In vitro Ensaio de cocultura para avaliar migração trans epitelial de neutrófilo induzida por patógenos

Resumo

A migração trans-epitelial de neutrófilos em resposta à infecção bacteriana mucosa contribui para lesão epitelial e doença clínica. Foi desenvolvido um modelo in vitro que combina patógenos, neutrófilos humanos e camadas de células epiteliais humanas polarizadas cultivadas em filtros transwell para facilitar investigações para desvendar os mecanismos moleculares que orquestram esse fenômeno.

Resumo

As superfícies mucosas servem como barreiras protetoras contra organismos patogênicos. As respostas imunes inatas são ativadas ao detectar patógenos que levam à infiltração de tecidos com células inflamatórias migratórias, principalmente neutrófilos. Esse processo tem o potencial de ser destrutivo para os tecidos se excessivo ou mantido em um estado não resolvido.  Modelos in vitro coculturizados podem ser utilizados para estudar os mecanismos moleculares únicos envolvidos na migração trans-epitelial induzida pelo patógeno. Este tipo de modelo fornece versatilidade no design experimental com oportunidade de manipulação controlada do patógeno, barreira epitelial ou neutrófilo. A infecção patogênica da superfície apical de monocamadas epiteliais polarizadas cultivadas em filtros transwell permeáveis instiga a migração basolateral fisiologicamente relevante para a migração trans-epitelial apical de neutrófilos aplicados à superfície basolateral. O modelo in vitro descrito aqui demonstra os múltiplos passos necessários para demonstrar a migração de neutrófilos através de uma monocamada epitelial pulmonar polarizada que foi infectada com P. aeruginosa patogênica (PAO1). A semeadura e a colheita de transwells permeáveis com células epiteliais pulmonares derivadas humanas é descrita, juntamente com o isolamento de neutrófilos de sangue humano inteiro e cultivo de PAO1 e não-patogênico K12 E. coli (MC1000).  O processo de emigração e a análise quantitativa de neutrófilos migrados com sucesso que foram mobilizados em resposta à infecção patogênica são mostrados com dados representativos, incluindo controles positivos e negativos. Este sistema de modelo in vitro pode ser manipulado e aplicado a outras superfícies mucosas. Respostas inflamatórias que envolvem infiltração excessiva de neutrófilos podem ser destrutivas para os tecidos hospedeiros e podem ocorrer na ausência de infecções patogênicas. Uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares que promovem a migração trans-epitelial de neutrófilos através da manipulação experimental do sistema de ensaio de cocultura in vitro descrito aqui tem um potencial significativo para identificar novos alvos terapêuticos para uma gama de doenças infecciosas mucosas, bem como inflamatórias.

Introdução

As superfícies mucosas servem como barreiras físicas e imunológicas que proporcionam proteção contra ameaças externas generalizadas no meio ambiente^1,2. Esta barreira epitelial protetora pode ser comprometida quando organismos patogênicos invadem². No caso de um patógeno bacteriano, esse encontro muitas vezes instiga um processo inflamatório ativando o sistema imunológico inato e desencadeando uma rápida mobilização de granulócitos de primeiros socorros conhecidos como neutrófilos^2-4. Agentes chemotactic facilitando o recrutamento de neutrófilos são produzidos em parte pelas células epiteliais mucosas que buscam livrar o hospedeiro do ....

Protocolo

As etapas (1-3) devem ser realizadas em um ambiente estéril sob um capô de fluxo laminar.

1. Transwells de revestimento de colágeno

1. Faça uma solução de colágeno de 30 μg/ml. Diluir 3 mg/ml de colágeno 1:100 em 60% de etanol que foi passado por uma unidade de filtro de 0,2 μm.
2. Vortex diluído solução de 30 μg/ml. Nota: Não é necessário vórtice a solução de estoque de colágeno de 3 mg/ml, pois esta solução é bastante viscosa e bolhas de ar podem ser introduzidas, potencialmente diminuindo a precisão ao pipetar.
3. Remova transwells de área de crescimento de^0,33 cm 2 com um tamanho de poros de 3 μ....

Resultados

Vários estudos demonstraram que as camadas epiteliais infectadas por patógenos facilitam a migração trans-epitelial de neutrófilos^{3,8,19,24-28,31,32}. Isso ocorre por meio de uma indução específica de patógeno de um gradiente químico quimiofilo quimiofilo derivado de células epiteliais^3,23. Por exemplo, p. aeruginosa patogênica interagindo com a superfície apical das células epiteliais pulmonares faz com que um número substancial de neutrófilos migrem através da camada epitelial^{18,22,25.......}

Discussão

A migração de neutrófilos através das superfícies epiteliais mucosas é uma característica comum na patologia da doença após a infecção com patógenos bacterianos³. A metodologia descrita aqui oferece uma abordagem rápida e direta para isolar experimentalmente este evento discreto usando um sistema de ensaio de cocultura in vitro derivado de células humanas que modela uma característica do processo inflamatório desencadeado por infecções bacterianas. Este sistema foi originalmente desenvolvido usando cé.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células NCl-H292	ATCC	CRL-1848
RPMI-1640 meio	ATCC	30-2001
Pseudomonas aeruginosa PAO1	ATCC#	47085
Escherichia coli MC1000	ATCC	#39531
D-PBS (1x) líquido	Invitrogen	14190-144	sem cálcio e magnésio
Soro bovino fetal inativado por calor	Invitrogen	10082-147	10% adicionado ao meio de cultura
Penicilina-estreptomicina	Invitrogen	15140-122	100x: 10.000 unidades de penicilina e 10.000 µ g de estreptomicina por ml.
Tripsina-EDTA (0,05%)	Invitrogen	25300-062	alíquotas de 50 ml são armazenadas congeladas a -20 °C. A alíquota em uso pode ser armazenada em 4 º C curto prazo.
Solução salina balanceada de Hank - HBSS(-)	Invitrogen	14175-079	Estéril, sem cálcio e magnésio
Solução de azul de tripano	Invitrogen	15250-061.	Estoque = 0.4%
Colágeno, Cauda de Rato	Invitrogen	A10483-01	Também pode ser isolado em laboratório diretamente das caudas de ratos usando protocolos padrão
Ácido cítrico	Sigma-Aldrich	C1909-500G	Componente de tampão citrato 1 M e solução de citrato ácido dextrose (ACD)
Citrato de sódio	Sigma-Aldrich	S4641-500G	Componente de tampão citrato
M Dextrose anidra	Sigma-Aldrich	D8066-250G	Componente da solução de citrato ácido dextrose (ACD) Cloreto de
amônio	Sigma-Aldrich	213330-500G	Componente do tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC)
Bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich	S6014-500G	Componente do tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC)
EDTA	Sigma-Aldrich	ED-100G	Componente do tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC)
HBSS(+) pó	Sigma-Aldrich	H1387-10L	Componente chave de HBSS+
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-500G	Componente de HBSS+
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-25ML	Siga as instruções do fornecedor para revestir ponteiras de pipeta de vidro
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-9284
2,2'-Azino-bis(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) sal de diamônio (ABTS)	Sigma-Aldrich	A9941-50TAB	Componente-chave da solução de substrato ABTS
Solução de peróxido de hidrogênio a 30%	Sigma-Aldrich	H1009-100ML	Componente da solução de substrato ABTS
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP ou fMLF)	Sigma-Aldrich	F-3506	Uma solução estoque de 10 mM em DMSO deve ser preparada e alíquotas armazenadas a -20 ºC.
Gelatina Tipo B	Fisher Scientific	M-12026
Pseudomonas isolação agar	Fisher Scientific	DF0927-17-1	Siga o fabricante' s instruções para fazer placas PIA
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-749	Opcional, pode melhorar a pureza dos neutrófilos
Placa de migração de 24 poços	Corning Incorporated	#3524
Placa de lavagem de 24 poços	Falcon	35-1147	Pode ser reutilizada se embebida em etanol a 70% e lavada completamente antes de reutilizar
Placa de 96 poços	Fisher Scientific	#12565501
Transwell Permeável Suportes	Corning Incorporated	#3415	Policarbonato; Diâmetro: 6,5 mm; Área de crescimento: 0,33 cm2; Estilo do prato: placa de 24 poços; Tamanho do poro: 3.0 µ m
Placa de Petri	Falcon	35-1013	Cada placa de Petri comporta 24 Transwells invertidos de 0,33 cm2.
500 ml 0,2 μ m filtro / frasco	Fisher Scientific	09-740-25A	Para esterilizar a solução de citrato ácido dextrose (ACD)
5-3/4 em vidro Pipeta Pasteur	Fisher Scientific	13-678-20A	Cubra as pontas com Sigmacote antes de usar
Hemostat	Fisher Scientific	13-812-14	Microscópio Invertoskop Invertido Curvo, Serrilhado
	Zeiss	#342222
Versa-Max Dispositivos moleculares de leitor de microplacas		#432789

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