Implantação de vidro Medular do Windows em camundongos adultos com Experimental Auto-imune Encephalomyelitis

Resumo

Descrevemos um método para implantar e manter janelas de vidro sobre a medula espinhal exposta de camundongos adultos para estudar a encefalomielite autoimune experimental. Essas janelas fornecem acesso óptico crônico à medula espinhal para monitorar a dinâmica celular no nível subcelular em animais vivos usando microscopia de dois fótons.

Resumo

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) em roedores adultos é o modelo experimental padrão para estudar doenças desmielinizantes autonômicas, como a esclerose múltipla. Aqui apresentamos um protocolo de implantação de janela de vidro reprodutível e de baixo custo que é adequado para microscopia intravital e estudando a dinâmica da citoarquitetura da medula espinhal com resolução subcelular em camundongos adultos vivos com EAE. Resumidamente, expomos cirurgicamente as vértebras T12-L2 e construímos uma câmara ao redor das vértebras expostas usando uma combinação de cianoacrilato e cimento dentário. Uma laminectomia é realizada de T13 a L1, e uma fina camada de elastômero de silicone transparente é aplicada na superfície dorsal da medula espinhal exposta. Uma lamínula de vidro modificada é implantada sobre a medula espinhal exposta, tomando cuidado para que o vidro não entre em contato direto com a medula espinhal. Para reduzir a infiltração de células inflamatórias entre a janela e a medula espinhal, o tratamento anti-inflamatório é administrado a cada 2 dias (conforme recomendado pelo comitê de ética) nos primeiros 10 dias após o implante. A EAE é induzida apenas 2-3 semanas após a interrupção do tratamento anti-inflamatório.

Usando essa abordagem, induzimos com sucesso EAE em 87% dos animais com janelas implantadas e, usando camundongos Thy1-CFP-23 (axônios azuis na medula espinhal dorsal), quantificamos a perda axonal ao longo da progressão do EAE. Em conjunto, este protocolo pode ser útil para estudar o recrutamento de várias populações de células, bem como sua dinâmica de interação, com resolução subcelular e por longos períodos de tempo. Essa modalidade de imagem intravital representa uma ferramenta valiosa para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para o tratamento de doenças desmielinizantes autoimunes, como a EAE.

Introdução

A esclerose múltipla é uma doença autoimune do SNC que causa danos progressivos à mielina e ao axônio. O modelo de pesquisa padrão para doenças desmielinizantes autoimunes do SNC é EAE em roedores adultos. No entanto, os eventos celulares dinâmicos subjacentes à progressão da EAE permanecem amplamente inexplorados. Uma abordagem é usar microscopia intravital de dois fótons para visualizar populações celulares com marcadores fluorescentes por longos períodos de tempo na medula espinhal de camundongos adultos com EAE.

A microscopia intravital de dois fótons é uma maneira poderosa de estudar a fisiologia celular, as interações celulares e a pr....

Protocolo

1. Preparação da Janela e da Estrutura de Suporte

1. Preparação da janela - prepare várias janelas de vários tamanhos (largura = 1,8-2,2 mm; comprimento = 4,5-5,2 mm) para implantação.
   1. Fazendo a broca modificada para cortar a lamínula - usando uma quantidade generosa de cimento dental, prenda uma broca a um eixo (no nosso caso, grampos Bulldog antigos). Certifique-se de que a rebarba esteja ~45° em relação ao eixo para facilitar o manuseio.
      Nota: os escribas de diamante também funcionam bem para cortar vidro de cobertura.
   2. Fazendo slide-A - usando uma lâmina de microscópio padrão, cole um pequeno pedaço de papel de régua (~ 2 cm)....

Resultados

O uso de janelas de vidro implantadas cronicamente em combinação com microscopia intravital de dois fótons e modelos de EAE pode ser uma ferramenta útil para compreender os mecanismos celulares subjacentes à patologia das doenças autoimunes desmielinizantes. Utilizando nosso método de implantação, observamos que a maioria das janelas estava transparente no momento da indução da EAE e permaneceu clara durante toda a progressão da doença (Figura 1c). Com esta abordagem, verificamos que as janelas permanece.......

Discussão

Descrevemos um método para implantar e manter janelas de vidro sobre a medula espinhal exposta de camundongos adultos para estudar a progressão dinâmica da EAE ao longo do tempo. Uma abordagem semelhante de implantação de janela de vidro tem sido usada para estudar modelos de lesão medular¹³ e também pode ser útil para estudar outras patologias da medula espinhal, como glioblastomas, meningite ou a fisiologia celular da medula espinhal normal. Para o nosso método, a estabilização vertebral foi alcançada constr.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Broca de remoção	World Precision Instruments	IDEAL MICRO-DRILL	Também vendida pela Harvard Apparatus. Qualquer broca cirúrgica de alta qualidade será suficiente.
Broca (#1/4 ou 1/2 Fresa Redonda de Carboneto)	World Precision Instruments	501860 (#1/4) 501860 (#1/2)	Também vendido pela Harvard Apparatus
Staples	Lyreco	5.002.567	Coroa = 8 mm Perna = 4 mm
Clipe			de papel Qualquer clipe de papel padrão de 25 mm
Chaves de agulha
	Ferramentas de Belas Ciências	14028-10
Pinça Adson	Ferramentas de Belas Ciências	11027-12	1 x 2 dentes
Pinças sem corte	Ferramentas de Belas Ciências	11293-00
Garfos espinhais	Aparelho de Harvard	724813
Cimento dental	GACD	12-565 e 12-568
Elastômero de silicone	Instrumentos	de precisão mundialKWIK-SIL	Também disponível através do microscópio Coherent Scientific e Fisher Scientific
Cyanoacrylate	Eleco-EFD	Cyanolit 201
	Zeiss	7MP	Nosso microscópio está em uma configuração vertical e está equipado com 5 detectores NDD.
Lente objetiva	Zeiss	W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC M27 75mm	Distância de trabalho = 1.8 mm

óssea Tesoura de tecido Fine Science Tools 12003-15