Artigo de método

Usando Caenorhabditis elegans como um sistema modelo para estudar a homeostase de proteínas em um organismo multicelular

DOI:

10.3791/50840

⸱

18 de dezembro de 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, National Institute for Biotechnology in the Negev, Ben-Gurion University of the Negev

Neste artigo

Resumo

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Para estudar a relação entre homeostase proteica, estresse e envelhecimento, monitoramos as mudanças no dobramento proteico acompanhando a disfunção proteica, a localização da proteína na célula e a estabilidade proteica nos níveis organismo, celular e proteico, usando o metazoário geneticamente tratável Caenorhabditis elegans como sistema modelo.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O dobramento e a montagem de proteínas são essenciais para a função da proteína, a saúde a longo prazo da célula e a longevidade do organismo. Historicamente, a função e a regulação do enovelamento de proteínas foram estudadas in vitro, em células isoladas de cultura de tecidos e em organismos unicelulares. Estudos recentes descobriram ligações entre homeostase proteóstase (proteostase), metabolismo, desenvolvimento, envelhecimento e detecção de temperatura. Essas descobertas levaram ao desenvolvimento de novas ferramentas para monitorar o dobramento de proteínas no organismo metazoário modelo Caenorhabditis elegans. Em nosso laboratório, combinamos ensaios comportamentais, imagens e abordagens bioquímicas usando proteínas metaestáveis sensíveis à temperatura ou de ocorrência natural como sensores do ambiente de dobramento para monitorar o dobramento incorreto de proteínas. Os ensaios comportamentais associados ao dobramento incorreto de uma proteína específica fornecem uma leitura simples e poderosa do dobramento de proteínas, permitindo a triagem rápida de genes e condições que modulam o dobramento. Da mesma forma, esse dobramento incorreto pode estar associado à localização incorreta de proteínas na célula. O monitoramento da localização de proteínas pode, portanto, destacar mudanças na capacidade de dobramento celular que ocorrem em diferentes tecidos, em vários estágios de desenvolvimento e diante de mudanças nas condições. Finalmente, usando ferramentas bioquímicas ex vivo, podemos monitorar diretamente a estabilidade e a conformação das proteínas. Assim, combinando ensaios comportamentais, técnicas de imagem e bioquímicas, somos capazes de monitorar o desdobramento de proteínas na resolução do organismo, da célula e da proteína, respectivamente.

Introdução

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A interação das várias etapas da biossíntese de proteínas, como transcrição, processamento e tradução de mRNA, bem como dobramento, translocação e montagem/desmontagem de proteínas, determina a carga de proteínas metaestáveis que dependem das máquinas de controle de qualidade de proteínas celulares para sua função1. A ausência ou mau funcionamento das máquinas de controle de qualidade de proteínas pode, portanto, resultar no declínio funcional de diversos tipos de máquinas celulares e no aparecimento de doenças de desdobramento de proteínas2-7. Quando a capacidade das máquinas de dobramento e depuração de proteínas é equilibrada com a carga de proteínas metaestáveis, a homeostase proteica (proteostase) é alcançada, um estado que, em última análise, impede o acúmulo de proteínas mal dobradas e a agregação dentro das células6. Acredita-se que o acúmulo de proteínas mal dobradas seja o sinal que ativa fatores de transcrição induzíveis por estresse, como o fator de choque térmico (HSF-1), e resulta na ativação de respostas citoprotetoras ao estresse6,8.

Nossa compreensão das funções das redes de proteostase em metazoários tem sido derivada principalmente de estudos de reconstituição in vitro e de observações feitas com células de cultura de tecidos e organismos unicelulares9. Por exemplo, a pesquisa sobre chaperonas moleculares que previnem e resolvem danos proteicos tem se concentrado em estudos bioquímicos e biológicos celulares dos mecanismos de dobramento, desagregação e translocação de proteínas mediadas por chaperonas10-13. Em comparação, apenas informações limitadas estão disponíveis sobre a função integrada de vários componentes de proteostase nas diferentes células e tecidos de metazoários sob condições de crescimento "normais" e em resposta ao estresse11. A descoberta de que, em C. elegans, o controle de qualidade da proteína celular também pode ser regulado de forma não autônoma celular, como refletido em experimentos que mostram que mutações nos dois neurônios que percebem a temperatura podem bloquear a ativação da resposta ao choque térmico e reduzir a termotolerância, demonstrou a necessidade de estudar a regulação da proteostase em organismos multicelulares14-17. O que está faltando, no entanto, é uma imagem coesa de como as redes de proteostase, como as várias famílias de chaperonas moleculares, funcionam nos tecidos de um metazoário intacto e quão dinâmicas são essas redes durante o desenvolvimento e o envelhecimento. Para atingir esse objetivo, sensores confiáveis para monitorar a manutenção do proteoma em animais vivos são necessários para determinar a capacidade proteostática de diferentes células em um organismo multicelular durante o curso do desenvolvimento e envelhecimento.

Para que uma determinada proteína funcione como um sensor de proteostase celular, ela deve responder a mudanças no ambiente de dobramento celular, interferindo apenas minimamente no dobramento de proteínas não relacionadas na célula. Para explorar a manutenção e recuperação da proteostase celular em um organismo vivo, duas abordagens complementares que dependem de sensores de dobramento podem ser adotadas. O primeiro se baseia em sensores de dobramento projetados, baseados em proteínas metaestáveis identificadas experimentalmente que são conhecidas por dependerem da maquinaria de proteostase, como a luciferase18-20 do vaga-lume ou a GFP marcada com um degron21-24. Na segunda abordagem, proteínas metaestáveis endógenas, como proteínas agregantes sensíveis à temperatura (ts) ou dependentes da idade que respondem a mudanças incrementais no ambiente celular, são rastreadas25-27. Os sensores dobráveis projetados não têm nenhuma função biológica essencial, mas oferecem a vantagem de serem detectáveis por poderosos ensaios de relatórios, como proteínas marcadas com GFP, e podem ser empregados com muitos modelos celulares e animais diferentes18. No entanto, como a introdução de uma única proteína estranha pode afetar o ambiente de dobramento27, esses polipeptídeos podem sobrecarregar a maquinaria da proteostase celular. Alternativamente, sensores de dobra projetados que não são nativos da célula sobre a qual relatam podem não ser afetados por mudanças na capacidade de proteostase da célula. Por exemplo, um substrato repórter de proteassoma marcado com GFP exigia que ~ 90% do proteassoma fosse inibido antes que um fenótipo pudesse ser detectado23. Em contraste, as proteínas metaestáveis endógenas que dependem das máquinas de proteostase da célula oferecem a vantagem de estar dentro da faixa de sensibilidade celular. No entanto, a perda de função associada ao dobramento incorreto de tais proteínas também pode afetar a função celular e a viabilidade do organismo. Aqui, vamos nos concentrar no uso de sensores de dobra endógenos de C. elegans.

C. elegans é um modelo de metazoário bem estabelecido para o estudo do desenvolvimento e do envelhecimento que utiliza muitas vias biológicas conservadas e pode ser usado para seguir o dobramento de proteínas na célula, usando uma combinação de biologia celular, abordagens bioquímicas e genéticas. Empregamos proteínas metaestáveis como sondas da capacidade proteostática, monitorando mudanças em seu fenótipo, localização e estabilidade. Além disso, uma variedade de funções proteicas pode ser estudada por uma simples análise comportamental. Da mesma forma, a má localização substancial de proteínas ocorre quando as redes de controle de qualidade de proteínas celulares não conseguem se ajustar às demandas celulares. As proteínas podem ser facilmente visualizadas em células de animais vivos usando proteínas marcadas com fluorescência ou por meio de imunocoloração. Finalmente, usando métodos ex vivo, é possível monitorar a expressão e a estabilidade da proteína. Isso permite a triagem rápida e simples de alterações comportamentais e fisiológicas, juntamente com uma análise aprofundada da localização e estabilidade da proteína, permitindo o monitoramento de modificadores de proteostase. Ao combinar esses diferentes métodos, uma visão ampla do ambiente de dobramento de proteínas de uma célula pode ser obtida. De fato, essa estratégia tem sido usada com sucesso para monitorar a perturbação da proteostase em C. elegans, leveduras, cultura de tecidos e bactérias15,25-35.

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Protocolo

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Usando ensaios comportamentais para monitorar o dobramento de proteínas em um organismo vivo

1. Sincronizando animais para ensaios comportamentais

  1. Siga os métodos padrão para manutenção de C. elegans36, incluindo preparação de meios e placas, preparação de alimentos e condições de crescimento animal. Controle cuidadosamente as condições de cultivo, incluindo temperatura (15-25 °C), tamanho da população e disponibilidade de alimentos. Descarte qualquer prato que apresente contaminação bacteriana ou fúngica.
  2. Escolher 15-30 embriões, transferi-los para novas placas e crescer à temperatura desejada (15-25 °C) durante a experiência. Como alternativa, coloque 10-20 adultos grávidas em um prato, deixe-os botar ovos por 30-60 min e depois remova-os do prato. Tanto a colheita direta de embriões quanto a fixação de adultos grávidas darão alguma variabilidade na idade (±6 horas). Para reduzir essa variabilidade, escolha embriões em um estágio específico, por exemplo, estágio de vírgula, ou defina de 10 a 20 adultos que estão apenas começando a botar ovos (dia 2 da idade adulta). Evite a sincronização por clareamento sempre que possível, pois esse tratamento é estressante e pode afetar a proteostase.
  3. Escolha os animais sincronizados, transfira para uma placa de ensaio para pontuação e depois descarte.

2. Ensaio de Movimento

Escolher animais sincronizados e transferir para um prato limpo à temperatura desejada para a pontuação de movimento (15-25 °C). Para cada repetição biológica, pontuar >20 animais e repetir o ensaio pelo menos 3x por condição experimental. Use o teste de soma de postos de Wilcoxon Mann-Whitney para comparar duas condições experimentais independentes.

  1. Para testar se há comprometimento leve do movimento, coloque 5-7 animais juntos no centro de um gramado bacteriano limpo e deixe os animais se moverem no prato por 2 min. Esse intervalo de tempo foi determinado com base no tempo que 90% dos animais selvagens levaram para limpar um círculo de 1 cm.
  2. Contar o número de animais que não limparam um círculo de 1 cm (por exemplo, que permaneceram num raio de 1 cm a partir do ponto em que foram colocados) no período de 2 minutos como descoordenados.
  3. Para testar se há comprometimento grave do movimento, coloque os animais em um gramado bacteriano limpo.
  4. Fotografe vários animais no tempo zero (t = 0) e novamente 5 minutos depois (t = 5). Pontue os animais que não se moveram um comprimento de corpo após 5 min como paralisados.

3. Resistência térmica

  1. Escolha >20 animais sincronizados e transfira para uma placa de 24 poços contendo 450 μl de tampão de choque térmico (HS) (Tabela 1). Para cada repetição biológica, pontuar >20 animais e repetir o ensaio pelo menos 4x por condição experimental.
  2. Transfira a placa de 24 poços para um banho aquecido. A temperatura e a duração do SH dependem fortemente das condições de crescimento, em particular, da temperatura de cultivo.
  3. Suplementar o tampão HS com 9 μl de laranja SYTOX.
  4. Pontue a sobrevivência do animal monitorando a absorção de corante, usando um estereoscópio fluorescente com um filtro TXR. Os animais que absorveram o corante estão mortos. Use o teste de soma de postos de Wilcoxon Mann-Whitney para comparar duas condições experimentais independentes.

Usando imunocoloração e proteínas marcadas para monitorar o dobramento de proteínas em células específicas

4. Monitore a localização de proteínas por imunocoloração

  1. Na fase requerida, transferir pelo menos 30 animais para um tubo Eppendorf contendo tampão M936.
  2. Lave os animais algumas vezes com tampão M9 realizando uma etapa de centrifugação curta e de baixa velocidade (3.000 rpm / 900 x g, 2 min) e ressuspendendo.
  3. Coloque os tubos no gelo por alguns minutos para esfriar.
  4. Remova o excesso de líquido e incube com 500 μl de solução gelada de paraformaldeído a 4% (Tabela 2). O tempo de incubação precisa ser calibrado para cada proteína examinada e deve ser em torno de 5-30 min à temperatura ambiente. A incubação prolongada a 4 °C também pode ser realizada, mas isso pode prejudicar a permeabilização da amostra.
  5. Lave os animais fixos 3x com tampão PBS-Tween (pH 7,2) por centrifugação (3.000 rpm, 1-2 min). Os animais podem ser armazenados nesta fase a 4 °C durante algumas semanas.
  6. Recolher os animais por centrifugação (3.000 rpm, 1-2 min).
  7. No exaustor, remover a maior parte do sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de solução de β-mercaptoetanol (β-ME) (quadro 2).
  8. Incubar a 37 °C durante a noite com um balanço suave num nutador.
  9. No capô, lave os animais 3x com tampão PBS-Tween (pH 7,2).
  10. Ressuspenda os animais em 50-100 μl de PBS-Tween (pH 7,2). Os animais podem ser armazenados nesta fase a 4 °C durante algumas semanas.
  11. Colete os animais por centrifugação (3.000 rpm, 1-2 min) e remova a maior parte do tampão PBS-Tween.
  12. Adicione 100-150 μl de solução de colagenase a cada tubo e incube a 37 ° C com forte agitação (usando um misturador térmico ou uma incubadora agitada).
  13. Examine os animais frequentemente sob um estereomicroscópio, começando após 5 minutos de incubação. Quando 20% dos animais estiverem quebrados, pare a reação colocando o tubo no gelo. Esta etapa é altamente sensível! A duração do tratamento depende das condições de fixação e pode variar muito entre as cepas. Uma incubação prolongada pode resultar na degradação completa dos animais. As condições devem ser calibradas para cada lote de enzimas utilizado e a degradação deve ser cuidadosamente monitorizada.
  14. Lave os animais duas vezes em PBS-Tween (pH 7,2) e, em seguida, colete os animais por centrifugação (3.000 rpm, 1-2 min) e remova a maior parte do tampão PBS-Tween.
  15. Adicione 1 ml de solução de AbA (Tabela 2) e incube com balanço suave por 1 hora em temperatura ambiente. Os animais podem ser armazenados nesta fase a 4 °C durante algumas semanas.
  16. Coletar os animais por centrifugação (3.000 rpm, 1-2 min) e ressuspender em 200 μl AbA.
  17. Adicione o anticorpo primário diluído a 1:100-1:1.000 em solução de AbA e incube com balanço suave. A temperatura e a duração da incubação podem variar entre os anticorpos e devem ser calibradas para cada proteína examinada. Começamos com uma incubação noturna à temperatura ambiente.
  18. Lave os animais por centrifugação (3.000 rpm, 1-2 min).
  19. Adicione tampão AbA (1 ml) e incube com mistura suave por 15-60 min em temperatura ambiente. Os animais podem ser armazenados nesta fase a 4 °C durante algumas semanas.
  20. Opcional: A amostra também pode ser corada com corantes fluorescentes. Para fazer isso, adicione o corante (por exemplo, DAPI (2 mg / ml) ou Faloidina (1: 100)) a 200 μl AbA e incube com balanço suave por até 1 hora. Esta etapa pode ser realizada durante uma das etapas de lavagem do anticorpo secundário.
  21. Lave os animais 3x repetindo os passos 4.18-4.19.
  22. Adicionar 100 μl de AbA com o anticorpo secundário marcado com fluorescência adequado, diluído a 1:100.
  23. Mantenha as amostras cobertas (ou em um tubo escuro) e incube com balanço por várias horas em temperatura ambiente.
  24. Lave os animais 3x incubando em tampão AbA (1 ml) com mistura suave por 15-60 min em temperatura ambiente, seguida de centrifugação (3.000 rpm, 1-2 min). Os animais podem ser armazenados nesta fase a 4 °C durante algumas semanas.
  25. Para montar animais em lâminas, remova todo o líquido e ressuspenda em 10 μl do mesmo tampão.
  26. Corte a extremidade da ponta da pipeta para evitar o corte dos animais e transfira 1-2 μl da amostra para uma lâmina.
  27. Adicione o meio de montagem na proporção de 1:1.
  28. Cubra a lâmina suavemente com uma lamínula e sele com esmalte. Se a lâmina não for monitorada imediatamente, ela pode ser armazenada a -20 °C por um período prolongado de tempo.

5. Monitore a localização de proteínas marcadas

  1. Na fase requerida, recolher pelo menos 15 animais para uma gota de 10 ml de tampão M9 numa lâmina.
  2. Usando um "picareta de minhoca", coloque os animais em uma gota de 10 ml de solução de paraformaldeído (4%) (Tabela 2) e espere até que todos os animais parem de se mover (aproximadamente 5 min).
  3. Usando um "picareta de minhoca", mova os animais para uma gota de 2 ml de tampão M9 e meio de montagem (1:1) (Tabela 2).
  4. Cubra suavemente os animais com uma lamínula e sele com esmalte.

Usando ensaios ex vivo para monitorar o dobramento e a estabilidade de proteínas

6. Digestão Parcial

  1. Lave os animais de 15 placas (60 mm) usando 1-2 ml de tampão M9 em um tubo de microcentrífuga. Observe que os animais não devem estar aglomerados e que deve haver comida suficiente durante toda a experiência.
  2. Lave os animais algumas vezes com tampão M9 centrifugando (3.000 rpm, 2 min) e ressuspendendo os animais.
  3. Após a centrifugação final, ressuspender os animais em tampão M9 de 100 μl.
  4. Congelamento rápido no líquido N2. As amostras podem ser armazenadas a -80 °C.
  5. Usando um pilão resfriado e uma broca motorizada (uma broca de cultura de tecidos portátil também pode ser usada), triture a amostra. Mantenha a amostra no gelo e evite o superaquecimento.
  6. Examine os animais frequentemente sob um estereomicroscópio para determinar se a moagem está completa. Se restarem animais intactos, repita o procedimento.
  7. Estime o volume pipetando o extrato do verme.
  8. Adicione a proporção de 1:1 de (2x) solução de lise de vermes (Tabela 3). Não use inibidores de protease de qualquer tipo.
  9. Incube no gelo por 15 min.
  10. Remover os detritos por centrifugação (1.000 x g durante 2 min) numa centrífuga pré-arrefecida (4 °C).
  11. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo. As amostras podem ser usadas diretamente ou armazenadas a -80 °C.
  12. Preparar a solução de quimotripsina (Tabela 3) e manter no gelo até à utilização.
  13. Determine a concentração total de proteínas usando o ensaio de Bradford.
  14. Diluir a amostra, se necessário, de modo a que a concentração total de proteínas seja de 3-3,5 mg/ml.
  15. Adicione a solução de quimotripsina ao lisado de proteína total (1:1.200).
  16. Para determinar o tempo de incubação, incubar a amostra com quimotripsina durante 60 min. Remover alíquotas de 20 μl da amostra em diferentes momentos (por exemplo, 0, 5, 20, 40 e 60 min), misturar imediatamente com tampão de amostra SDS e ferver durante 5 min a 96 °C. *Em alternativa, incubar a amostra com diferentes concentrações de quimotripsina e parar a reação após um tempo específico, adicionando tampão de amostra SDS e fervendo durante 5 min a 96 °C.
  17. Execute amostras em um gel SDS-PAGE.
  18. Realize a análise de western blot usando anticorpos apropriados para determinar a estabilidade relativa da proteína.
  19. Determine as condições ideais (concentração de quimotripsina e tempo de digestão) que mostram mudanças significativas entre as amostras e use essas condições para experimentos futuros.
  20. Determine a intensidade de diferentes produtos de digestão (fragmentos de menor peso molecular) usando software de densitometria, como o módulo de gel de imagem do NIH.

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Resultados

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Um ambiente de dobramento comprometido pode levar ao desdobramento e agregação de proteínas. O desdobramento de proteínas está associado a conformação alterada e resulta em perda da função da proteína. Usamos abordagens complementares para monitorar o dobramento e a função de proteínas em animais intactos, células específicas e extratos de proteínas. Uma escolha inteligente de sensor de dobramento, baseada em fortes fenótipos comportamentais e celulares associados a uma mutação desestabilizadora conhecida, pode então ser...

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Discussão

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As sondas da capacidade de proteostase celular devem ser altamente sensíveis a mudanças no ambiente de dobramento e ser facilmente monitoradas para fornecer avaliação em tempo real das capacidades de controle de qualidade de dobramento de proteínas. Usando proteínas metaestáveis como sondas da capacidade de proteostase, monitoramos mudanças no fenótipo, localização de proteínas subcelulares e conformação de proteínas. Os protocolos aqui apresentados enfocam os fenótipos associados à proteína muscular, incluindo motilidad...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Todas as cepas de nematóides usadas neste trabalho foram fornecidas pelo Caenorhabditis Genetics Center, que é financiado pelo NIH National Center for Research Resources (NCRR). Os anticorpos monoclonais desenvolvidos por H.F. Epstein foram obtidos do Banco de Hibridoma de Estudos de Desenvolvimento desenvolvido sob os auspícios do NICHD e mantido pelo Departamento de Biologia da Universidade de Iowa. N. Shemesh foi apoiado pelo prêmio Fay e Bert Harbour. AB-Z. foi apoiado por uma bolsa Alon do Conselho Israelense de Educação Superior, por uma bolsa Marie Curie International Reintegration e por doações da Binational Science Foundation e da Israeli Science Foundation (Grant No. 91/11).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Posicionamento de anticorpos e fiaxtionparaformaldeídoMerc8187151000
Tween-20 Bio-Rad1706531
CollagenaseSigmaC5138-100MG
DABCOMerc8034560100
Triton X-100Alfa AesarA16046
β -MESigma8057400250
BSADi Cam000-40-100
  Resumo parcial QuimotripsinaSigmaC4129-250MG
Termo-resistênciaSYTOX LaranjaInvitrogenS11368
ColesterolAmaresco0433-250G
EQUIPAMENTO
M165 FC estereoscópio fluorescenteLeicaTXR filtro
EXi Câmera de Microscopia de Fluorescência AzulQImagingEXI-BLU-R-F-M-14-C
Microscópio confocal ConfoCor 3/510 METAZeiss
Pellet pestlesSigmaZ359947-100EA
Pellet Pestle Motor sem fioKontesK749540-0000
MicroCL 17 Microcentrifuge SeriesThermo75002455Refrigerado, , 230 V 50/60 Hz, inclui 24x rotor de 1,5/2,0 ml com Tampa de Biocontenção ClickSeal

Referências

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  1. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
  2. Arias, E., Cuervo, A. M. Chaperone-mediated autophagy in protein quality control. Curr. Opin. Cell. Biol. 23, 184-189 (2011).
  3. Tyedmers, J., Mogk, A., Bukau, B. Cellular strategies for controlling protein aggregation. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 11, 777-788 (2010).
  4. Walter, P., Ron, D. The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation. Science. 334, 1081-1086 (2011).
  5. Finley, D. Recognition and processing of ubiquitin-protein conjugates by the proteasome. Annu. Rev. Biochem. 78, 477-513 (2009).
  6. Gidalevitz, T., Prahlad, V., Morimoto, R. I. The stress of protein misfolding: from single cells to multicellular organisms. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
  7. Haynes, C. M., Ron, D. The mitochondrial UPR - protecting organelle protein homeostasis. J. Cell. Sci. 123, 3849-3855 (2010).
  8. Akerfelt, M., Morimoto, R. I., Sistonen, L. Heat shock factors: integrators of cell stress, development and lifespan. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol.. 11, 545-555 (2010).
  9. Prahlad, V., Morimoto, R. I. Integrating the stress response: lessons for neurodegenerative diseases from C. elegans. Trends Cell. Biol. 19, 52-61 (2009).
  10. Li, J., Soroka, J., Buchner, J. The Hsp90 chaperone machinery: conformational dynamics and regulation by co-chaperones. Biochim. Biophys. Acta. 1823, 624-635 (2012).
  11. Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
  12. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. J. Struct. Biol. 179, 152-160 (2012).
  13. Mayer, M. P. Gymnastics of molecular chaperones. Mol. Cell. 39, 321-331 (2010).
  14. Durieux, J., Wolff, S., Dillin, A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity. Cell. 144, 79-91 (2011).
  15. Garcia, S. M., Casanueva, M. O., Silva, M. C., Amaral, M. D., Morimoto, R. I. Neuronal signaling modulates protein homeostasis in Caenorhabditis elegans post-synaptic muscle cells. Genes Dev. 21, 3006-3016 (2007).
  16. Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the cellular heat shock response in Caenorhabditis elegans by thermosensory neurons. Science. 320, 811-814 (2008).
  17. Bar-Lavan, Y., Kosolapov, L., Frumkin, A., Ben-Zvi, A. Regulation of cellular protein quality control networks in a multicellular organism. FEBS J. 279, 526-531 (2012).
  18. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat. Methods. 8, 879-884 (2011).
  19. Rampelt, H., et al. Metazoan Hsp70 machines use Hsp110 to power protein disaggregation. EMBO J. 31, 4221-4235 (2012).
  20. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Hsp70 targets Hsp100 chaperones to substrates for protein disaggregation and prion fragmentation. J. Cell. Biol. 198, 387-404 (2012).
  21. Kim, Y. I., Burton, R. E., Burton, B. M., Sauer, R. T., Baker, T. A. Dynamics of substrate denaturation and translocation by the ClpXP degradation machine. Mol. Cell. 5, 639-648 (2000).
  22. Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nat. Methods. 7, 473-478 (2010).
  23. Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
  24. Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
  25. Brown, C. R., Hong-Brown, L. Q., Welch, W. J. Correcting temperature-sensitive protein folding defects. J. Clin. Invest. 99, 1432-1444 (1997).
  26. Van Dyk, T. K., Gatenby, A. A., LaRossa, R. A. Demonstration by genetic suppression of interaction of GroE products with many proteins. Nature. 342, 451-453 (1989).
  27. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311, 1471-1474 (2006).
  28. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 14914-14919 (2009).
  29. Burkewitz, K., Choe, K., Strange, K. Hypertonic stress induces rapid and widespread protein damage in. C. elegans. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 301, 566-576 (2011).
  30. Alavez, S., Vantipalli, M. C., Zucker, D. J., Klang, I. M., Lithgow, G. J. Amyloid-binding compounds maintain protein homeostasis during ageing and extend lifespan. Nature. 472, 226-229 (2011).
  31. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS Biol. 8, (2010).
  32. Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. In press, (2013).
  33. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genet. 5, (2009).
  34. Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genet.. 7, (2011).
  35. Prahlad, V., Morimoto, R. I. Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 14204-14209 (2011).
  36. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  37. Gengyo-Ando, K., Kagawa, H. Single charge change on the helical surface of the paramyosin rod dramatically disrupts thick filament assembly in Caenorhabditis elegans. J. Mol. Biol. 219, 429-441 (1991).
  38. Clark, S. G., Shurland, D. L., Meyerowitz, E. M., Bargmann, C. I., vander Bliek, A. M. A dynamin GTPase mutation causes a rapid and reversible temperature-inducible locomotion defect in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 94, 10438-10443 (1997).
  39. Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300, 1142-1145 (2003).
  40. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Mol. Biol. Cell. 15, 657-664 (2004).
  41. Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes Dev. 22, 1427-1438 (2008).
  42. Taylor, R. C., Dillin, A. Aging as an event of proteostasis collapse. Cold Spring Harb. Perspect. Biol.. 3, (2011).
  43. Tissenbaum, H. A. Genetics, Life Span, Health Span, and the Aging Process in Caenorhabditis elegans. J. Gerontol. A. Biological Sci. Med. Sci. 67, 503-510 (2012).
  44. Hosono, R., Mitsui, Y., Sato, Y., Aizawa, S., Miwa, J. Life span of the wild and mutant nematode Caenorhabditis elegans. Effects of sex, sterilization, and temperature. Exp. Gerontol. 17, 163-172 (1982).
  45. Madi, A., et al. Mass spectrometric proteome analysis for profiling temperature-dependent changes of protein expression in wild-type Caenorhabditis elegans. Proteomics. 3, 1526-1534 (2003).
  46. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419, 808-814 (2002).
  47. Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295, 669-671 (2002).
  48. Melkani, G. C., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. The UNC-45 chaperone is critical for establishing myosin-based myofibrillar organization and cardiac contractility in the Drosophila heart model. PLoS One. 6, (2011).
  49. Gosai, S. J., et al. Automated high-content live animal drug screening using C. elegans expressing the aggregation prone serpin alpha1-antitrypsin Z. PLoS One. 5, (2010).
  50. Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. (313), 1604-1610 (2006).
  51. Cohen, E., et al. Reduced IGF-1 signaling delays age-associated proteotoxicity in mice. Cell. 139, 1157-1169 (2009).
  52. Shemesh, N., Shai, N. Ben-Zvi A (2013) Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (2013), 814-822 (2013).

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