Método de preparação de slides para preservar arquitetura de cromatina tridimensional de células germinativas testiculares

Resumo

O material aqui descreve um método desenvolvido para preservar a estrutura de cromatina tridimensional das células germinativas testiculares. Este foi chamado de método de slides tridimensional (3D). Este método melhora a sensibilidade para detecção de estruturas subnucleares e é aplicável para imunofluorescência, DNA e fluorescência de RNA na hibridização situ (FISH).

Resumo

Durante a diferenciação das células germinativas testiculares, a estrutura da cromatina nuclear muda dinamicamente. Descreve um método projetado para preservar o arranjo tridimensional de cromatina de células germinativas testiculares encontradas em camundongos; este método foi denominado como o método de slides tridimensional (3D). Neste método, os túbulos testiculares são tratados diretamente com uma etapa de permeabilização que remove o material citoplasmático, seguido por uma etapa de fixação que fixa materiais nucleares. Os túbulos são então dissociados, a suspensão celular é citospun, e as células aderem aos slides. Este método melhora a sensibilidade para a detecção de estruturas subnucleares e é aplicável para imunofluorescência, DNA e fluorescência de RNA na hibridização situ (FISH) e a combinação desses métodos de detecção. Como exemplo de uma possível aplicação do método de slides 3D, um PEIXINHO RNA Cot-1 é mostrado para detectar RNAs nascentes. O método de slides 3D facilitará o exame detalhado das relações espaciais entre estrutura de cromatina, DNA e RNA durante a diferenciação de células germinativas testiculares.

Introdução

Em testículos, as células germinativas se diferenciam da espermatogonia diploide através da meiose em espermatozoides maduros e haploides. Durante esse processo, a estrutura de cromatina nuclear das células germinativas é continuamente e dinamicamente remodelada. As propagações superficiais são comumente usadas para o exame citológico de células espermatogênicas individuais. Um método predominante de propagação superficial emprega tratamento hipotônico pelo qual as células espermatogênicas individuais são espalhadas e achatadas¹. Estas condições são ideais para análise detalhada de cromossomos meioticos. Características cromossômicas como status sináptico e focos de recombinação são facilmente observadas usando este método. No entanto, o tratamento hipotônico interrompe a arquitetura de cromatina subnuclear, portanto essa técnica não é adequada para análise estrutural de núcleos. Consequentemente, um método melhorado foi projetado para preservar a estrutura de cromatina tridimensional das células germinativas testiculares. Este método foi denominado como o método de slides tridimensional (3D)(Figura 1). O método de slides 3D permitiu a detecção da localização nascente do RNA em núcleos porque foi inicialmente otimizado para examinar a expressão genética e os estados de cromatina durante a diferenciação de células germinativas testiculares pela fluorescência de RNA na hibridização situ (FISH)^2,3. Este método 3D também é aplicável à combinação de imunofluorescência, DNA e RNA FISH. Além disso, este método tem auxiliado na descoberta da cromatina sexual pós-amioótica (PMSC), um compartimento silencioso dos cromossomos sexuais encontrados nos espermatozoides pós-meioticos².

O método de slides 3D foi originalmente otimizado através da combinação de duas etapas essenciais de preparação de slides comumente utilizadas para coloração nuclear: a etapa de fixação projetada para fixar materiais nucleares e a etapa de permeabilização destinada a remover materiais citoplasmáticos a fim de melhorar a acessibilidade de reagentes de coloração, como anticorpos e sondas FISH. Como descrito anteriormente em outra^{publicação 3,}foi determinado que a etapa de permeabilização deve preceder a etapa de fixação, a fim de obter resultados ideais com baixo fundo citoplasmático. Neste método de slides 3D, a etapa de permeabilização e a etapa de fixação subsequente são realizadas diretamente em túbulos seminiferos e são seguidas pela dissociação mecânica de células germinativas com fórceps antes de citospinning em slides. Um método alternativo para RNA FISH de células espermatogênicas foi desenvolvido em outro laboratório⁴. Neste método, consistente com o método 3D, a etapa de permeabilização deve preceder a etapa de fixação para obter resultados ideais de RNA FISH.

O protocolo a seguir descreve o método de slides 3D e fornece um exemplo de uma possível aplicação, Cot-1 RNA FISH para a detecção de RNAs de nascente nuclear. O DNA do Cot-1 consiste em elementos repetitivos no genoma. Aqui, uma sonda de DNA Cot-1 é hibridizada para um intron e UTR das transcrições nascentes, detectando assim as regiões transcricionáriamente ativas no núcleo^5,6. Slides 3D são versáteis e podem ser aplicados a uma combinação de técnicas de imunofluorescência, DNA e RNA FISH, a fim de obter um exame detalhado das relações espaciais entre a arquitetura da cromatina.

Protocolo

Preparação de slides .3D 1

1. Prepare os seguintes reagentes:
   1. Tampão CSK: 100 mM NaCl, 300 mM de sacarose, 10 mM PIPES, 3 mM MgCl₂. Ajuste o pH para 6,8 com 1 M NaOH. Armazene o buffer CSK a 4 °C.
   2. Tampão CSK com 0,5% Triton X-100: Adicione 200 μl de Triton X-100 a 40 ml de tampão CSK. Misture a solução usando agitador magnético até que Triton X-100 esteja completamente dissolvido. Armazene o buffer CSK com 0,5% Triton X-100 a 4 °C.
   3. 4% Paraformaldeído (PFA)-PBS, pH 7.4: Dissolver 4 g de PFA em aproximadamente 70-80 ml de água. Para agilizar o processo de dissolução, adicione aproximadamente 20 μl de 4 N NaOH e mantenha a solução em um banho de água a 60 °C até que o PFA tenha completamente dissolvido e a solução seja transparente. Esse processo leva aproximadamente 1 hora. Depois que o PFA tiver completamente dissolvido, adicione 10 ml de PBS de 10x. Ajuste o volume final para 100 ml com água e esfrie a solução para temperatura ambiente (25 °C). Use uma solução recém-preparada para cada novo experimento.
      Nota: Obtenha permissão institucional para todo o trabalho animal e adere às diretrizes de cuidado animal relevantes.
2. Eutanize ratos machos. Usando fórceps e tesouras, extirpe o teste do rato. Coloque o teste em PBS (ou RPMI 1640). Após a remoção do testis, realize rapidamente as seguintes etapas 1.3-1.4, a fim de evitar a degradação do RNA.
3. Rompa o testímetro em uma pequena placa de Petri e remova a tunica albuginea. Desvendar os túbulos seminiferos em PBS no gelo usando fórceps.
4. Usando fórceps, transfira vários túbulos (vários pedaços de túbulos aproximadamente 5-10 mm de comprimento) em um poço de um prato de 4 poços contendo 500 ml de tampão CSK + 0,5% Triton X-100 no gelo, e incubar por 6 min. A superexposição ao buffer CSK pode resultar na interrupção das células.
5. Usando fórceps, transfira todos os túbulos para um poço de um prato de 4 poços contendo 4% de solução PFA-PBS. Esta etapa pode ser pré-formada sem um estereótipo, mas opcionalmente pode ser usada. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Ao mesmo tempo, comece a preparar 12 câmaras de citospin durante os períodos de incubação.
6. Usando fórceps, transfira todos os túbulos para um poço de um prato de 4 poços contendo PBS. Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
7. Na parte traseira de um escorregador de vidro, transfira todos os túbulos para 30 μl de PBS (a parte superior do slide deve ser evitada devido à carga cationic). Usando as pontas de dois fórceps, rasgue os túbulos em pedaços. Pique os túbulos em uma direção horizontal, cortando túbulos entre as pontas de dois fórceps e puxando as fórceps horizontalmente. Continue com esta etapa por aproximadamente 10-20 segundos.
8. Misture a suspensão por pipeta usando uma pipeta P20.
9. Transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga, diluída com PBS para aproximadamente 1,3 ml. Aplique 100 μl de suspensão a cada uma das 12 câmaras de citospin (1,2 ml total). Nesta etapa, a concentração das células não precisa ser determinada.
10. Citospin as amostras a 2.000 rpm por 10 minutos em temperatura ambiente. Depois de citospinning, lâminas secas no banco do laboratório por alguns minutos em temperatura ambiente. Depois que slides tiverem sido permitidos secar completamente por alguns minutos, vá para o próximo passo.
11. Usando um frasco coplin contendo PBS, lave os slides por 5 minutos à temperatura ambiente.
12. Transfira slides para um frasco de Coplin contendo 70% de etanol e espere pelo menos 2 minutos antes do início do RNA FISH. Os slides estão estáveis por algumas semanas em 70% de etanol a 4 °C. Para armazenamento a longo prazo, desidratar slides usando tratamento serial com 80% e 100% de etanol em frascos de Coplin por 2 min cada e secar completamente os slides. Armazene a -80 °C em uma caixa de slides.

2. Preparação da sonda de DNA Cot-1 por preparação aleatória

1. Prepare os seguintes reagentes:
   1. Tampão de hibridização: Misture os componentes de processo para preparar 900 ml de estoque tampão de hibridização; esta solução será usada para estocar sondas. Este estoque tampão de hibridização permite a adição de 10% de volume de solução inibidora de RNase (Complexo Vanadyl Ribonucleoside) antes da hibridização.

      componente	Quantidade (μl)	Concentração final
      Formamida	500	50% (v/v)
      50% Dextran	200	10% (w/v)
      20x SSC	100	2x
      1% BSA	100	0.1%

      Antes da hibridização, adicione 1/10 vol de 200 mM Complexo de Vanadyl Ribonucleoside ou água ao estoque de tampão de hibridização para corresponder à concentração final. A -20 °C, esta mistura é estável por mais de um ano.
   2. 20x SSC: Dissolva 88,2 g de citrato de sódio e 175,3 g de NaCl em aproximadamente 800 ml de água. Ajuste o pH para 7.0 usando algumas gotas de 1 M HCl. Adicione água para ajustar o volume final a 1 L. Esterilizar por autoclaving. Após a preparação, 20x SSC pode ser armazenado à temperatura ambiente.
   3. 50% (w/v) Dextran: Mexa água e adicione lentamente 50 g de sulfato de dextran. Continue mexendo durante a noite em temperatura ambiente. Adicione água para ajustar o volume final a 100 ml. Armazene à temperatura ambiente.
2. Adicione os seguintes componentes listados abaixo a um tubo PCR. Usando uma máquina PCR, misture e incuba a solução por 5 min a 95 °C.

   componente	Quantidade por reação (μl)	final
   DNA cot-1: 1 mg/ml	1	1 μg
   Primer aleatório de 9mer (do kit)	10
   Água	27

3. Centrífuga brevemente e coloque no gelo.
4. Adicione os seguintes componentes. Misture e incubar por 30 min a 37 °C usando uma máquina PCR. (Para detalhes do kit utilizado consulte a tabela de reagentes e equipamentos).

   componente	Quantidade por reação (μl)	Concentração final
   Mistura preparada a partir da etapa 2.2	38
   Tampão nucleotídeo 5x (do kit)	9.2
   Cy3-dUTP (1 mM)	0.8	16 μM
   Klenow (do kit)	2

5. Adicione 2 μl de buffer de parada (do kit) para interromper a reação.
6. Purifique a reação parada usando colunas de microspin.
7. Adicione 50 μg (5 μl) de DNA de espermatozoides de arenque (50 vezes o excesso de DNA de modelo Cot-1) à fração purificada.
8. Meça o volume total usando uma pipeta. Adicione 0,7x de volume de 100% etanol e 0,1x de acetato de sódio de 3 M (pH 5.2), misture bem e centrífuga por 15 minutos em velocidade máxima (17.000 x g) usando um microcentrifuge a 4 °C.
9. Retire o líquido e adicione 200 μl de 70% de etanol, misture bem e centrífuga por 5 min em velocidade máxima a 4 °C.
10. Remova o excesso de líquido. Seque o precipitado por 10-30 min à temperatura ambiente.
11. Dissolva a pelota em 20 μl de estoque tampão de hibridização. Porque a pelota é muitas vezes difícil de dissolver, pipeta repetidamente. Como opção alternativa, um misturador de vórtice também pode ser usado para dissolver eficientemente a pelota. As sondas podem ser mantidas a -20 °C até usar.

3. PEIXE DE RNA COT-1

1. Adicione os componentes listados abaixo a um tubo PCR. Usando uma máquina PCR, incubar por 10 min a 80 °C, seguido de uma etapa de pré-estanagem de aproximadamente 10-30 min a 42 °C. Mantenha a 42 °C até a hibridização. O Complexo Vanadyl ribonucleosídeo é opcional; pode ser substituído por água.

   componente	Quantidade por reação (μl)	final
   Sonda de DNA Cot-1 (50 ng/μl)	2	100 ng
   Complexo Vanadyl Ribonucleosídeo (200 mM)	2	20 mM
   Tampão de hibridização	adicionado a 20

2. Desidratar slides em um frasco de Coplin contendo 80% de etanol por 2 min, seguido por um frasco de Coplin contendo 100% de etanol por 2 min. Lâminas secas completamente no banco do laboratório à temperatura ambiente.
3. Pré-aqueça uma câmara de caixa de ponta (cheia com 2-3 cm de água) em uma incubadora de 42 °C com antecedência. Coloque o slide na câmara da caixa de ponta. Centrifufique brevemente as sondas pré-apresentadas e a pipeta diretamente nos slides desidratados. Evite fazer bolhas. Cubra suavemente o slide com um deslizamento de cobertura.
4. Hibridize por 6 horas a noite (14-15 horas) a 42 °C.
5. Prepare soluções de lavagem em frascos Coplin (dois frascos com 2x SSC e 50% de formamide, e dois frascos com 2x SSC). Pré-aqueça a 42 °C por 30 min em banho-maria.
6. Use uma lâmina de barbear para remover o deslizamento da tampa da borda do slide. Evite coçar amostras. Lave lâminas em um frasco de Coplin contendo 2x SSC e 50% de formamida por 5 min a 45 °C. Repita este passo uma vez.
7. Lave lâminas em um frasco de Coplin contendo 2x SSC por 5 min a 45 °C. Repita este passo uma vez.
8. Adicione 20 μl de mídia de montagem de DAPI aos slides e cubra com um deslizamento de tampa. Pressione suavemente o vidro de cobertura para remover a mídia de montagem extra. Borrar mídia extra de montagem com tecido de limpeza. Os slides estão prontos para avaliação de microscopia.

Resultados

Um resultado representativo de um slide 3D é mostrado na Figura 2. Neste experimento, o Cot-1 RNA FISH foi realizado para detectar transcrição nascente juntamente com a imunostaining usando anticorpos anti CBX1 e γH2AX. Para combinar RNA FISH e imunostaining, a imunostaining foi realizada primeiro, seguida por RNA FISH como descrito em³. CBX1 é uma proteína heterocromatina que localiza a heterocromatina pericentromérica e cromossomos sexuais silenciosos na meiose chamada corpo XY (ou corpo sex...

Discussão

Na preparação do slide 3D, a etapa de permeabilização precede a etapa de fixação. Essas etapas são realizadas diretamente em túbulos seminiferos, preservando assim a estrutura de cromatina tridimensional. Uma opção alternativa para preservar a estrutura de cromatina para RNA/DNA FISH é realizar a etapa de permeabilização e a etapa de fixação simultaneamente. Esta técnica alternativa tem sido realizada em células germinativas marsupiais e embriões de pré-implantação de camundongos^7,8. No entanto, se a etapa de ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DNA Cot-1	Invitrogen	18440-016
DNA de Esperma de Arenque	Agilent
Etanol. 200 provas (absolutas)	Pharmco-aaper	111000200
Acetato de sódio	Sigma-Aldrich	S2889
	American Bioanalytical	AB00600-00500
Citrato de sódio tribásico di-hidratado	Sigma-Aldrich	C8532
Albumina de soro bovino	Lifeblood Medical	77110-100
Sal de sódio de sulfato de dextrano de Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	D6001
RPMI 1640	Invitrogen	A10491-01
Sacarose	Sigma-Aldrich	S0389
TUBOS	Sigma-Aldrich	P6757
Cloreto de magnésio hexahidratado	Sigma-Aldrich	M0250
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	76240
Hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich	221465
solução salina tamponada com fosfato	Sigma-Aldrich	P4417
VECTASHIELD Meio de montagem com DAPI	Vector Laboratories	H1200
Complexo ribonucleosídeo-vanadil	New England Biolabs	S1402S
Illustra MicroSpin G-50 Colunas	GE Healthcare	27-5330-01
Microcentrífuga	Eppendorf	5424
Fórceps	VWR	300-050
Tubos de microcentrífuga	Bioexpress	C-3262-1
Cytospin 3	Shandon
Coplin Jar	Fisher	08-815
Superfrost /Plus Lâminas de Microscópio	Prato de 4 poços Fisher	12-550-15
Tampa	Fisher	12-566-301
	Fisher	12-544-G
	Ciência revolucionária	RS-IF-203