Microinjeção de uma única célula para análise da comunicação celular

Summary

Descrevemos aqui como executar uma microinjeção de uma única célula de Lucifer Yellow visualizar comunicação celular via gap-junções em células vivas, e fornecer algumas dicas úteis. Esperamos que este trabalho irá ajudar a todos para avaliar o grau de acoplamento celular devido à junções comunicantes funcionais. Tudo o descrito aqui pode ser, em princípio, adaptado para outros corantes fluorescentes com peso molecular inferior a 1.000 Daltons.

Abstract

As junções comunicantes são canais intercelulares que permitem a comunicação de células vizinhas. Essa comunicação depende da contribuição de um hemicanal por cada célula vizinha para formar a junção comunicante. Em células de mamíferos, o hemicanal é formado por seis conexinas, monômeros com quatro domínios transmembranares e um terminal C e N dentro do citoplasma. As junções comunicantes permitem a troca de íons, segundos mensageiros e pequenos metabólitos. Além disso, eles têm papéis importantes em muitas formas de comunicação celular dentro de processos fisiológicos, como transmissão sináptica, contração cardíaca, crescimento e diferenciação celular. Detalhamos como realizar uma microinjeção de célula única de Amarelo de Lúcifer para visualizar a comunicação celular por meio de junções comunicantes em células vivas. Espera-se que, em junções comunicantes funcionais, o corante se difunda da célula carregada para as células conectadas. É uma técnica muito útil para estudar junções comunicantes, pois você pode avaliar a difusão da fluorescência em tempo real. Discutimos como preparar as células e a micropipeta, como usar um micromanipulador e injetar um corante fluorescente de baixo peso molecular em uma linhagem de células epiteliais.

Introduction

As junções de hiato são canais intercelulares que permitem a intercomunicação entre células vizinhas ^1. Esta comunicação conecta duas ou mais células vizinhas, onde cada um contribui com um connexon ou hemichannel para formar o canal intercelular. Em células de mamíferos, o connexon é formado por seis conexinas, monómeros com quatro domínios transmembranares e um terminal de C e N dentro do citoplasma ^2. As junções de hiato não só permitir o fluxo de iões, segundos mensageiros e pequenos metabolitos, mas também contribuir para muitas formas de comunicação celular em muitos processos fisiológicos, tais como a transmissão sináptica, a contracção cardíaca, crescimento e diferenciação celular ^{3, 4, 5, 6, 7, 8.} Além disso as junções de hiato foram associados commuitas doenças incluindo cancro ^{9, 10, 11,} atrofia muscular, algumas doenças genéticas e doenças desmielinizantes ^12.

Este tipo de interferência intercelular pode ser avaliada através de vários métodos ^{13, 14, 15, 16.} Neste artigo, vamos mostrar como realizar uma microinjeção de uma única célula de Lucifer Yellow visualizar comunicação celular via gap-junções em células vivas. Discute-se como preparar as células e a micropipeta, a utilização do micromanipulador e a injecção do corante Amarelo Lúcifer em uma linha de células epiteliais do timo. Normalmente, este procedimento experimental poderia ser analisados ​​pela média de células ligadas à célula carregado com corante. Além disso, este método pode ser usado com outros corantes fluorescentes com peso molecular inferior a lacunajunções de corte, que é cerca de 1.000 daltons.

Protocol

1. Preparação de células

1. Manter uma cultura de uma linha celular epitelial tímica (IT76M1) ou célula a ser testada numa incubadora (37 ° C / 5% de CO _2).
2. Lave as células com PBS 1x (repetir este item 3x).
3. Adicionar tripsina às células durante 5 min.
4. Adicionar meio (o dobro do volume de tripsina adicionada no ponto 1.3) com 10% de FBS (soro fetal bovino) para as células com tripsina e centrifugação (800 xg durante 5 min).
5. Contar as células num hemocitómetro.
6. Ajustar a densidade de células de acordo com o tipo de células como as células têm que estar em estreito contacto umas com as outras para permitir o acoplamento. Nota: No nosso caso, usamos 3 x 10 ⁵ células por 35 milímetros placa de Petri.

2. Preparação Micropipeta

1. Puxar a micropipeta, conforme especificado a partir de uma micropipeta capilar de vidro (1,5 mm de diâmetro) para uma final de 0,2 um de diâmetro de modo a atingir uma resistência final de aproximadamente 30 mohmsf "> ^{17, 18.}
   NOTA: Alternativamente, as pipetas de injecção pode ser comprado. A resistência depende do tamanho da célula, por exemplo, seria necessário para células acinares pancreáticas um microeléctrodo resistência mais elevada, por exemplo (100-150 mohms) ^19. Um problema comum é que pode ocorrer a precipitação da solução amarelo Lucifer, que pode, em seguida, obstruir a micropipeta e pode necessitar de filtração ou centrifugação antes. Antes da injecção, a micropipeta devem ser analisadas sob o microscópio para detectar se existe uma obstrução ou qualquer tipo de interrupção ^13. A micropipeta pode ser testada através da injecção de LY com a ponta da micropipeta dentro de uma solução salina.

3. Teste a micropipeta

1. Preparar a solução de Amarelo Lúcifer (5%) em 150 mmol / L de LiCl e carregar a micropipeta com uma seringa ou por enchimento (colocar nele LY solução).
2. Coloque a micropipette ao longo de 35 mm placa de Petri com as células IT76M1 na estação de trabalho microinjecção e submergir a ponta da micropipeta de vidro para o meio celular. Concentre-se na micropipeta e executar um teste de corante fluindo através da aplicação de um pulso.

4. uma única célula Lucifer Yellow Microinjeção

1. Concentre-se o microscópio logo acima da camada de células usando um grande aumento fi cação (40X) e desça lentamente a pipeta para as células usando o micromanipulador.
2. Perfurar a célula alvo quando a ponta está perto o suficiente para tocar a membrana celular, e aplique uma pequena pulsação de hiperpolarização para introduzir o LY na célula. A tensão aplicada dependerá da carga líquida do corante a ser injectada. Alternativamente, alguns outros corantes podem ser usados ​​com esta técnica, como mostrado na Tabela 1.
   Nota: Em princípio, qualquer corante hidrofílico com um PM inferior a 1 kDa poderia ser usada. No entanto, a taxa de transferência pode variar de acordo com o peso e hidrofilicidade. Além disso, utransferência nspecific do corante utilizado deve ser avaliada.
3. Capturar imagens de células 3 min após a injeção de corante ou fazer um pequeno filme com microscopia de lapso de tempo (30 fps).
   NOTA: Uma abordagem semelhante pode ser visto na Hitomi et al (2015) ^20. Para evitar a comunicação por pontes intercelulares (mitose incompleto), um co-injecção de dextrano rodamina (de 2 a 10 kDa), que não passa através de junções de hiato, mas passa através de pontes intercelulares e certos tipos de nanotubules é recomendada como mostrado na Figura 2 .

Results

Tímico linha celular epitelial de TI-76MI foram usadas para avaliar corante de acoplamento por junções de hiato como estas células foram descritos para expressar junções de hiato funcionais formados por conexina 43 ^21. A Figura 1 mostra a injecção de Amarelo Lúcifer quando aplicado na uma célula abaixo da ponta da pipeta. Após alguns minutos, as células tornam-se ligados fluorescente (asteriscos), indicando a difusão do corante fluorescente através das junções de ...

Discussion

A fim de verificar a presença de junções de hiato funcionais intercelular, a utilização de marcadores, que são membrana impermeável, embora permeável por meio de canais intercelulares são necessários ^16. Fluoresceína, o primeiro corante fluorescente para observar célula-a-célula de acoplamento ^22, é permeável entre membranas não juncionais ³ e, por conseguinte, tem sido substituído por Lúcifer corante Amarelo ^15. Atualmente, ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
amarelo Lúcifer	Sigma	L0259
Sigma		L4408
PBS comprimidos	Sigma	P4417
RPMI	Sigma	R4130
Soro fetal bovino	Cultilab
Tripsina	Sigma	T4799
mesa isolada por vibração	Newport	VH3036W-OPT	É necessária uma mesa isolada por vibrações para proteger os experimentos da vibração e evitar danos às células
Micromanipulador	Narishige	MMO-203	Este equipamento permite ajustes precisos da micropipeta, que é necessária para a microinjeção celular.
Gerador de Corrente	Digitimer	DS2	Para produzir o fluxo de corante através da micropipeta, uma corrente abaixo de um nano ampere foi dada usando um gerador de corrente com um eletrodo dentro da micropipeta ou um amplificador que possui um circuito de compensação de capacitância (eletrômetro antigo) ou funções de injeção de corrente de novos amplificadores patch clamp, e o fio terra submerso no prato da placa. Alternativamente, o corante pode ser injetado por um microinjetor pneumático, seguindo as recomendações da fábrica.