Método de preparação de slides para preservar arquitetura de cromatina tridimensional de células germinativas testiculares

Resumo

O material aqui descreve um método desenvolvido para preservar a estrutura de cromatina tridimensional das células germinativas testiculares. Este foi chamado de método de slides tridimensional (3D). Este método melhora a sensibilidade para detecção de estruturas subnucleares e é aplicável para imunofluorescência, DNA e fluorescência de RNA na hibridização situ (FISH).

Resumo

Durante a diferenciação das células germinativas testiculares, a estrutura da cromatina nuclear muda dinamicamente. Descreve um método projetado para preservar o arranjo tridimensional de cromatina de células germinativas testiculares encontradas em camundongos; este método foi denominado como o método de slides tridimensional (3D). Neste método, os túbulos testiculares são tratados diretamente com uma etapa de permeabilização que remove o material citoplasmático, seguido por uma etapa de fixação que fixa materiais nucleares. Os túbulos são então dissociados, a suspensão celular é citospun, e as células aderem aos slides. Este método melhora a sensibilidade para a detecção de estruturas subnucleares e é aplicável para imunofluorescência, DNA e fluorescência de RNA na hibridização situ (FISH) e a combinação desses métodos de detecção. Como exemplo de uma possível aplicação do método de slides 3D, um PEIXINHO RNA Cot-1 é mostrado para detectar RNAs nascentes. O método de slides 3D facilitará o exame detalhado das relações espaciais entre estrutura de cromatina, DNA e RNA durante a diferenciação de células germinativas testiculares.

Introdução

Em testículos, as células germinativas se diferenciam da espermatogonia diploide através da meiose em espermatozoides maduros e haploides. Durante esse processo, a estrutura de cromatina nuclear das células germinativas é continuamente e dinamicamente remodelada. As propagações superficiais são comumente usadas para o exame citológico de células espermatogênicas individuais. Um método predominante de propagação superficial emprega tratamento hipotônico pelo qual as células espermatogênicas individuais são espalhadas e achatadas¹. Estas condições são ideais para análise detalhada de cromossomos meioticos. Características cromossômicas como status sináptico e....

Protocolo

Preparação de slides .3D 1

1. Prepare os seguintes reagentes:
   1. Tampão CSK: 100 mM NaCl, 300 mM de sacarose, 10 mM PIPES, 3 mM MgCl₂. Ajuste o pH para 6,8 com 1 M NaOH. Armazene o buffer CSK a 4 °C.
   2. Tampão CSK com 0,5% Triton X-100: Adicione 200 μl de Triton X-100 a 40 ml de tampão CSK. Misture a solução usando agitador magnético até que Triton X-100 esteja completamente dissolvido. Armazene o buffer CSK com 0,5% Triton X-100 a 4 °C.
   3. 4% Paraformaldeído (PFA)-PBS, pH 7.4: Dissolver 4 g de PFA em aproximadamente 70-80 ml de água. Para agilizar o processo de dissolução, adicione aproximadamente 20 μl de 4 N NaOH e mantenha a ....

Resultados

Um resultado representativo de um slide 3D é mostrado na Figura 2. Neste experimento, o Cot-1 RNA FISH foi realizado para detectar transcrição nascente juntamente com a imunostaining usando anticorpos anti CBX1 e γH2AX. Para combinar RNA FISH e imunostaining, a imunostaining foi realizada primeiro, seguida por RNA FISH como descrito em³. CBX1 é uma proteína heterocromatina que localiza a heterocromatina pericentromérica e cromossomos sexuais silenciosos na meiose chamada corpo XY (ou corpo sex.......

Discussão

Na preparação do slide 3D, a etapa de permeabilização precede a etapa de fixação. Essas etapas são realizadas diretamente em túbulos seminiferos, preservando assim a estrutura de cromatina tridimensional. Uma opção alternativa para preservar a estrutura de cromatina para RNA/DNA FISH é realizar a etapa de permeabilização e a etapa de fixação simultaneamente. Esta técnica alternativa tem sido realizada em células germinativas marsupiais e embriões de pré-implantação de camundongos^7,8. No entanto, se a etapa de .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DNA Cot-1	Invitrogen	18440-016
DNA de Esperma de Arenque	Agilent
Etanol. 200 provas (absolutas)	Pharmco-aaper	111000200
Acetato de sódio	Sigma-Aldrich	S2889
	American Bioanalytical	AB00600-00500
Citrato de sódio tribásico di-hidratado	Sigma-Aldrich	C8532
Albumina de soro bovino	Lifeblood Medical	77110-100
Sal de sódio de sulfato de dextrano de Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	D6001
RPMI 1640	Invitrogen	A10491-01
Sacarose	Sigma-Aldrich	S0389
TUBOS	Sigma-Aldrich	P6757
Cloreto de magnésio hexahidratado	Sigma-Aldrich	M0250
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	76240
Hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich	221465
solução salina tamponada com fosfato	Sigma-Aldrich	P4417
VECTASHIELD Meio de montagem com DAPI	Vector Laboratories	H1200
Complexo ribonucleosídeo-vanadil	New England Biolabs	S1402S
Illustra MicroSpin G-50 Colunas	GE Healthcare	27-5330-01
Microcentrífuga	Eppendorf	5424
Fórceps	VWR	300-050
Tubos de microcentrífuga	Bioexpress	C-3262-1
Cytospin 3	Shandon
Coplin Jar	Fisher	08-815
Superfrost /Plus Lâminas de Microscópio	Prato de 4 poços Fisher	12-550-15
Tampa	Fisher	12-566-301
	Fisher	12-544-G
	Ciência revolucionária	RS-IF-203

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