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Artigo de método

Luminométricos levedura e Xenopus ovócitos eletrofisiológicos Exames do mecanosensibilidade Molecular de TRPV4

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DOI:

10.3791/50816

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31 de dezembro de 2013

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell and Molecular Biology, University of Wisconsin – Madison, 2Department of Genetics, University of Wisconsin – Madison

Neste artigo

Resumo

Para complementar os métodos habitualmente utilizados para estudar TRPV4 de, dois métodos são descritos: O mecanosensibilidade pode ser estudada por Ca 2 +-aequorina luminometria em leveduras transgénicas após desafio com hipo-osmótico. Ele também pode ser examinada em TRPV4-ARN injectado oócitos de Xenopus a-célula inteira de dois eléctrodos de aperto de voltagem ou remendo grampo em no modo de célula ou excisadas.

Resumo

TRPV4 (Transient Receptor Potenciais, família vanilloid, tipo 4) é amplamente expresso em tecidos de vertebrados e é ativada por vários estímulos, inclusive por forças mecânicas. Certas mutações TRPV4 causar óssea hereditária complexo ou patologias neuronais em humanos. De tipo selvagem ou mutante TRPV4 transgenes são geralmente expressos em células de mamífero de cultura e examinadas por Fura-2 fluorometria e pelos eléctrodos. Em termos de mecanismo de mecanosensibilidade e as bases moleculares das doenças, a literatura atual é confuso e controverso. Para complementar os métodos existentes, descrevemos dois métodos adicionais para examinar as propriedades moleculares de TRPV4. (1) de rato e um transgene TRPV4 aequorina são transformadas em leveduras de brotamento. Um choque hipo-osmtic da população transformante produz um sinal luminométrico devido à combinação de aequorin com Ca 2 +, lançado pelo canal TRPV4. Aqui TRPV4 é isolado a partir dos seus parceiros proteínas de mamíferos normaise revela o seu próprio mecanosensibilidade. (2) ARNc de TRPV4 é injectado em oócitos de Xenopus. Após um período de incubação adequado, a corrente de TRPV4 macroscópica é examinada com uma pinça de voltagem de dois eléctrodos. O aumento de corrente na eventualidade de remoção de osmótico inerte a partir do banho de oócitos é indicativo de mecanosensibilidade. Os microampere (10 -6 a -4 10 A) correntes de ovócitos são muito maiores do que os subnano a nanoampere (10 -10 a 10 -9 A) correntes de células em cultura, produzindo quantificações mais claras e avaliações mais confiantes. Correntes microscópicos que refletem as atividades das proteínas de canais individuais também pode ser registrada diretamente sob um patch clamp, em on-célula modo excisadas ou. O mesmo ovócito fornece várias amostras de patch, permitindo a replicação de melhores dados. Aspiradores aplicados aos patches podem ativar TRPV4 para avaliar diretamente mecanosensibilidade. Esses métodos devem também ser úteis no estudo de outros tipos de canais TRP.

Introdução

TRP (potenciais receptores transientes) composto por sete subfamílias de canais de cátions que servem funções sensoriais 1,2. Nos mamíferos, TRPV, subfamília vanilloid de TRP, tem seis variedades. TRPV4 (tipo 4) 3,4 responde ao calor, determinados produtos químicos, inchaço osmótico, ou tensão de cisalhamento. O gene TRPV4 foi repetidamente isolados por candidato a gene e / ou de clonagem de expressão 5-8. O último método seguido resposta do produto de gene a hipo-osmolaridade. TRPV4 é expresso em quase todos os órgãos e funções do desenvolvimento, fisiologia, patologia ou de muitos tipos de células diferentes de 3,4.

Striking são os> 50 autossômicas humano mutações TRPV4 dominantes, fazendo com que as neuropatias periféricas e / ou displasias esqueléticas (anormalidades no desenvolvimento do esqueleto) 9-11. As displasias esqueléticas variar de leve tipo brachyomia 3 (tipo 3 nanismo), displasia spondylometaphyseal tipo Kozlowski, a severe displasias, alguns causando morte neonatal ou embrionário. Apesar de todas as formas de mecanismos parecem possíveis, nenhum explica a diversidade, complexidade, variabilidade e sobreposições ocasionais dessas doenças 4.

Como outros canais TRP 1, TRPV4 é um tetrâmero. No rato ou TRPV4 humana, cada subunidade é composta de 871 resíduos. O elemento central é o seis transmembranar de hélices (S1-S6), que são susceptíveis arranjados de uma forma semelhante aos canais sensíveis à voltagem de K +. Há, S1 a S4 formar um domínio periférica e a S5 e S6 formar o domínio de permeação de poro. Entre S5 e S6 de TRPV4 é uma hélice de poro curta seguido do LDLFKLTIGMGDL sequência, quatro dos quais presumivelmente convergem para formar o filtro de catião. O 470-resíduo segmento citoplasmático N-terminal contém seis repetições de anquirina, que se sabe ligarem a proteínas ou ligantes. O segmento citoplasmático de 152 resíduos C-terminal inclui uma sequência de ligação à calmodulina, entre outros possíveis locais que se ligam otseus elementos 3.

TRPV4 é um canal de cátions que essencialmente exclui ânions 1. Embora a sua função fisiológica é a transdução de estímulos de influxo de Ca2 +, é também permeável a outros catiões com uma sequência de permeabilidade Eisenman IV, favorecendo bivalente numa Ca P: P Na ~ 7 12. Single-channel condutância retifica em ~ 90 pS para fora e para dentro ~ 40 pS 6,13,14. Heterologamente expressa atual (abaixo) pode ser ativado por hipo-osmótico inchaço, tensão de cisalhamento, ou calor 15. Ele também é ativado por ácidos graxos poliinsaturados 16,17 eo éster phorbal sintético 4αPDD 18. No presente, o agonista mais potente é GSK1016790A 19 e antagonista é GSK2193874, eficaz em 10 -9 a 10 -8 M 20, ambos descobertos pela maior taxa de transferência, a tela de pequeno peso molecular.

Duas áreas-chave da investigação TRPV4 permanecer confuso: (1) Mesmo quando TRPV4 é amplamente estudada por sua mecanosensibilidade, a sua base molecular é controversa. Um modelo de hipo-osmolaridade de alguma forma activa a fosfolipase A2 (PLA2) para produzir o ácido gordo polinsaturado (PUFA) de ácido araquidônico (AA), que é convertido em ácido epoxyeicosatrienoic (IIT) por uma epoxigenase, e a ligação da EET activa TRPV4 16, 17. No entanto, a própria TRPV4 foi mostrado para responder directamente ao estiramento da membrana 14 (abaixo), fornecendo uma explicação mais simples. (2) As patologias são mutantes TRPV4 desconcertante. Na base, é preciso saber se as doenças são devido à perda, a redução ou o aumento das atividades do canal. Mesmo aqui, a literatura está longe de ser clara. Enquanto alelos múltiplos esquelético-displasia foram relatados para ter atividades mais elevadas, (ganho de função, GOF) 4,21, vários foram relatados para ter reduzido actividades (perda de função, LOF) 10,22. Um estudo sistemático de 14 alelos encontrou-os atodas as mutações ser GOF (abaixo) 23. A alegação de que alguns são LOFs parece contradizer o fenótipo de TRPV4-/ - rato knockout, que são viáveis ​​ou férteis, com apenas pequenos defeitos, apesar de uma perda completa da função TRPV4.

Uma parte dessas controvérsias tem origem metodológica. Laboratórios usam diferentes métodos, ou variantes de um método, e empregam diferentes padrões de julgamento. Mais comumente, TRPV4 é transitoriamente expressa em células de mamíferos em cultura (HEK, CHO, HeLa) ea ascensão do interno [Ca 2 +] em cima de agonista ou estimulação hipotônica está registrado com o Ca 2 + corante fluorescente sensível, Fura-2. O excesso de confiança em este ensaio fluorimétrico foi criticado 1. O nível de expressão em diferentes populações, a distribuição no mesmo, bem como a concentração efectiva do corante, necessita de ser controlada e documentada. Mais confiável é os exames eletrofisiológicos diretos. Mesmo isto, como commonly praticado, também não é sem problemas. Porque os níveis de expressão em células de cultura individuais são difíceis de controlar, as correntes de células completas têm grandes variações. Além disso, porque as correntes são pequenos, estatísticas confiáveis ​​terá que contar com grandes tamanhos de amostra, muitas vezes não é prático. Exames de patch-clamp raramente foram executadas. Algumas dessas gravações mostram aglomerados de rajadas de atividade que fazem avaliação estatística desafiador 16,17.

Para entender melhor o mecanosensibilidade molecular, nós desenvolvemos dois sistemas adicionais para examinar TRPV4. (1) Para isolar TRPV4 longe de seus parceiros de mamíferos habituais, temos expressa TRPV4 rato em brotamento levedura 24. Expressão funcional de TRPV4 neste contexto evolutivamente distante mostrou que ele ainda pode responder a força osmótica sem os seus parceiros habituais. Porque o fermento não faz PUFAs como AA ou EET, e seu genoma tem genes PLA2 ou epoxigenase, este expression também mostra que não são necessários para TRPV4 para detectar força. Tendo TRPV4 nos moleculares eucariontes biologicamente mais amenas também permite manipulações eficiente para a frente ou reversa genéticos 25. (2) Para as análises em profundidade biofísicos de TRPV4, expressamos TRPV4 em oócitos de Xenopus. Ao contrário das células cultivadas, que produzem sub-nA a nA (10 -10 a 10 -9 A) correntes, um ovócito expressa correntes em mA de (10 -6 a -4 10 A). Sinal muito maior sobre o ruído permite uma melhor quantificação e comparação mais confiante. TRPV4, de modo expresso, também podem ser examinados como moléculas individuais usando uma braçadeira de patch. Um único oócito permite amostragem remendo repetiu, novamente fazendo a quantificação mais confiável. Tais estudos mostraram que o próprio canal TRPV4 podem ser diretamente ativados por força trecho membrana 14. As análises também mostraram que 14 representantes alelos esquelético-displasia são todas as mutações de ganho de função. Além disso, o degree deste Ca 2 + vazamento constitutiva paralela à gravidade das doenças ósseas 23.

Por causa de sua novidade e utilidade, os procedimentos detalhados desses dois métodos são montados aqui para permitir repetições, em futuras pesquisas sobre TRPV4 ou canais semelhantes.

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Protocolo

1. Métodos Yeast luminometria

Use BYYT cepa de Saccharomyces cerevisiae. É um yvc1-tok1-derivado de BY4741 (MATA, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4). Transformar as células com o plasmídeo que expressa pEVP1/Aeq aequorina Leu-seleccionável e o rato que expressam TRPV4 plasmídeo ura-selecionável p416GPDV4, tal como descrito em 26 Batiza et al. E 24 Loukin et al. Utilizar métodos normalizados de construção dos plasmídeos e transformação 27 . Cepa de levedura e plasmídeos estão disponíveis mediante solicitação.

  1. Cultura 2 ml de células de levedura durante a noite a fase pós-logarítmica em um agitador a 30 ° C em Leu-ura-"DCD" meio abandono 28 (uma variante empobrecido-sulfato do meio CMD-leu-ura 29), suplementado com sorbitol 1M . Inocular 200 mL destas culturas em 1,8 ml de meio fresco suplementado com 2 mM de o Luciferin celenterazina. Crescer no escuro à temperatura ambiente por mais de 24 horas sem agitação.
  2. Medir a osmolaridade da cultura (normalmente a 1.400 mOsM) e outras soluções (a seguir) utilizando um osmómetro de pressão de vapor.
  3. Aliquota de 20 ul de cultura fresco para um tubo de luminómetro de 12 milímetros para um único tubo do luminómetro.
  4. Para o choque hipotónico, adicionar 200 mL de uma solução, contendo NaEGTA 25 mM (pH 7,2) ou nomes (pH 7,2) e NaCl 500-100 mM, (osmolaridade total de 1,200-400 mOsM), dependendo do grau desejado de choque. Monitorar continuamente a luminescência antes e pelo menos 120 segundos após o downshock osmótica, interrompido apenas pelo breve operação de diluição. Registrar saída luminometer em um computador desktop como unidades de luminescência relativa (LSD).

Embora não seja para o estudo de TRPV4 transgénico, temos usado uma variante do protocolo acima num sistema automatizado para analisar as respostas de um grande número de estirpes de levedura. Estudo of as respostas aos hipo-30 ou 31 hiperosmóticas estímulos do deletome levedura (a coleção de 4.906 levedura deletants de um único gene), utilizando uma luminometer microplaca e analisados ​​com o software correspondente foi bem sucedida.

2. e 3. Ovócitos Métodos Eletrofisiologia

Eletrofisiologia usa métodos básicos 32. PCR amplificar a grelha de leitura aberta de tipo selvagem ou mutante utilizando TRPV4 alta-fidelidade PfuUtra polimerase e integrado pGH19 33. Isto implica uma inserção precisa do ORF entre 5 'e 3' UTRs do gene da p-globina de Xenopus β e a jusante de uma polimerase de ARN de T7-promotor. Linearizar o construto a jusante da UTR 3 'e utilizadas como modelos in vitro em T7 ARN polimerase de reacção. Use técnicas de biologia molecular padrão 34.

Use estágio V-VI ovócitos de X. laevis. A criação de animais, ovariecto parcialminha, a remoção envelope defolliculation e vitelino siga os procedimentos padrão 32,33,35. Injetar 2-40 ng de solução cRNA por ovócitos utilizando um microinjetor automático Drummond Nanoinject II. Injetar ~ 30 ovócitos para cada conjunto de experimentos. Após injecção TRPV4-ARNc, incubar os oócitos no meio ND96 com gentamicina (100 ug / ml) e 1 pM de ruténio vermelho 14.

2. Dois eletrodos de tensão da braçadeira

  1. Puxe borosilicato pipetas de gravação de vidro de precisão descartáveis ​​micropipetas 100 ul individualmente com um puxador de pipeta.
  2. Puxe os dois eletrodos de pipeta de corrente injeção de tensão de medição e são puxados para ter uma abertura de ponta de ~ 1 mícron de diâmetro.
  3. Eletrodos de aterramento com 2 M KCl resultando em 0,1-0,2 mohms resistência. Montá-los em headstages HS2A, que em conjunto com um VG-2Ax100 virtual aterrado braçadeira banho, estão ligados a uma interface amplificador GeneClamp 500 através de um digitalizador Digidata 1440. Adquirir dados utilizando software pClamp10.
  4. Coloque o oócito para ser testado em um banho de 1 ml de uma câmara de plástico fabricada montado na plataforma de um microscópio de dissecação com 20X de ampliação. A solução do banho é virtual fundamentada por uma ponte de ágar 3 M KCl e um fio de prata clorada colocado perto do oócito e ligado a uma fase de terra virtual VG-2A.
  5. Construa a câmara para a perfusão contínua com tubos de plástico como entrada e saída de solução. Ligar o tubo de entrada está ligado a um sistema de perfusão fabricada, que é um colector de 50 ml de seis reservatórios de seringas, cada um cheio com uma solução diferente. Taxas de alimentação de gravidade de qualquer solução particular é controlada para ~ 2-3 ml / min usando "Keck" grampos rampa nas tubulações.
  6. Montar os dois eléctrodos com os seus headstages em micromanipuladores. Realize penetrações eléctrodos da ovócito por micromanipulação.

3. Grampo patch Exame de mecanosensibilidade direto

"> Os métodos básicos de patch clamp incluindo a preparação pipeta, formação GÊ-selo, e em formação de células ou modos excisadas são aqueles em Hamill et al. 36 e Conn 32.

  1. Encha pipetas de vidro de silicato de boro, com uma abertura de diâmetro de ~ 1 mM na ponta (número de bolhas 5-6) com KCl 98 mM, MgCl2 1 mM, e 10 mM de K +-HEPES, pH 7,2.
  2. Prenda a pipeta patch clamp através de um tubo de plástico para uma seringa de 5 ml e através de uma T-junção, também a um manômetro. Utilize um computador para lidar com ambos o eletrodo e as saídas manômetro. Aquisição de dados em 10 kHz, e, em seguida, reproduzir através de um filtro de oito pólos Bessel em 1 kHz para análise.
  3. Diferentes remendos podem ser excisadas a partir do mesmo oócito repetidamente. Esta prática faz com que o exame da atividade molecular de TRPV4 mais eficiente e confiável.

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Resultados

Numa experiência típica luminometria, uma gama de 400-1,200 mOsM hipotónicas choques para baixo é conseguida através da adição de 200 ul de soluções de choque de baixa osmolaridade diferente de 20 l de cultura a 1.400 mOsM. A actividade TRPV4 é evidente quando a RLU do experimental é comparada com a de dois controlos negativos: as células de levedura transformadas com o plasmídeo p416GPDV4 vazio ou um que contenha o gene TRPV4 com uma mutação no filtro de iões (Figura 1) 24.

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Discussão

Como foi dito na Introdução, os métodos comumente utilizados para estudar funções TRPV4 por vezes resultou em inconsistências e controvérsias. Os dois conjuntos de métodos aqui descritos oferecem algumas vantagens e pode complementar os métodos existentes. Enquanto que apenas descrevem estudos sobre TRPV4, os métodos podem ser estendidos para estudar outros canais iónicos bem.

1. Métodos Yeast luminometria

Brotando levedura tem uma Ca 2 +-resposta influx...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Andrea Kremsreiter pela excelente assistência técnica. Trabalho em nosso laboratório é apoiado pelo NIH GM096088 eo Vilas Confiança da Universidade de Wisconsin - Madison.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Osmômetro de Pressão de VaporWescorWescor 5500Logan, UT, EUA
Sirius Luminômetro de Tubo Único Titertek-BerholdSiriusHuntsville, LA, USA
Luminômetro de microplacaTitertek-BertholdMithras LB940Huntsville, LA, EUA
Software de luminometriaTitertek-BertholdMikroWin2000Huntsville, LA, USA
Braçadeira de remendo e softwareAxon InstrumentHS2A headstage, braçadeira de banho aterrada virtual VG-2Ax100, amplificador GeneClamp 500, digitalizador digidata 1440, Software pClamp10Union City, CA, EUA
ManômetroBio-TecWinooski, VT, EUA
Extrator de pipetasSutter Instrument CoModelo P-97Novata, CA, EUA
MicroinjetorDrummond ScientificNanoinject IIBroomall, PA, EUA
Luciferina celenterazinaInvitrogenCarlsbad, CA, EUA
T7 RNA polimerase reaçãoAmbionmMessage mMachineAustin, TX, EUA
GentamicinaSigma 
Vermelho de rutênioSigma 
Micropipetas Micropipetas de100 microlitrosDrummond Broomall, PA, EUA
Polimerase PfuUtra de alta fidelidade StratageneLa Jolla, CA, EUA

Referências

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