Artigo de método

In vivo Reprogramação de células adultas somáticas a pluripotência por superexpressão de Fatores de Yamanaka

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DOI:

10.3791/50837

⸱

17 de dezembro de 2013

 ,  ,  , 
1Nanomedicine Lab, UCL School of Pharmacy, University College London, 2Nanomedicine Lab, Faculty of Medical & Human Sciences, University of Manchester

Neste artigo

Resumo

Este estudo demonstra a reprogramação de células somáticas para pluripotência in vivo sem a geração de teratomas. Usamos injeção hidrodinâmica de DNA plasmidial na veia da cauda que codifica os fatores de Yamanka para induzir a reprogramação in vivo de hepatócitos adultos em células de pluripotência aumentada.

Resumo

As células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) que resultam da reprogramação de células somáticas para um estado pluripotente por expressão forçada de fatores definidos estão oferecendo novas oportunidades para a medicina regenerativa. Tais aplicações clínicas de células iPS têm sido limitadas até o momento, principalmente devido à baixa eficiência das metodologias de reprogramação existentes e ao risco das células iPS geradas formarem tumores após a implantação.

Nossa hipótese é que a reprogramação de células somáticas em direção à pluripotência poderia ser alcançada in vivo pela transferência de genes de fatores de reprogramação. Para reprogramar eficientemente as células in vivo, altos níveis dos fatores de transcrição Yamanaka (OKSM) precisam ser expressos no tecido-alvo. Isso pode ser alcançado usando diferentes vetores genéticos virais ou não virais, dependendo do tecido-alvo. Neste estudo em particular, a injeção hidrodinâmica de DNA plasmidial na veia da cauda (HTV) foi usada para entregar os fatores OKSM aos hepatócitos de camundongos. Isso forneceu prova de evidência de reprogramação in vivo de células somáticas adultas em direção a um estado pluripotente com alta eficiência e cinética rápida. Além disso, não foi observada formação de tumor ou teratoma in situ.

Pode-se concluir que a reprogramação de células somáticas in vivo pode oferecer uma abordagem potencial para induzir pluripotência aprimorada de forma rápida, eficiente e segura em comparação com protocolos realizados in vitro e pode ser aplicada a diferentes tipos de tecidos no futuro.

Introdução

As preocupações éticas sobre o uso de células-tronco embrionárias têm sido uma das limitações no desenvolvimento da pesquisa com células-tronco. No entanto, a descoberta de Yamanaka e colegas de que a expressão forçada de quatro fatores de transcrição (a saber: Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc (OKSM)) poderia levar à reprogramação in vitro de células somáticas em células pluripotentes, denominadas células-tronco pluripotentes induzidas (iPS), abriu novas oportunidades. A transferência de genes virais1-5 e não virais6-10, a translocação citoplasmática de proteínas11,12 e a transfecção de miRNA13-16 estão entre os vários métodos usados hoje para gerar células iPS. No entanto, tais metodologias de reprogramação sofrem de vários problemas que estão restringindo sua tradução para a clínica, tais como: a) severas limitações na eficiência da reprogramação celular; b) o uso predominante de vetores virais; c) protocolos de condições de cultivo de longa duração e várias etapas; e d) o risco de tumorigenicidade pela implantação das células iPS geradas in vitro 17-20.

A transferência de genes de fatores de transcrição definidos3-5 por retrovírus é o método mais comumente usado para reprogramar células somáticas. No entanto, contém os riscos da possibilidade de mutagênese insercional, transdução estável e expressão proto-oncogênica de longo prazo21,22. Vetores de transferência de genes não virais, como DNA de plasmídeo6,7,23 ou entrega de RNA10 usando lipossomas ou eletroporação, também foram explorados. Embora mais seguros em comparação com os vírus, esses vetores oferecem eficiência de transdução e reprogramação significativamente limitada24,25.

Um dos dogmas centrais desse campo emergente é que a implantação in vivo de células iPS levará à sua diferenciação descontrolada e à formação de uma massa tumoral (teratoma), composta por vários tecidos das três diferentes camadas germinativas. Portanto, o conceito de reprogramação para pluripotência tem se concentrado principalmente em manipulações in vitro de células somáticas extraídas primárias (mais comumente fibroblastos). No entanto, como descrito acima, esse princípio sofre de protocolos de cultura celular longos e complexos, incluindo várias rodadas de tratamento (transferência de genes, fatores de crescimento, antibióticos, antioxidantes) que podem aumentar os riscos de formação de teratoma ou outras formas de tumorigênese após a implantação das células24-28.

Propomos que a reprogramação de células somáticas adultas in vivo pela superexpressão transitória dos fatores de transcrição OKSM não leva à formação subsequente de teratomas29. O método para conseguir isso dependerá da obtenção de altos níveis de expressão do fator de transcrição dentro do tecido-alvo da maneira mais segura possível. Neste estudo, selecionamos uma tecnologia estabelecida de transferência de genes livres de vírus que demonstrou atingir eficientemente o fígado, a fim de reprogramar as células para a pluripotência in vivo. Essa tecnologia envolve injeção rápida e hidrodinâmica de DNA de plasmídeo DNA 30,31 em grande volume e hidrodinâmica da veia da cauda30,31. Altos níveis de expressão de genes transfectados podem ser alcançados em hepatócitos adultos seguindo este método de transferência de genes não virais. Além disso, essa tecnologia minimiza os riscos potenciais do uso de vetores virais (por exemplo, inserção genômica permanente, mutagênese insercional).

Protocolo

1. Reprogramação in vivo do tecido hepático pela administração de pDNA pelo HTV

  1. Permita que camundongos Balb/C fêmeas, com 6 semanas de idade, se aclimatem ao biotério por uma semana antes de qualquer procedimento ser realizado.
  2. Prepare solução salina a 0,9% em água destilada e filtre através de microfiltro de 0,22 μm.
  3. Preparar uma solução com 75 μg de pCX-OKS-2A e 75 μg de ADN plasmidial pCX-cMyc em 1,5 ml de solução salina a 0,9% por ratinho. nota: O volume total da injeção deve estar entre 8-10% do peso corporal total.
    Nota: antes da injeção, mantenha os ratinhos numa câmara de aquecimento a 37 °C até que as veias da cauda possam ser facilmente visualizadas e apareçam dilatadas.
  4. Induza a anestesia com isoflurano antes (na câmara de aquecimento) e durante a injeção (com máscara anestésica).
  5. Administre a solução de pDNA ou controle salino com uma seringa de 27 G por injeção de HTV. Nota: para que a transfecção seja bem-sucedida, o volume total deve ser injetado em não mais do que 5-7 segundos.
  6. Monitore se os animais se recuperam adequadamente da injeção.

2. Perfusão hepática e isolamento de hepactócitos primários para estudos de qRT-PCR

  1. Em diferentes momentos, incluindo 2, 4, 8, 12 e 24 dias após a injeção de HTV, induza anestesia profunda com isoflurano.
  2. Pulverize etanol 70% no abdômen do animal, faça uma incisão através da pele na linha média ventral com tesoura cirúrgica e disseque a camada muscular abdominal para expor as vísceras.
  3. Corte o diafragma para expor a cavidade torácica com uma tesoura e prenda a veia cava com uma pinça de travamento.
  4. Desloque as vísceras para a direita e os lobos do fígado para que tanto a cava inferior quanto a veia porta sejam facilmente acessíveis.
  5. Canule a veia cava inferior com um cateter 22 G e corte a veia porta para evitar excesso de pressão.
  6. Iniciar a perfusão com 10 ml de tampão HBSS (livre de Ca2+ e Mg2+, com bicarbonato), pré-aquecido a 37 °C. Perfundir o tampão lentamente com uma seringa de 10 ml, até o fígado embranquecer (3 min).
  7. Continue a perfusão com Liver Digest Medium, pré-aquecido a 37 ° C, a uma taxa de fluxo de 0,6 ml / min (por 15 min) até que o fígado fique inchado e solto. nota: A digestão e a perfusão excessivas podem danificar os hepatócitos ou células reprogramadas.
  8. Continuar a experiência a 4 °C.
  9. Remova o fígado com uma pinça após cortar os ligamentos falciforme e coronário e lave-o com Hepatocyte Wash Medium, enquanto o passa por um filtro de células de 100 μm para obter uma suspensão celular.
  10. Recolha a suspensão celular em tubos de 50 ml e ajuste o volume para 15 ml com Hepatocyte Wash Medium.
  11. Centrifugue a suspensão celular a 50 g durante 4 min. Mantenha a temperatura a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante (que contém células de Kupffer e epiteliais) e ressuspender o sedimento celular (contendo os hepatócitos) em 10 ml de Hepatoil Wash. nota: O pellet celular deve ser ressuspenso com muito cuidado, os hepatócitos são células muito frágeis.
  12. Repita o procedimento de centrifugação por um total de três vezes e ressuspenda o pellet final em 10 ml de Hepatocyte Wash Medium.
  13. Estime o número de células usando um microscópio óptico e um hemocitômetro.
  14. Preparar alíquotas de 2 x 106 células, centrifugar a 300 x g para recuperar todas as células e rejeitar o sobrenadante.
  15. Neste ponto, o pellet celular pode ser congelado e mantido a -20 °C até processamento adicional ou usado imediatamente para a extração de RNA.

3. Estudo da Expressão Gênica de Hepatócitos Isolados para Regulação Positiva de Genes Pluripotentes

  1. Extraia RNA de 2 x 106 células com um kit de coluna giratória seguindo as instruções do fornecedor.
  2. Use 1 μg do RNA extraído para realizar qRT-PCR em duas etapas seguindo as instruções do fornecedor.
  3. Use os hepatócitos dos animais injetados com solução salina como controle para corrigir a expressão gênica relativa de reprogramação, pluripotência e marcadores de hepatócitos.

4. Análise de citometria de fluxo de pluripotência aprimorada no nível da proteína

  1. Nos dias 1 e 4 após a injeção, realize a perfusão hepática e isole os hepatócitos primários conforme indicado acima.
  2. Ajustar a densidade celular para 1 x 107 células/ml e preparar alíquotas de 100 μl.
  3. Fixe as células com tampão de fixação BD Cytofix e permeabilize com 1x tampão BD Perm/Wash.
  4. Incube as células com anti-mouse OCT4-PerCP-Cy5.5 ou anti-mouse Nanog-PE por 30 min.
  5. Inclua controles negativos e isotipos.
  6. Analise as células coradas pelo citômetro de fluxo de pesquisa de alto desempenho CyAn ADP.

5. Imunocoloração de Cortes Hepáticos para Marcadores de Pluripotência

  1. Quatro dias após a injeção, perfundir o fígado conforme indicado acima, mas apenas com tampão HBSS para remover o sangue do tecido hepático.
  2. Corte um pedaço de tecido hepático e mergulhe-o em 2-metilbutano (pré-resfriado em nitrogênio líquido) para continuar com a criossecção.
  3. Os tecidos congelados podem ser mantidos a -80 °C ou cortados diretamente em seções de 14 μm de espessura usando um criostato.
  4. Seque ao ar as seções de tecido por 1 hora em temperatura ambiente e pós-correção com metanol, pré-resfriado a -20 ° C por 10 min. Seque ao ar por 15 min e depois lave as seções duas vezes com PBS (5 min cada).
  5. Incube as seções em tampão de bloqueio (5% de soro de cabra-0,1% Triton em PBS pH 7,3) em temperatura ambiente por 1 hora, seguido de duas etapas de lavagem com tampão de lavagem (1% BSA-0,1% Triton em PBS, pH 7,3).
  6. Incube as seções de tecido durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários anti-OCT4, anti-SOX2 e anti-Nanog.
  7. No dia seguinte, lave as seções 3x (5 min cada) com tampão de lavagem e incube-as por 1,5 hora em temperatura ambiente com o anticorpo secundário.
  8. Lave as seções de fígado com PBS (3x, 5 min cada) e monte-as em meio contendo DAPI e antifade.
  9. Visualize as lâminas sob um microscópio de epifluorescência.

6. Coloração de fosfatase alcalina (ALP) de seções de tecido hepático

  1. Obtenha seções de tecido hepático conforme descrito anteriormente.
  2. Aqueça as seções de tecido em temperatura ambiente por 15 min antes de realizar a coloração.
  3. Fixe com paraformaldeído a 4% por 2 min. Nota: o tempo de fixação excessivo pode diminuir a atividade da ALP.
  4. Seque as seções ao ar por 30 min e, em seguida, incube com substrato líquido BCIP/NBT a 37 °C por 30 min.
  5. Lave as lâminas com água destilada e monte com meios de montagem aquosos.
  6. Capture imagens aleatórias por microscopia de luz.

7. Quantificação dos níveis de albumina e enzimas hepáticas no soro para avaliar a toxicidade hepática

  1. Nos dias 4, 8, 12 e 120 após a transfecção, colete 300 μl de sangue diretamente do ventrículo cardíaco.
  2. Mantenha o sangue no gelo enquanto as diferentes amostras são coletadas para evitar a coagulação.
  3. Quando todas as amostras estiverem prontas, incubar durante 30 min a 37 °C até coagular o sangue.
  4. Centrifugue as amostras a 2.000 x g por 5 min.
  5. Pipetar cuidadosamente o soro (no sobrenadante) para um novo tubo Eppendorf e congelar a -80 °C até ao processamento das amostras.
  6. Analise os níveis séricos de albumina, ALT, AST, ALP e GLDH.

8. Coloração com hematoxilina e eosina (H&E) e ácido periódico-Schiff (PAS) de seções hepáticas para avaliar a toxicidade hepática

  1. Em diferentes momentos, incluindo 2, 4, 8, 12, 24, 50 e 120 dias após a injeção de HTV; realize a perfusão hepática com tampão HBSS apenas conforme descrito anteriormente.
  2. Corte um pedaço de tecido hepático e fixe em paraformaldeído a 4%.
  3. Incorpore o tecido hepático em blocos de parafina, corte e core com coloração H & E ou PAS.
  4. Capture imagens aleatórias por microscopia de luz.

Resultados

Figura 1 mostra a visão geral do procedimento que envolve a transferência gênica de plasmídeos que codificam OKSM para o fígado de camundongos e as diferentes técnicas realizadas para observar a reprogramação celular in vivo. Após a injeção por HTV dos plasmídeos, observou-se um aumento significativo na expressão gênica dos fatores de reprogramação transfectados (Oct3/4, Sox2, Klf4 e cMyc) ao nível de mRNA no dia 2 após a injeção. A expressão desses fatores diminui ao longo do tempo após a injeção, conforme mostrado na Figura 2a. Em relação à expressão de marcadores endógenos de pluripotência (Nanog, Ecat1 e Rex1), seus níveis foram significativamente aumentados em comparação com os de hepatócitos de animais injetados com solução salina nos dias 2 e 4 após a injeção, e retornaram aos níveis basais a partir do dia 8 (Figura 2b). Ao mesmo tempo, a desdiferenciação da população de hepatócitos foi confirmada pela redução na expressão de genes específicos de hepatócitos (Alb, Aat e Trf), que foi estatisticamente significativa no dia 4 e atingiu os níveis basais a partir do dia 8 (Figura 2d).

A expressão de Oct3/4 e Nanog ao nível proteico foi investigada por citometria de fluxo. Conforme mostrado na Figura 2c, apenas Oct3/4 é expresso no dia 1 após a injeção de HTV, enquanto para a expressão do marcador endógeno de pluripotência Nanog foi necessário aguardar até o dia 4.

A ocorrência de reprogramação celular in vivo foi ainda confirmada por meio de análise imunohistoquímica de tecidos hepáticos com anticorpos anti-OCT4, anti-SOX2 e anti-Nanog e por coloração específica para atividade de FAL. Células positivas para todos os marcadores e para atividade enzimática são encontradas de forma reprodutível nos tecidos hepáticos de animais injetados com OKSM, mas não nos controles injetados com solução salina (Figura 3).

Os possíveis efeitos colaterais tóxicos e a formação de teratomas decorrentes da reprogramação celular in vivo por injeção de pDNA via HTV foram investigados mediante quantificação dos níveis de enzimas hepáticas no soro, bem como coloração com H&E e PAS de cortes de tecido hepático ao longo de um período de 120 dias. Foram observados sinais transitórios e não graves de dano tecidual até o dia 2, mas não além disso. Nenhuma formação de teratomas ou qualquer sinal de displasia ou alterações morfológicas foi observado durante o período do estudo (Figura 4). Não houve anormalidades estruturais ou funcionais hepáticas ao longo do estudo em nenhum dos animais, conforme confirmado pelos níveis de albumina e enzimas hepáticas e pela coloração de glicogênio em cortes de tecido (Figuras 4b e c).

Injeção de fatores de reprogramação <em>in vivo</em>, diagrama de camundongo, plasmídeo, análise de tecido, PCR, citometria.
Figura 1. Visão esquemática do procedimento de reprogramação in vivo e sua análise. O protocolo envolve duas etapas principais: (i) administração de fatores de reprogramação in vivo e (ii) extração do tecido e análise das amostras. Clique aqui para visualizar a figura em tamanho maior.

Análise de expressão gênica; gráficos de barras com dados de expressão relativa ao longo dos dias; figuras a-d; resultados científicos.
Figura 2. Superexpressão in vivo dos fatores de transcrição Yamanaka no fígado de camundongos adultos. Camundongos Balb/C foram injetados por HTV com apenas 0,9% de solução salina, ou com 75 μg de pCX-OKS-2A e 75 μg de pCX-cMyc em 0,9% de solução salina, e em dias 2, 4, 8, 12, 24, foi realizada análise por RT-qPCR de hepatócitos para determinar a expressão gênica relativa de: (a) fatores de transcrição transfectados (OKSM) e (b) marcadores endógenos de pluripotência; (c) análise por citometria de fluxo de células positivas para OCT3/4 e positivas para Nanog; (d) expressão gênica relativa de marcadores de hepatócitos determinada por RT-qPCR. Todos os níveis de expressão gênica foram normalizados ao grupo injetado com solução salina por HTV. (* p<0,05 indica diferença estatisticamente significativa em comparação com os grupos injetados com solução salina por HTV, obtida pela análise de variância e comparação pareada de Tukey). Figura adaptada de Yilmazer et al.29 Clique aqui para visualizar a figura em tamanho maior.

Comparação por microscopia de imunofluorescência de OCT4, SOX2, NANOG em células tratadas com salina versus OKSM.
Figura 3. Reprogramação celular in vivo em tecido hepático de camundongo adulto por imunohistoquímica. Camundongos Balb/C injetados por HTV apenas com salina a 0,9% ou com 75 μg de pCX-OKS-2A e 75 μg de pCX-cMyc em salina a 0,9%. No dia 4, os fígados foram coletados e cortes congelados do tecido foram corados com anticorpos anti-OCT4, anti-SOX2 ou anti-Nanog para avaliar a imunorreatividade, ou com BCIP/NBT para determinar a atividade de fosfatase alcalina no tecido (40X). As barras de escala representam 100 μm. Figura adaptada de Yilmazer et al.29 Clique aqui para visualizar a figura em tamanho maior.

Histologia hepática, níveis de enzimas e albumina no tratamento com salina versus OKSM, resultados do experimento.
Figura 4. O efeito da reprogramação celular in vivo sobre a funcionalidade hepática e a histopatologia. Camundongos Balb/C foram injetados por HTV com 75 μg de pCX-OKS-2A e 75 μg de pCX-cMyc em salina 0,9% ou apenas salina 0,9%. Nos dias 2, 4, 8, 12, 50 e 120, tecidos hepáticos e soros foram isolados e processados para: (a) coloração com H&E; (b) níveis de enzimas hepáticas; (c) níveis de albumina; (d) coloração com PAS. Imagens representativas foram obtidas por microscopia óptica (10X). As barras de escala representam 100 μm. Figura adaptada de Yilmazer et al.29 Clique aqui para visualizar a figura em tamanho maior.

Discussão

Este estudo fornece evidências de prova de princípio da reprogramação celular in vivo em direção à pluripotência após a transferência eficiente e superexpressão dos fatores OKSM para o fígado de camundongo adulto. Com o auxílio de diferentes técnicas, como qRT-PCR, citometria de fluxo, IHQ ou análise sérica, o tecido alvo foi investigado para observar a reprogramação celular in vivo . Muito rapidamente a partir da indução da superexpressão do fator OKSM no tecido, os marcadores de pluripotência foram regulados positivamente nos níveis de mRNA e proteína (dentro de 48 horas). Ao longo desses experimentos, entre 5-15% das células extraídas do tecido mostraram-se Nanog e Oct3/4 positivas. Além disso, não foram observadas anormalidades estruturais ou funcionais no fígado ao longo de 120 dias. A expressão de transgenes por injeção de DNA plasmidial por HTV em outros tecidos além do fígado (pulmão, baço, rim e coração) foi relatada anteriormente, porém os níveis de expressão gênica foram pelo menos 3 ordens de magnitude menores do que os dos hepatócitos30. Os dados deste estudo indicam que a reprogramação de células somáticas para um estado pluripotente in vivo é segura, rápida e eficiente. Tendo em vista a maioria das metodologias de reprogramação celular in vitro existentes que geralmente atingem a geração de células pluripotentes (iPS) em 3 semanas com menos de 1% de eficiência32, a reprogramação in vivo para pluripotência pode oferecer alternativas muito interessantes. Nossa hipótese é que o conceito de reprogramação in vivo para pluripotência poderia ser aplicado a vários tipos de células somáticas com alta eficiência (dependendo do vetor utilizado), no entanto, o nível de pluripotência funcional alcançado nas células reprogramadas in vivo precisará ser determinado. Além disso, com o desenvolvimento de protocolos e tecnologias aprimorados, células reprogramadas in vivo podem ser extraídas e utilizadas para fins de medicina regenerativa.

Existem alguns passos críticos a serem seguidos para reprogramar células somáticas adultas in vivo com alta eficiência. Atingir altos níveis de expressão gênica no tecido-alvo é um pré-requisito. Neste estudo, isso foi ilustrado pela utilização da transferência eficiente e expressão de DNA plasmidial para hepatócitos usando injeção de HTV. Os fatores mais importantes para a injeção de HTV são o volume, que deve estar entre 8-10% do peso corporal total do animal, e a velocidade da injeção, que deve ser realizada dentro de 5-7 segundos. Camundongos com menos de 6 semanas de idade não devem ser usados, pois a injeção de HTV pode causar mais danos aos tecidos do fígado, o que pode afetar a eficiência da reprogramação celular. O background genético dos animais não teve impacto na determinação da eficiência da reprogramação in vivo , pois relatamos anteriormente níveis semelhantes de reprogramação em camundongos Balb/C e TNG-A, sendo este último uma cepa transgênica que carrega o repórter eGFP inserido no locus Nanog e é reproduzida no fundo Sv12929.

Especulamos que a reprogramação celular in vivo para um estado pluripotente (que precisará ser determinado) pode ser aplicada a outros tipos de tecido, desde que os fatores OKSM sejam entregues de forma eficiente às células-alvo, permitindo altos níveis de expressão gênica. Uma variedade de vetores de entrega de genes não virais e virais foi estudada em ensaios pré-clínicos e clínicos para atingir diferentes tipos de células e tecidos33. Por exemplo, para tecidos neurais ou oculares, os vírus adeno-associados têm sido a escolha preferida do vetor para transferência eficiente de genes in vivo 34-37, enquanto no tecido muscular as injeções de DNA de plasmídeo nu demonstraram resultar em níveis relativamente altos de expressão gênica38,39. Portanto, o método de vetor de transferência de genes deve ser cuidadosamente selecionado, dependendo do tipo de tecido, a fim de obter uma reprogramação celular in vivo eficiente e rápida em direção a um estado pluripotente.

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Engenharia e Ciências Físicas (EPSRC, Swindon, Reino Unido) e pela Comissão Europeia Programas FP-7 NANONEUROHOP (PIEF-GA-2010-276051) e ANTICARB (HEALTH-2008-20157). A AY foi apoiada por uma bolsa de doutorado em tempo integral do Ministério da Educação (Turquia) e a IL reconhece o apoio parcial do British Council e da Fundação CAIXA (Espanha). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
pCX-OKS-2A pDNAAddgene19771Obtido de Addgene como facada bacteriana, produção de plasmídeo realizada na Fábrica de Plasmídeos (Alemanha)
pCX-cMycAddgene19772Obtido de Addgene como facada bacteriana, produção de plasmídeo realizada na Fábrica de Plasmídeos (Alemanha)
0,22 μ m filtroMillioporeSLGP033RS
IsofluranoAbbottB505
HBSS bufferSigma-AldrichH6648Ca2+ e Mg2+ livre, com bicarbonato
Fígado Digestão MédiaGibco17703-034
Hepatócito Lavagem MédiaGibco17704-024
100 & Mu; filtro de células mBD Biosciences352360
Kit Nucleospin RNA IIMacherey-Nagel740955.25Kit para isolamento de RNA de células e tecidos
Kit de síntese de cDNA iScriptBio-Rad170-8890
iO SYBR Green SupermixBio-Rad170-8880
Oct3/4 primer diretoSequência Sigmadada nos comentáriosTGAGAACCTTCAGGAGATATGCAA
Oct3/4 primer reversoSequência Sigmadada nos comentáriosCTCAATGCTAGTTCGCTTTCTCTTC
Sox2 forward primerSigmasequence dada nos comentáriosGGTTACCTCTTCCTCCCCTCCAG
Sox2 reverse primerSigmasequence dada nos comentáriosTCACATGTGCGACAGGGGCAG
C-myc forward primerSigmasequence dado nos comentáriosCAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC
C-myc reverse primerSigmasequence given in commentsTTATGCACCAGAGTTTCGAAGCTGTTCG
Nanog forward primerSigmasequence given in commentsCAGAAAAACCAGTGGTTGAAGACTAG
Nanog reverse primerSigmasequence given in commentsGCAATGGATGCTGGGATACTC
Ecat1 forward primerSigmasequence dado nos comentáriosTGTGGCCCTGAAAAGGCGAGCTGAGAT
Ecat1 reverse primerSigmasequence given in commentsATGGGCCGCCATACGACGACGCTCAACT
Rex1 forward primerSigmasequence given in commentsACGAGTGGCAGTTTCTTCTTGGGA
Rex1 reverse primerSigmasequence given in commentsTATGACTCACTTCCAGGGGGCACT
Alb forward primerSigmaseqüência dada nos comentáriosGTTCGCTACACCCAGAAAGC
Alb reverse primerSigmaseqüência dada nos comentáriosCCACACAAGGCAGTCTCTGA
Aat forward primerSeqüência Sigma dada nos comentáriosCAGAGGAGGCCAAGAAAGTG
Aat reverse primerSigmaseqüência dada nos comentáriosATGGACAGTCTGGGGAAGTG
Trf forward primerSigmasequência fornecida nos comentáriosACCATGTTGTGGTCTCACGA
Trf reverse primerSigmasequence given in commentsACAGAAGGTCCTTGGTGGTG
B Actin forward primerSigmasequence given in commentsGACCTCTATGCCAACACAGT
B actin reverse primerSigmasequence given in commentsAGTACTTGCGCTCAGGAGGA
BD Cytofix fixation bufferBD Biosciences
1x BD Perm/Wash bufferBD Biosciences560585
anti-mouse OCT4-PerCP-Cy5.5BD Biosciences560585
anti-mouse Nanog-PEBD Biosciences560585
2-MetilbutanoSigma-AldrichM32631
X100-TritonSigma-AldrichX100-500ML
Sorode cabra Sigma-AldrichG9023
BSASigmaA2153
pAb de coelho anti-OCT4Abcamab19857Use a uma concentração de 3 μ g/ml
de pAb de coelho anti-SOX2Abcamab97959Use na concentração de 1 μ g/ml
de pAb de coelho anti-NanogAbcamab80892Use na concentração de 1 μ g/ml
de camundongo mAb anti-SSEA1Abcamab16285Use na concentração de 20 μ g/ml
de pAb de cabra anti-coelho IgG marcado com Cy3Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.111-165-003-JIRUse a uma concentração de 1/250
de IgG anti-camundongo pAb de cabra marcado com Cy3Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-165-003-JIRUse a uma concentração de 1/250
VECTASHIELD meio de montagem com DAPIVector LaboratoriesH-1200
BCIP/NBT sistema de substrato líquidoSigmaB1911
Meio de montagem aquosoSigma
16% ParaformaldeídoFisherAA433689MA solução de estoque é de 16%, use-a a 4%
de hematoxilina e eosinaSigmaGH53/HT110216
coloração PASSigma395B
560585

Referências

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