Teste de suscetibilidade de antibiótico induzido por estresse em um chip

Resumo

Desenvolvemos uma plataforma microfluidica para testes rápidos de suscetibilidade a antibióticos. O fluido é passado em altas velocidades sobre bactérias imobilizadas na parte inferior de um canal microfluido. Na presença de estresse e antibiótico, cepas suscetíveis de bactérias morrem rapidamente. No entanto, bactérias resistentes podem sobreviver a essas condições estressantes.

Resumo

Desenvolvemos um método microfluido rápido para testes de suscetibilidade a antibióticos em um ambiente baseado em estresse. O fluido é passado em altas velocidades sobre bactérias imobilizadas na parte inferior de um canal microfluido. Na presença de estresse e antibiótico, cepas suscetíveis de bactérias morrem rapidamente. No entanto, bactérias resistentes sobrevivem a essas condições estressantes. A hipótese por trás desse método é nova: a ativação do estresse das vias bioquímicas, que são alvos de antibióticos, pode acelerar os testes de suscetibilidade a antibióticos. Em comparação com os métodos padrão de teste de suscetibilidade a antibióticos, a etapa limitante da taxa - crescimento bacteriano - é omitida durante a aplicação de antibióticos. A implementação técnica do método está em uma combinação de técnicas padrão e abordagens inovadoras. As partes padrão do método incluem protocolos de cultura bacteriana, definição de canais microfluidos em polidimtilsiloxano (PDMS), monitoramento de viabilidade celular com fluorescência e processamento de imagens em lote para contagem de bactérias. Partes inovadoras do método estão no uso do fluxo de mídia cultural para aplicação de estresse mecânico, uso de enzimas para danificar, mas não matar as bactérias, e uso de substratos de microarray para apego bacteriano. A plataforma desenvolvida pode ser usada no desenvolvimento e teste de medicamentos não anticóticos e antibióticos. Em comparação com os experimentos padrão de suspensão bacteriana, o efeito da droga pode ser ligado e desligado repetidamente durante períodos de tempo controlados. A observação repetitiva da mesma população bacteriana é possível ao longo do mesmo experimento.

Introdução

O aumento da resistência bacteriana intensifica a necessidade de testes rápidos de suscetibilidade a antibióticos à base de fenótipo, a fim de proteger nossos medicamentos de último recurso. Os testes de suscetibilidade padrão são baseados na inibição do crescimento bacteriano na presença de antibióticos que levam várias (8-24) horas para serem concluídos. Desenvolvemos um novo teste de suscetibilidade a antibióticos em uma plataforma microfluidica que conta com a ativação do estresse de vias biossintéticas para acelerar a ação de antibióticos.

Os testes de suscetibilidade a antibióticos na escala microfluidic carregam a vantagem do uso efe....

Protocolo

1. Faça a camada PDMS (Figura 1)

1. Misture vigorosamente PDMS e agente de cura em uma proporção de 10:1. Para remover bolhas, desgas a mistura viscosa em uma câmara de vácuo por 1 hora à temperatura ambiente.
2. Em uma escala, despeje o PDMS lentamente sobre o molde de alumínio. Despeje do centro e mantenha o molde nivelado. Certifique-se de deixar os pinos descobertos. Pare de derramar quando o peso-alvo for alcançado.
   Nosso molde requer 4 g de PDMS e 0,4 g de reagente de cura.
3. Nivele o molde dentro de um forno e cure a 37 °C durante a noite.
   Os tempos alternativos de cura são de 2 horas a 60 °C ou 1 hora a 90 °C.

Resultados

Os dados apresentados na Figura 4 mostram a resposta de uma tensão staphylococcus aureus suscetível ao longo do tempo em um canal microfluido contendo antibióticos. As imagens de contraste de fase adquiridas em 1 min e no final do experimento de 1 hora são mostradas nas Figuras 4A e B. Os dados analisados de 1 hora são mostrados na Figura 4C com as bactérias destacadas em vermelho (5.828 no total). As imagens correspondentes de fluores.......

Discussão

O protocolo apresentado foi validado e otimizado em um conjunto de experimentos com cepas Staphylococcus aureus sensíveis à meticilina e resistente à meticilina¹⁰. Portanto, este protocolo sem modificação deve ser diretamente aplicável a outras cepas de S. aureus e outros antibióticos com mecanismos de ação que afetam a biossíntese da parede celular bacteriana. Tipos de bactérias que não o S. aureus podem exigir variação nos parâmetros de estresse: solúvel (enzimática) e tensões mecâ.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
SYTOX Green	Invitrogen Corporation	S7020	Mancha de fluorescência de células mortas
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma Aldrich, Inc	A9418-5G	Usado para armazenamento de lisosafina
Acetato de sódio	Sigma Aldrich, Inc	S8750-500G	Usado para armazenamento de lisostafina
Lisostafina	Ciências Celulares	CRL309A	Chega como 1 mg sólido. Para armazenamento: Dissolver em acetato de sódio 20 mM. Misture com a solução de BSA até a concentração final de 1% de BSA e 100 µ g/ml   lisostafina para armazenamento
Sal de oxacilina	Sigma Aldrich, Inc	28221-1G	Antibiótico
Mueller Hinton Caldo	Fisher Scientific	DF0757-17-6
Cloreto de sódio	Sigma Aldrixh	S3014-500G	2% adicionado ao caldo Mueller-Hilton antes de autoclavar
1 ml, seringa Luer-lock	BD (Beckton, Dickinson e Comp.)	14-823-2F
2 onças, seringa Luer-lock	BD (Beckton, Dickinson e Comp.)	309653 - 60 mL	Overfill para ~65 ml
Microscópio
de Fluorescência Invertida Microscópio Olympus IX-70	Cambridge Scientific	9349
60X, Objetiva de contraste de fluorescência/fase	Olympus Corp.	LCPlan F1 60x/0.70 Ph2
Retiga câmera CCD monocromática de 12 bits	QImaging	RET-4000R-F-M-12-C
Automação
Persianas contraste de fase/fluorescência	PRIOR Scientific	H204/H202
X/Y Stage	H107AENN		da PRIOR Scientific
	H122		PRIOR Scientific
para controle XYZ	CS152EF
Proscan	da PRIOR Scientific Software	de aquisição de imagem H3-XY2
células de fluxo CMI
Célula de Fluxo	BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI	3333-1044	Os desenhos de engenharia foram produzidos pela Fraunhofer CMI
Janela de vidro	Fraunhofer CMI	3333-1054	A janela de vidro foi cortada no tamanho adequado na Fraunhofer CMI
Janela BOROFLOAT 50 mm x 50 mm	Edmund Optics Inc.	NT48-543
Placa de vedação	BU Scientific Instruments Facility	3333-1045
Lâmina de vidro epóxi	Arrayit Corporation	SuperEpoxy 2
PDMS mestre	Fraunhofer CMI	3333-1053	Mestre usinado em alumínio ou latão com UPM-0005 (máquina de corte por mosca
PDMS design de corrediça	Fraunhofer CMI	3333-1053
Porca de
Tubo, Super sem flange Tinytight, sem cabeça, 1/16 pol, PEEK, verde	IDEX Health Science	M-644-03	As entradas/saídas de células de fluxo são aproveitadas para esta ferrule
Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK com anel de bloqueio SS, preto	Porca IDEX Health Science	M-657
, Super sem flange Tinytight, sem cabeça, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural	IDEX Health Science	P-255
Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), amarelo	IDEX Health Science	P-259	Serve para adaptador Luer-lock
Tubulação, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, verde	Adaptador IDEX Health Science	1520G
, conexão rápida fêmea Luer para fêmea 1/4-28, PEEK, vermelho	IDEX Ciências da Saúde	P-658

de microscópioMotor de foco Joystick da Controlador da PRIOR Scientific Conjunto de e PDMS )