Produção e Purificação de Adenovírus não replicativa Canino Tipo 2 vectores derivados

Resumo

Nos últimos 15 anos, os vetores derivados do adenovírus canino tipo 2 (CAV2) provaram sua eficiência na transdução de células in vitro e in vivo e são amplamente utilizados para vacinação e terapia gênica. Aqui, descrevemos um procedimento para construir, produzir e purificar vetores CAV2, dando origem a suspensões virais de alto título.

Resumo

Os vetores derivados de adenovírus (Ad) têm sido amplamente utilizados para transferência de genes de curto ou longo prazo, tanto para terapia gênica quanto para aplicações de vacinas. Devido à frequente imunidade pré-existente contra o adenovírus humano tipo 5 classicamente usado, o adenovírus canino tipo 2 (CAV2) foi proposto como um vetor alternativo para a transferência de genes humanos. A biologia bem caracterizada do CAV2, juntamente com sua facilidade de manipulação genética, oferece grandes vantagens, notadamente para a transferência de genes para o sistema nervoso central, ou para induzir uma ampla gama de respostas imunes protetoras, desde a imunidade humoral até a celular. Atualmente, o CAV2 representa um dos adenovírus não humanos mais atraentes para uso como vetor vacinal. Este protocolo descreve um método simples para construir, produzir e titular vetores CAV2 recombinantes. Após a clonagem do de expressão do gene de interesse em um plasmídeo de transporte, o plasmídeo genômico recombinante é obtido por recombinação homóloga na cepa bacteriana E. coli BJ5183. O plasmídeo genômico resultante é então transfectado em células renais caninas que expressam os genes CAV2-E1 complementares (DK-E1). Uma amplificação viral permite a produção de um grande estoque viral, que é purificado por ultracentrifugação através de gradientes de cloreto de césio e dessalinizado por diálise. A suspensão viral resultante rotineiramente tem um título de mais de 10^{a 10} partículas infecciosas por ml e pode ser administrada diretamente in vivo.

Introdução

Nas últimas décadas, os vetores derivados de adenovírus (Ads) provaram sua eficácia para terapia gênica e vacinação, bem como na viroterapia oncolítica ¹. Os anúncios são vírus icosaédricos não envelopados da família Adenoviridae, que foram isolados de mamíferos, aves, répteis, anfíbios e peixes. Desde sua descoberta em 1953, os ADs têm sido intensamente estudados como modelos para estudar as interações vírus/célula e, mais recentemente, como sistemas de entrega de genes baseados em vetores ². De fato, os vetores baseados em anúncios oferecem muitas vantagens, como sua ampla gama de hospedeiros e biologia bem caracterizada, juntamente com a facilidade com que podem ser geneticamente manipulados e amplificados para produção em larga escala.

Para superar as dificuldades clínicas relacionadas à imunidade pré-existente em populações humanas em relação a vetores derivados de anúncios humanos ³, nós e outros começamos a derivar vetores de anúncios não humanos ⁴. Além disso, os vetores adenovirais não humanos parecem estar mais adaptados para vacinação em massa em medicina veterinária do que o adenovírus tipo 5 (Ad5) classicamente utilizado, uma vez que devem estar mais em conformidade com os requisitos de segurança e proteção durante a avaliação dos riscos pelas autoridades reguladoras nacionais. No final da década de 1990, descrevemos o primeiro CAV2 recombinante como uma alternativa não humana aos vetores derivados de Ad5 ⁵. Desde então, vários estudos confirmaram o potencial dos vetores CAV2 para transferência de genes terapêuticos ou antigênicos (para revisões ^6,7). Como outros Ads, os vetores derivados de CAV2 são estáveis e podem ser produzidos com altos títulos, o que facilita seu uso in vivo. Também são seguros, pois não são integrativos, embora permitam a expressão transgênica de longa duração in vivo (>1 ano) ⁸. Notavelmente, e melhor do que os sorotipos humanos de Ads, os vetores CAV2 têm se mostrado altamente neurotrópicos, com um transporte retrógrado muito eficiente nos axônios ^9,10. Essa propriedade intrínseca trouxe a ideia de usar vetores CAV2 recombinantes para transduzir neurônios de áreas cerebrais específicas que são dificilmente acessíveis aos vetores lentivirais, até então comumente usados para transferência de genes para o sistema nervoso central ¹¹.

Aqui, descrevemos um protocolo simples e clássico para construir, produzir e purificar vetores CAV2 não replicativos derivados da cepa Manhattan. Os genomas CAV2 recombinantes são construídos clonando o gene de interesse desejado (GOI) em um a jusante do promotor inicial do citomegalovírus (CMV), que fornece uma expressão onipresente. Os vetores CAV2 têm uma capacidade de clonagem de ~4,2 kbp, o que permite expressar cDNA grande. Em uma segunda etapa, esse de expressão é inserido por recombinação homóloga no lugar da região E1 do genoma do CAV2, levando a um vírus não replicativo (dlE1), conforme descrito inicialmente por Chartier et al. ¹² Finalmente, as partículas virais são produzidas após a transfecção do plasmídeo genômico em uma linha de células renais caninas que expressam CAV2-E1 (DK-E1) e são amplificadas em série antes da concentração e purificação dos estoques virais. O método aqui descrito utiliza uma ultracentrifugação em duas etapas em gradientes de cloreto de césio (CsCl), que permite o enriquecimento de partículas infecciosas com um título final elevado (geralmente superior a^{10 10} partículas infecciosas por ml). A suspensão viral é então dessalinizada por cromatografia através de colunas descartáveis de Sephadex G-25 para que seja pura o suficiente para ser usada diretamente in vivo.

Protocolo

1. Construção de um plasmídeo do genoma CAV2 não replicativo

Nota: todos os plasmídeos descritos neste protocolo foram descritos anteriormente⁷ e estão disponíveis mediante solicitação.

1. Clonar o GOI no plasmídeo pShuttle, utilizando enzimas de restrição adequadas, para gerar o pShuttle-GOI (figura 1A).
2. Digerir 2 μg de pShuttle-GOI por AscI/PacI. A digestão libera o fragmento Shuttle-GOI (~ 2,9 kbp + sequência GOI ORF) da estrutura do plasmídeo (2,8 kbp).
3. Purifique o fragmento Shuttle-GOI após eletroforese em gel de agarose, usando o NucleoSpin Gel e o kit PCR Clean-up.
4. Paralelamente, digerir 1 μg de plasmídeo genômico pCAV2 por SwaI. O plasmídeo pCAV2 contém um sítio SwaI único localizado na região E1 ( Figura 1B ). Inativar esta enzima de restrição a 65 °C durante 20 min.
5. Transformar bactérias competentes de E. coli BJ5183 com 500 ng de fragmento Shuttle-GOI purificado e 100 ng de plasmídeo pCAV2 linearizado para recombinação homóloga (Figure 1B). Espalhe em placas LB-Amp. Incubar as placas a 37 °C durante pelo menos 20 horas.
6. Realize a análise de PCR diretamente em colônias bacterianas usando a mistura principal EmeraldAmp com primers direto (5'-CACGAGGCCCTTTCGTCTTCAA-3') e reverso (5'-GCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGC-3'), sob as seguintes condições de ciclagem: 10 min a 95 °C (para um ciclo), 95 °C por 1 min; 58 °C por 1 min; 72 °C por 1 min/kbp (por 39 ciclos), e finalmente 5 min a 72 °C. Um produto de 1 kbp + GOI ORF sequence é amplificado a partir de clones positivos para pCAV-GOI, enquanto nenhum produto de PCR pode ser detectado com clones negativos.
7. Inocular pelo menos duas colónias positivas durante a noite, cada uma em 5 ml de meio LB-amp a 37 °C num agitador (220 rpm).
8. Extraia DNAs de plasmídeo usando o kit de plasmídeo Nucleospin. Transforme bactérias E. coli DH5α competentes com uma alíquota de cada preparação de DNA. Espalhe a suspensão bacteriana em placas LB-Amp e incube durante a noite a 37 °C.
9. Inocular duas colónias de cada clone positivo durante a noite num agitador (220 rpm) de 3 ml de LB-amp a 37 °C. Extraia o DNA do plasmídeo usando o kit de plasmídeo Nucleospin.
10. Digerir o ADN resultante e o plasmídeo parental pCAV2 (como controlo) com NdeI. O padrão de restrição do pCAV2 parental é de 14,8 kbp, 9 kbp, 7,9 kbp e 1,6 kbp. A de expressão GOI é inserida no fragmento de 7,9 kbp e contém pelo menos um sítio NdeI, ou seja, um sítio na e os sítios potenciais presentes no GOI.
11. Selecione construções positivas e prossiga para a etapa 2 com pelo menos 2 clones independentes.

2. Transfecção de plasmídeo do genoma CAV2 recombinante em células DK-E1

Nota: Os vetores não replicativos derivados de CAV2 são organismos geneticamente modificados classificados como Nível de Biossegurança 2 (BSL-2), enquanto seu uso em modelos animais é classificado como BSL-1. Use medidas adequadas de contenção e manuseio de resíduos, incluindo equipamentos de proteção individual, e trabalhe sob as coifas de fluxo laminar BSL-2.

1. Um dia antes da transfecção, semeie as células DK-E1 em uma placa de 6 poços. Cultive células a 37 ° C e 5% de CO₂, em meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com alta glicose, contendo 7% de soro fetal de bezerro inativado por calor (FCS), 1 mM de piruvato de sódio e 100 U / ml de penicilina / 100 μg / ml de estreptomicina. As células devem ser 70-80% confluentes para transfecção.
2. Digerir 2 μg de plasmídeo pCAV-GOI com AscI, para libertar a sequência não viral do plasmídeo. Verifique o padrão de restrição resultante por eletroforese em gel de agarose a 0,8%. A digestão deve produzir um fragmento de ~ 31 kbp contendo o genoma recombinante e um fragmento de 2 kbp correspondente à estrutura do plasmídeo.
3. Misture o DNA digerido com 200 μl de Jet Prime Buffer por vórtice por 10 segundos. Adicione 4 μl de Jet Prime e misture por vórtice por 10 segundos. Gire brevemente para remover as gotículas e incube por 10 min em temperatura ambiente.
4. Adicione a mistura de transfecção gota a gota nas células. Agite suavemente as placas para distribuir uniformemente a mistura e incube a 37 °C.

3. Propagação de CAV2 Recombinante

1. Uma semana após a transfecção, coletar células e meio de cultura em um tubo de polipropileno de 15 ml. Romper as células por três ciclos de congelamento e descongelamento (-80 °C/37 °C) e limpar o lisado por centrifugação por 10 min a 1.800 x g.
2. Colete o sobrenadante e armazene a -20 °C para posterior propagação do vírus.
3. Infecte uma monocamada confluente de 80-90% de células DK-E1 cultivadas em um poço de placa de 6 poços com 0,5 ml do sobrenadante contendo vírus. Incubar a 37 °C durante 1 hora, sob agitação ligeira. Remover o inóculo e substituí-lo por 1,5 ml de DMEM completo contendo 5% de FCS inativado pelo calor.
4. Incubar as células a 37 °C durante 3-4 dias. As células devem ser monitoradas diariamente quanto ao aparecimento de um efeito citopático (CPE, Figuras 2A-B). Se nenhum CPE claro for visível, colha as células após 4 dias de cultura e repita as etapas 3.1-3.4.
5. Quando um CPE claro afeta a maioria das células, geralmente após 2-4 rodadas de amplificação viral, colete células com meio de cultura e congele e descongele 3x conforme descrito acima. Infectar 80-90% de células DK-E1 confluentes cultivadas em três placas de cultura de tecidos de 10 cm de diâmetro, usando cada vez 0,5 ml de sobrenadante contendo vírus.
6. Após 3-4 dias (quando o CPE estiver completo), colha as células desses pratos de 10 cm, interrompa-os novamente por três ciclos de congelamento e descongelamento, limpe o lisado por centrifugação por 10 min a 1.800 x g, colete o sobrenadante e armazene a -20 ° C para amplificação de CAV2 em larga escala.

4. Purificação CAV2 em larga escala

1. Infectar 80-90% de monocamadas confluentes de células DK-E1 cultivadas em quarenta placas de cultura de tecidos de 10 cm de diâmetro. Para cada placa, use 0,1 ml de sobrenadante contendo vírus diluído em 1 ml de DMEM completo sem FCS. Incubar as células a 37 °C durante 3 a 4 horas sob leve agitação. Adicione 5 ml de DMEM completo suplementado com 5% de FCS.
2. Incubar por 3 dias. Colha as células infectadas das quarenta placas de 10 cm em tubos de polipropileno de 50 ml. Células de pellets a 1.200 x g por 10 min a 4 ° C e ressuspendê-las em 15 ml de meio DMEM.
3. Romper as células através de três ciclos de congelamento e descongelamento (-80 °C/37 °C). Remova os detritos celulares centrifugando a 1.800 x g por 10 min e armazene o sobrenadante a -20 ° C antes da purificação das partículas virais.
4. Preparar um gradiente descontínuo de CsCl num tubo Ultra-Clear de 14 ml. Primeiro, despeje 2 ml de solução de CsCl (1,40 g/ml em solução salina tamponada com fosfato) no fundo do tubo. Em seguida, adicione lentamente 2 ml de solução de CsCl (1,25 g/ml em solução salina tamponada com fosfato) por cima da primeira solução.
5. Carregue cuidadosamente o sobrenadante viral no topo do gradiente de CsCl. Encha o tubo com óleo mineral até 2-3 mm do topo. Centrifugue por 1,5 horas a 130.000 x g e 18 °C em um rotor SW40 oscilante.
6. Após a centrifugação, duas faixas brancas são claramente visíveis na interface entre as 2 camadas de solução de CsCl ( Figura 2C ). Usando uma agulha de 21 G e uma seringa, colete por punção lateral a banda inferior contendo partículas CAV2 maduras. Tente ao máximo evitar coletar a banda superior, que corresponde a partículas virais vazias.
7. Preparar um gradiente contínuo de CsCl num tubo transparente de 14 ml, misturando as partículas virais recolhidas com uma solução de CsCl (1,34 g/ml em solução salina tamponada com fosfato). Encha o tubo com óleo mineral até 2-3 mm do topo. Centrifugue por 18 horas a 130.000 x g e 18 °C em um rotor SW40 oscilante.
8. Após centrifugação, colete a banda branca contendo CAV2 por punção lateral com uma seringa, conforme descrito acima. Novamente, tente evitar coletar a banda superior restante. Isso deve ser mais fácil neste gradiente contínuo, que separa melhor as duas bandas. O volume total da suspensão recolhida não deve exceder 2 ml.
9. Equilibre uma coluna Sephadex G-25 PD-10 com 30 ml de PBS.
10. Carregue a suspensão viral e descarte o fluxo.
11. Eluir com fracções de 500 μl de PBS. Colete as frações 5-7, que geralmente contêm as partículas CAV2 dessalinizadas. As frações contendo vírus podem ser facilmente identificadas porque são opalescentes. Adicionar 150 μl de glicerol a 1,5 ml de suspensão de CAV2 e conservar em alíquotas a -80 °C.

5. Titulação de CAV2 por diluição do ponto final

1. Descongele uma alíquota do vírus purificado no gelo e realize diluições seriadas de 10 vezes (variando de 10-2-10-12) em DMEM sem soro.
2. Adicionar 50 μl de cada diluição viral em 5 alvéolos de uma placa de 96 poços. Adicione 1,5 x 10⁴ células DK-E1 em cada poço. Incubar a placa a 37 °C e 5% de CO₂ durante 5 dias.
3. No dia 5 pós-infecção, monitore a aparência do CPE por observação microscópica (Figuras 2A-B). Os títulos infecciosos são determinados como doses infecciosas medianas de cultura de tecidos (TCID₅₀), usando o método estatístico de Reed e Muench¹³.

Resultados

A produção de vetores recombinantes de CAV2 depende de técnicas básicas, mas importantes, de biologia molecular. Antes da produção dos vetores virais, é de fato necessário construir um genoma recombinante de CAV2 contendo um cassete de expressão para o transgene. Essa construção envolve duas etapas: primeiro, o gene de interesse (GOI) é clonado em um plasmídeo intermediário como um cassete de expressão (ou seja, com promotor e sinal de poliadenilação). Esse elemento funcional é flanqueado por duas sequências gen...

Discussão

O método simples aqui descrito, adaptado da bem documentada tecnologia Ad5, permite a produção eficiente de vetores CAV2 não replicativos com uma capacidade de clonagem típica de ~ 4,2 kbp. Em relação às considerações de tempo, um genoma CAV2 recombinante geralmente é gerado em duas semanas, enquanto levará mais 5 semanas para amplificar, purificar e titular suspensões virais.

Embora a produção do primeiro lote de vetores derivados de CAV2 possa parecer demorada, deve-se lembrar que a produção...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Enzimas de restrição	New England Biolabs	Vários
Jet Prime kit de transfecção	Polyplus	114-01
DMEM	Gibco (Life Technologies)	10567014
E. coli BJ5183 bactérias	Agilent	200154
PD-10 coluna de dessalinização	GE Healthcare	17-0851-01
Nucleospin EmeraldAmp polimerase	Takara	RR320A
	Macherey-Nagel	740558.250
NucleoSpin Gel e PCR Clean-up	Macherey-Nagel	740609.50
Tubos de 14 ml, Ultra Clear	Beckman	344060