inconnus (Figure 3). Pour les deux applications, il n'est pas nécessaire de modifier votre protéine proie. De plus, la membrane colonne vertébrale est suffisamment sensible pour permettre la détection des protéines proies endogènes 6.
Ici, nous présentons un protocole optimisé pour des protéines membranaires de bactéries gram-négatives. L'enveloppe de bactéries gram-négatives sépare le cytoplasme à partir de l'environnement et possèdent, en plus de l'membrane cytoplasmique, une membrane extérieure et un sacculus de murein. Ainsi, notre protocole comprend l'enlèvement de la membrane externe et le saccule de muréine, ce qui entraîne que l'on appelle des sphéroplastes. Parce que de tels protocoles sont disponibles pour la plupart des types cellulaires, notre protocole doit être adaptable à la plupart des protéines de la membrane. En outre, les points suivants doivent être pris en considération.
Tout d'abord, le nombre de copies du vecteur utilisé pour surproduire la protéine appât de la membrane doit être équilibrée entre un niveau élevé suffisant pour permettre à la membrane de purification de protéine et un niveau bas pour empêcher des interactions non spécifiques
D'autre part, pour certaines protéines de la membrane d'une fusion N-terminale peut-être plus optimale que pour une fusion C-terminale. Dans les deux cas, la fonctionnalité de la fusion doit être confirmée par trans-complémentation.
Troisièmement, d'autres protocoles de purification d'affinité sont également compatibles avec l'analyse MS ultérieur, tel que la purification de FLAG ettandem purification par affinité (TAP). Nous préférons le Strep-tag II en raison de sa petite taille avec seulement 8 acides aminés (WSHPQFEK).
En quatrième lieu, la concentration de formaldéhyde utilisée et le temps de réticulation doit être optimisée afin d'éviter une reticulation non spécifique. Utilisation suffisante mais non excessive de formaldehyde peut être surveillée par immuno-empreinte des échantillons non bouillies comme le rapport entre réticulé et non couplées membrane protéine appât (figure 2). Des protéines réticulées comme un frottis migrent dans la partie supérieure de l'immunoblot. Les protéines non liées migrent sous forme de protéine non traitée. Le rapport entre réticulé et de la protéine non liée doit être d'environ 3:1.
Cinquièmement, il n'ya pas de "détergent générale" pour toutes les protéines membranaires pour la solubilisation. Par conséquent, dans certains cas, le détergent approprié pour la solubilisation de la protéine appât de la membrane doit être déterminée. Ainsi, le détergent choisi doit être compatible avec le Strep-tag column.
Enfin, la procédure de coloration à l'argent doit être compatible avec l'analyse MS ultérieure. Kits de coloration d'argent compatibles MS sont disponibles auprès de différents fournisseurs. Nous avons utilisé différentes ceux avec de bons résultats comparables.
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Disclosures
Nous n'avons rien à communiquer.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 et SFB940 à SH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Roth | 4979.1 | Should not be older than one year |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| Micromagnetic rod | Roth | 0955.2 | 5 mm in length, 2 mm in diameter |
| Triton X-100 | Roth | 6683.1 | standard detergent for solubilization |
| n-Dodecyl-β-maltoside | Glycon | D97002-C | the best detergent to solubilze CpxA |
| 1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column | IBA | 2-1207-050 | |
| Strep-tag protein purification buffer set | IBA | 2-1002-001 | Contains buffer W and buffer E |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter | Millipore | UFC803024 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| SilverQuest Silverstaining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| FireSilver Staining Kit | Proteome Factory | P-S-2001 | |
| Ultracentrifuge |
References
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