Luminométricos levedura e Xenopus ovócitos eletrofisiológicos Exames do mecanosensibilidade Molecular de TRPV4

Resumo

Para complementar os métodos habitualmente utilizados para estudar TRPV4 de, dois métodos são descritos: O mecanosensibilidade pode ser estudada por Ca ^{2 +-aequorina} luminometria em leveduras transgénicas após desafio com hipo-osmótico. Ele também pode ser examinada em TRPV4-ARN injectado oócitos de Xenopus a-célula inteira de dois eléctrodos de aperto de voltagem ou remendo grampo em no modo de célula ou excisadas.

Resumo

TRPV4 (Transient Receptor Potenciais, família vanilloid, tipo 4) é amplamente expresso em tecidos de vertebrados e é ativada por vários estímulos, inclusive por forças mecânicas. Certas mutações TRPV4 causar óssea hereditária complexo ou patologias neuronais em humanos. De tipo selvagem ou mutante TRPV4 transgenes são geralmente expressos em células de mamífero de cultura e examinadas por Fura-2 fluorometria e pelos eléctrodos. Em termos de mecanismo de mecanosensibilidade e as bases moleculares das doenças, a literatura atual é confuso e controverso. Para complementar os métodos existentes, descrevemos dois métodos adicionais para examinar as propriedades moleculares de TRPV4. (1) de rato e um transgene TRPV4 aequorina são transformadas em leveduras de brotamento. Um choque hipo-osmtic da população transformante produz um sinal luminométrico devido à combinação de aequorin com Ca ^{2 +,} lançado pelo canal TRPV4. Aqui TRPV4 é isolado a partir dos seus parceiros proteínas de mamíferos normaise revela o seu próprio mecanosensibilidade. (2) ARNc de TRPV4 é injectado em oócitos de Xenopus. Após um período de incubação adequado, a corrente de TRPV4 macroscópica é examinada com uma pinça de voltagem de dois eléctrodos. O aumento de corrente na eventualidade de remoção de osmótico inerte a partir do banho de oócitos é indicativo de mecanosensibilidade. Os microampere (10 ^-6 a ^-4 10 A) correntes de ovócitos são muito maiores do que os subnano a nanoampere (10 ^-10 a 10 ^-9 A) correntes de células em cultura, produzindo quantificações mais claras e avaliações mais confiantes. Correntes microscópicos que refletem as atividades das proteínas de canais individuais também pode ser registrada diretamente sob um patch clamp, em on-célula modo excisadas ou. O mesmo ovócito fornece várias amostras de patch, permitindo a replicação de melhores dados. Aspiradores aplicados aos patches podem ativar TRPV4 para avaliar diretamente mecanosensibilidade. Esses métodos devem também ser úteis no estudo de outros tipos de canais TRP.

Introdução

TRP (potenciais receptores transientes) composto por sete subfamílias de canais de cátions que servem funções sensoriais ^1,2. Nos mamíferos, TRPV, subfamília vanilloid de TRP, tem seis variedades. TRPV4 (tipo 4) ^3,4 responde ao calor, determinados produtos químicos, inchaço osmótico, ou tensão de cisalhamento. O gene TRPV4 foi repetidamente isolados por candidato a gene e / ou de clonagem de expressão ^5-8. O último método seguido resposta do produto de gene a hipo-osmolaridade. TRPV4 é expresso em quase todos os órgãos e funções do desenvolvimento, fisiologia, patologia ou de muitos tipos de células diferentes ^{de 3,4.}

Protocolo

1. Métodos Yeast luminometria

Use BYYT cepa de Saccharomyces cerevisiae. É um yvc1-tok1-derivado de BY4741 (MATA, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4). Transformar as células com o plasmídeo que expressa pEVP1/Aeq aequorina Leu-seleccionável e o rato que expressam TRPV4 plasmídeo ura-selecionável p416GPDV4, tal como descrito em ²⁶ Batiza et al. E ²⁴ Loukin et al. Utilizar métodos normalizados de construção dos plasmídeos e transformação ²⁷ . Cepa de levedura e plasmídeos estão disponíveis mediante solicitação.

Resultados

Numa experiência típica luminometria, uma gama de 400-1,200 mOsM hipotónicas choques para baixo é conseguida através da adição de 200 ul de soluções de choque de baixa osmolaridade diferente de 20 l de cultura a 1.400 mOsM. A actividade TRPV4 é evidente quando a RLU do experimental é comparada com a de dois controlos negativos: as células de levedura transformadas com o plasmídeo p416GPDV4 vazio ou um que contenha o gene TRPV4 com uma mutação no filtro de iões (Figura 1) ^24.

Discussão

Como foi dito na Introdução, os métodos comumente utilizados para estudar funções TRPV4 por vezes resultou em inconsistências e controvérsias. Os dois conjuntos de métodos aqui descritos oferecem algumas vantagens e pode complementar os métodos existentes. Enquanto que apenas descrevem estudos sobre TRPV4, os métodos podem ser estendidos para estudar outros canais iónicos bem.

1. Métodos Yeast luminometria

Brotando levedura tem uma Ca ^{2 +-resposta} influx.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Osmômetro de Pressão de Vapor	Wescor	Wescor 5500	Logan, UT, EUA
Sirius Luminômetro de Tubo Único	Titertek-Berhold	Sirius	Huntsville, LA, USA
Luminômetro de microplaca	Titertek-Berthold	Mithras LB940	Huntsville, LA, EUA
Software de luminometria	Titertek-Berthold	MikroWin2000	Huntsville, LA, USA
Braçadeira de remendo e software	Axon Instrument	HS2A headstage, braçadeira de banho aterrada virtual VG-2Ax100, amplificador GeneClamp 500, digitalizador digidata 1440, Software pClamp10	Union City, CA, EUA
Manômetro	Bio-Tec		Winooski, VT, EUA
Extrator de pipetas	Sutter Instrument Co	Modelo P-97	Novata, CA, EUA
Microinjetor	Drummond Scientific	Nanoinject II	Broomall, PA, EUA
Luciferina celenterazina	Invitrogen		Carlsbad, CA, EUA
T7 RNA polimerase reação	Ambion	mMessage mMachine	Austin, TX, EUA
Gentamicina	Sigma
Vermelho de rutênio	Sigma
Micropipetas	Micropipetas de	100 microlitros	Drummond Broomall, PA, EUA
Polimerase PfuUtra de alta fidelidade	Stratagene		La Jolla, CA, EUA