FtsZ Polimerização Ensaios: protocolos simples e Considerações

Resumo

A polimerização de FtsZ é essencial para a divisão celular bacteriana. Neste relatório, detalhamos protocolos simples para monitorar a atividade de polimerização de FtsZ e discutimos a influência da composição do tampão. Os protocolos podem ser usados para estudar a interação de FtsZ com proteínas reguladoras ou drogas antibacterianas que afetam a polimerização de FtsZ.

Resumo

Durante a divisão celular das bactérias, a proteína FtsZ essencial monta no meio da célula de modo a formar o chamado anel Z. FtsZ polimerize em filamentos longos na presença de GTP, in vitro, e a polimerização é regulado por várias proteínas acessórias. Polimerização FtsZ tem sido extensivamente estudada in vitro, utilizando métodos básicos, incluindo espalhamento de luz, sedimentação, GTP ensaios de hidrólise e microscopia eletrônica. A influência das condições de tampão ambas as propriedades de polimerização de FtsZ, e a capacidade de FtsZ para interagir com as proteínas reguladoras. Aqui, descrevemos os protocolos para os estudos de polimerização de FtsZ e validar as condições e controles utilizando Escherichia coli e Bacillus subtilis FtsZ como proteínas modelo. Um ensaio de sedimentação baixa velocidade é introduzido, que permite o estudo da interação de FtsZ com proteínas que empacotam ou tubulate polímeros de FtsZ. Um protocolo de ensaio melhorado GTPase é descrito que permite testarde hidrólise de GTP ao longo do tempo utilizando várias condições de uma instalação de placa de 96 poços, com tempos de incubação normalizadas que eliminam a variação no desenvolvimento da cor na reacção de detecção de fosfato. A preparação de amostras para estudos de espalhamento de luz e microscopia eletrônica é descrito. Vários tampões são utilizados para estabelecer pH adequado e concentração de sal para estudos de polimerização FtsZ. Uma alta concentração de KCI é a melhor para a maioria das experiências. Os nossos métodos de fornecer um ponto de partida para a caracterização em vitro de FtsZ, não só do E. coli e B. subtilis, mas a partir de qualquer outra bactéria. Como tal, os métodos podem ser utilizados para os estudos da interacção de FtsZ com proteínas reguladoras ou o teste de drogas antibacterianas, que podem afectar a polimerização FtsZ.

Introdução

O FtsZ essencial proteína bacteriana é a melhor proteína caracterizado da máquina divisão celular bacteriana. FtsZ é o homólogo procariótico de tubulina polimeriza e in vitro, de um modo dependente de GTP. FtsZ é um alvo muito atraente para novos antibióticos, devido à sua natureza conservada e exclusividade para bactérias ^1,2. No inicio da divisão celular, FtsZ forma um anel em cytokinetic midcell, que serve como suporte para a montagem de outras proteínas de divisão celular. A formação do anel Z é essencial para a correcta localização do plano de divisão. A dinâmica de montagem de FtsZ são regulados por diversas proteínas acessórias, tais como (dependendo das espécies bacterianas) MinC, SepF, ZapA, UgtP, e Esdras ^2. Polimerização FtsZ tem sido intensivamente estudada in vitro e muitas estruturas diferentes, incluindo protofilamentos rectas, curvas protofilamentos, folhas de filamentos, feixes de filamentos e de tubos de filamentos têm sido descrita, dependendo do tampão de montagem, de nucleótidos, e as proteínas adicionais incluídos no ensaio ^3. A arquitetura do protofilamentos FtsZ in vivo ainda não está totalmente compreendido, embora experimentos cryotomography elétron em Caulobacter crescentus sugerem que o anel Z é montado a partir, protofilamentos único descontínuos relativamente curtos sem extensa agregação ^4.

In vitro, as propriedades de polimerização de FtsZ e a interacção de FtsZ com proteínas reguladoras são sensíveis à composição do tampão de reacção. Por exemplo, recentemente descrito para o sítio de interacção SepF na FtsZ C-terminal e que mostrou um truncamento do terminal C Δ16 FtsZ _Bs já não se liga ao SepF ^5. Em um estudo anterior sobre a interação SepF-FtsZ _Bs, um semelhante FtsZ _Bs Δ16 ainda truncamento cosedimented com SepF, que sugeriu que SepF se liga a um site secundário em FtsZ ^{6. A diferença entre estes estudos foi a composição de tampões de reacção em pH 7,5 não foi cosedimentation de SepF com o truncamento FtsZ, ao passo que a pH 6,5 não foi cosedimentation. Gündoğdu et al. notado que SepF não é funcional e precipita a um pH de 6,5 7, que mostra que o cosedimentation observada a pH 6,5, é susceptível de ser causada pela precipitação de SepF vez de interacção com o truncamento do terminal C Δ16 FtsZ _Bs. A influência do pH e da concentração de KCl no polimerização de FtsZ foi anteriormente analisado. Polímeros de E. coli FtsZ (FtsZ _Ec) a pH 6,5 são mais longos e mais abundantes do que os que são formados a 8,9 pH neutro. Tadros et al. estudaram a polimerização de FtsZ _Ec na presença de cátions monovalentes lembrando que k + ligação está ligado a polimerização FtsZ _Ec e é crucial para a atividade FtsZ 10. O pH é mais critical quando a interacção de outras proteínas com FtsZ é estudada, como mostrado pelo exemplo anterior de SepF, e a dependência do efeito inibitório do MinC em FtsZ pH 11. Como tanto o pH ea concentração de sal pode influenciar a interação entre FtsZ com outras proteínas, é importante escolher as condições adequadas e controles para os estudos de polimerização de FtsZ.}

Aqui nós descrevemos os protocolos para estudar polimerização FtsZ e atividade GTPase por espalhamento de luz, microscopia eletrônica, sedimentação, e ensaios GTPase. Direita a dispersão da luz de ângulo é um método padrão para estudar polimerização FtsZ em tempo real ^12. Introduzimos algumas melhorias para o ensaio de sedimentação e GTPase. Apresentamos em detalhes como preparar amostras para espalhamento de luz e microscopia eletrônica. Vários tampões utilizados na literatura para estudar polimerização FtsZ foram testados e descrevem-se as melhores condições para cada experimento. Mostramos também que controla deve serapresentado para a obtenção dos melhores dados.

Estes métodos permitem um estudo rápido de polimerização FtsZ, atividade e interação com outras proteínas, utilizando métodos e equipamentos que está disponível na maioria dos laboratórios simples. Existem métodos mais sofisticados para estudar polimerização FtsZ mas muitas vezes exigem acesso a equipamentos mais especializados, e / ou modificação de FtsZ com etiquetas fluorescentes ^8,13,14. Os métodos simples descritos neste documento são ilustrados usando FtsZ de B. subtilis e E. coli, a organismos gram-modelo mais comum Gram + e. Os protocolos podem ser adaptados a qualquer outra proteína FtsZ. Com base em ensaios preliminares com estes novos FtsZs, pequenas mudanças em relação ao tempo, tampão ou temperatura de incubação pode ser necessário para um ótimo resultado. As experiências descritas aqui devem ajudar a encontrar estas condições ideais.

Protocolo

As proteínas FtsZ não marcadas foram purificadas conforme descrito anteriormente^11,15, dialisadas contra 20 mM de Tris/HCl (pH 7,9), 50 mM de KCl, 1 mM de EGTA, 2,5 mM de MgAc e 10% de glicerol e armazenadas a -80 °C. Nessas condições, a proteína pode ser armazenada por mais de 2 anos sem perda significativa de atividade. A proteína deve ser armazenada em alíquotas de 100 μl para evitar o descongelamento e o congelamento da amostra. Após a descongelação, a amostra pode ser mantida a 4 °C durante no máximo uma semana. FtsZ é solúvel em altas concentrações e pode ser armazenado a 7-10 mg / ml. É importante manter a concentração de proteína alta para evitar efeitos indesejados dos componentes do tampão de armazenamento em experimentos posteriores. Assim, a concentração de armazenamento deve permitir uma diluição de FtsZ de pelo menos 10x para reduzir a concentração de glicerol abaixo de 1% e minimizar a concentração dos outros componentes do tampão de diálise na mistura de reação. A polimerização de FtsZ também pode ser afetada pela presença de altas concentrações de sódio⁹ ou imidazol, portanto, esses componentes devem ser removidos do tampão de polimerização. O SepF foi purificado conforme descrito⁷ e armazenado em tampão de eluição a -80 °C. Procedimentos alternativos publicados para purificação de FtsZ de E. coli e B. subtilis, bem como referências aos procedimentos para purificação de FtsZ de diferentes fontes, estão resumidos na Tabela 1 (consulte a seção de resultados representativos).

1. Preparação da amostra

1. Prepare tampões de polimerização: 1 50 mM Hepes/NaOH, pH 7,5 algarismo 25 mM PIPES/NaOH, pH 6,8 3 50 mM MES/NaOH, pH 6,5 4 50 mM Hepes/NaOH, pH 7,5; 50 mM KCl 5 25 mM PIPES/NaOH, pH 6,8; 50 mM KCl 6 50 mM MES/NaOH, pH 6,5; 50 mM KCl 7 50 mM Hepes / NaOH, pH 7,5; 300 mM KCl 8 25 mM PIPES/NaOH, pH 6,8; 300 mM KCl 9 50 mM MES/NaOH, pH 6,5; 300 mM KCl
2. Esterilize todos os tampões usando um filtro de membrana de 22 μm.
3. Preparar 100 mM GTP, GDP e MgCl₂ soluções de reserva em cada tampão de polimerização de (1).
4. Pré-limpe as proteínas girando a 100.000 x g por 20 min a 4 °C para todos os experimentos.

2. Ensaio de sedimentação FtsZ

1. Preparar a mistura de reacção por adição de MgCl₂ e FtsZ a um dos tampões de polimerização (ver ponto de preparação da amostra 1) em tubos compatíveis com centrifugação de alta velocidade. O volume total deve ser de 49 μl, com MgCl₂ a 10 mM e FtsZ a 12 μM a 50 μl de volume final.
2. Colocar o tubo numa incubadora com função de agitação, incubar durante 2 min a 30 °C a 300 rpm (em alternativa, a amostra pode ser sacudida suavemente e microfugada brevemente, seguida de pré-aquecimento a 30 °C).
3. Inicie a polimerização adicionando 1 μl de solução estoque de GTP ou GDP no mesmo tampão usado no experimento (concentração final de 2 mM). Incubar durante 10 ou 2 min (para tampões com 50 mM KCl e 300 mM KCl, respetivamente) a 30 °C a 300 rpm (ou numa incubadora com função de agitação).
4. Transfira os tubos para um rotor de ultracentrífuga e gire para baixo por 10 min a 350.000 x g (89.700 rpm para rotor TLA 120.1) a 25 °C.
5. Após a centrifugação, remova cuidadosamente os tubos do rotor e transfira imediatamente o sobrenadante para um tubo limpo. Prepare amostras para SDS-PAGE adicionando 20 μl de sobrenadante a 20 μl de tampão de amostra 2x. Ferva por 10 min a 98 °C.
6. Adicione 50 μl de tampão de amostra 2x à fração de pellets contendo polímeros FtsZ. Coloque o tubo de ultracentrífuga em um tubo de 2 ml. Ressuspender o pellet fervendo durante 10 min a 98 °C e, em seguida, adicionar 50 μl de H₂O desmineralizado para fazer a amostra com a mesma diluição de 2x que a amostra sobrenadante.
7. Vire o tubo da ultracentrífuga de cabeça para baixo no tubo de 2 ml e gire para baixo por 5 minutos em uma centrífuga Eppendorf a 18.000 x g. Remova o tubo da ultracentrífuga do tubo de 2 ml.
8. Carregue 10 μl de cada sobrenadante e amostra de pellet lado a lado em um gel SDS-PAGE a 10%. Execute o gel a 150 V.
9. Manchar o gel com Coomassie Brilliant Blue G-250 e guardar para quantificação.

3. Ensaio de sedimentação FtsZ em rotação lenta

1. Prepare a solução de polimerização como na etapa 2, adicione SepF e / ou FtsZ (concentração final de 12 μM). Esses experimentos podem ser realizados em tubos descartáveis de 1,5 ml de Beckman em combinação com um rotor TLA-55.
2. Coloque o tubo em uma incubadora com função de agitação e incube por 2 min a 30 °C a 300 rpm.
3. Iniciar a polimerização adicionando 1 μl de GTP ou GDP a partir de uma solução de reserva (concentração final de 2 mM), incubar durante 20 min a 30 °C a 300 rpm.
4. Gire para baixo por 15 min a 24.600 x g (20.000 rpm para rotor TLA 55) a 25 °C.
5. Remova o sobrenadante e transfira para um tubo limpo, pegue 20 μl e transfira para 20 μl de tampão de amostra 2x. Ferva por 10 min a 98 °C.
6. Adicione 50 μl de tampão de amostra 2x à fração de pellets contendo polímeros e ressuspenda fervendo por 10 min a 98 ° C, adicione 50 μl de H₂O desmineralizado.
7. Carregue 10 μl de cada sobrenadante e amostra de pellet lado a lado em um gel SDS-PAGE a 10%. Execute o gel a 150 V.
8. Manchar o gel com Coomassie Brilliant Blue G-250 e guardar para quantificação.

4. Quantificação dos ensaios de sedimentação FtsZ

1. Tire uma foto do gel corado de Coomassie usando um sistema de documentação de gel (por exemplo, LAS-4000, Fujifilm).
2. Abra a imagem do gel em um programa adequado para análise densitométrica de géis (por exemplo, programa analisador de imagem AIDA (Raytest)) e descreva a análise neste programa abaixo.
3. Clique no botão "Avaliação" na barra de ferramentas.
4. Selecione "Densitometria 2D" na lista e clique em ok.
5. No menu principal, clique em "Avaliação" e escolha a entrada "Determinação da região".
6. Para criar uma região no gel, clique no símbolo da ferramenta Contorno automático na caixa de ferramentas Determinação de região.
7. Clique no canto superior esquerdo da banda de proteína no gel, mantenha pressionado o botão do mouse e arraste-o para a extremidade inferior direita desejada da banda e solte o botão do mouse.
8. Marque cada banda FtsZ/SepF da mesma maneira.
9. Todas as informações sobre a avaliação das regiões atribuídas podem ser encontradas no Relatório da Região. Para obter o Relatório de Região, clique no botão "Mostrar Relatório de Região" na caixa de ferramentas de Determinação de Região.
10. Para exportar o relatório, no menu principal, clique em Arquivo e escolha a entrada "Exportar à Relatório de Região 2D".
11. No relatório da região, a intensidade de cada região criada deve ser encontrada. Calcule a porcentagem de proteína (FtsZ, proteína reguladora) no pellet usando os valores de intensidade do relatório.

5. Dispersão de luz de 90°

1. Ligue um espectrômetro de fluorescência (por exemplo, AMINCO-Bowman Série 2), deixe a lâmpada aquecer por vários minutos para evitar flutuações térmicas e ligue um banho-maria circulante para manter a temperatura da câmara da cubeta em 30 °C.
2. Defina os parâmetros operacionais do espectrômetro: detector de alta tensão 300 V, comprimento de onda de emissão e excitação: 350 nm, largura da fenda: 4 nm. Observe que muitos espectrômetros ajustam automaticamente o sinal no início de um experimento para uma certa porcentagem (por exemplo, 60%) do máximo. Isso faz com que um sinal de dispersão saia do alcance assim que o GTP é adicionado para polimerizar o FtsZ. É aconselhável primeiro estabelecer a amplificação de sinal correta - detector de alta tensão - para polimerização máxima antes de iniciar uma série de experimentos.
3. Programe um protocolo de aquisição de dados. Escolha a aquisição baseada em tempo, com duração de 3.600 seg.
4. Limpe cuidadosamente uma cubeta de fluorescência com água e etanol, se necessário - sonicar em banho-maria à temperatura ambiente por 5 min. Neste protocolo, cubetas com um comprimento de caminho de 1 cm e um volume de 200 μl foram usadas e armazenadas em solução de armazenamento (0,5-1% Hellmanex). Como alternativa, podem ser usadas cubetas de plástico compatíveis com UV de uso único (UVette, Eppendorf).
5. Preparar 294 μl de uma mistura principal do tampão de polimerização (ver ponto 1 de preparação da amostra) com 10 mM de MgCl₂ e 12 μM de FtsZ como concentração final calculada para 300 μl e vórtice.
6. Transferir 196 μl do tampão de polimerização para a cubeta e colocá-lo no espectrómetro. Incubar durante 2 min a 30 °C.
7. Inicie a aquisição de dados e aguarde 90 segundos para verificar se o sinal está estável.
8. Adicione 4 μl de 100 mM GTP ou GDP (concentração final: 2 mM) para obter um volume de reação final de 200 μl, pipete para cima e para baixo com uma pipeta de volume maior para misturar e retomar a aquisição.

6. Microscopia Eletrônica de Transmissão

1. Preparar amostras como para o ensaio de sedimentação FtsZ (o volume pode ser reduzido para 10 μl de volume final para poupar material).
2. Após o tempo de incubação, aplique 2 μl da amostra em uma grade de cobre revestida de carbono de 400 mesh descarregada com brilho e incube por 15 segundos.
3. Seque a grade tocando suavemente ou arrastando-a paralela ou perpendicular a um pedaço de papel de filtro.
4. Manchar a grelha com 4 μl de uma solução de acetato de uranilo a 2%. Seque a grelha conforme descrito no passo 6.3.
5. Visualize a grade em um microscópio eletrônico Philips CM120 operando a 120 kV com ampliação de 39.200X.

7. Ensaio de hidrólise GTP

A configuração do experimento é projetada de tal forma que a hidrólise GTP de FtsZ é interrompida após vários tempos de reação, misturando a reação com verde malaquita. Desta forma, o tempo de desenvolvimento da cor do verde malaquita é o mesmo para cada amostra.

1. Preparar 1,5 ml de GTP a 2 mM num dos tampões de polimerização (ver preparação da amostra, ponto 1).
   Preparar uma diluição padrão de fosfato de 0-40 μM num tampão de polimerização e preparar o reagente de trabalho verde malaquita conforme descrito no kit POMG-25H (Bioensaios). Alternativamente, os reagentes de trabalho podem ser preparados internamente de acordo com os protocolos descritos por Lanzetta et al.¹⁶
2. Preparar master mixes em um volume total de 360 μl: eu 24 μM FtsZ_Bs, 20 mM MgCl₂, tampão de polimerização Ii 12 μM FtsZ_Ec, 20 mM MgCl₂, tampão de polimerização III (controlo 1) 24 μM FtsZ_Bs, EDTA 2 mM, tampão de polimerização IV (controle 2) 12 μM FtsZ_Ec, 2 mM EDTA, tampão de polimerização
3. Pipetar alíquotas de 20 μl das misturas principais, padrões de fosfato de 100 μl e 180 μl de GTP 2 mM numa placa de qPCR de 96 poços, pela seguinte ordem: um O O D E O O H 1 Iii Iii eu eu Iv Iv Ii Ii algarismo Iii Iii eu eu Iv Iv Ii Ii 3 Iii Iii eu eu Iv Iv Ii Ii 4 Iii Iii eu eu Iv Iv Ii Ii 5 Iii Iii eu eu Iv Iv Ii Ii 6 Iii Iii eu eu Iv Iv Ii Ii 7 Iii Iii eu eu Iv Iv Ii Ii 8 Iii Iii eu eu Iv Iv Ii Ii 9 Ps Ps Ps Ps Ps Ps Ps Ps 10 Ps Ps Ps Ps Ps Ps Ps Ps 11 12 GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP
   PS - padrão de fosfato
4. Coloque a placa qPCR em uma máquina de PCR com o programa definido para um ciclo de 40 min a 30 °C.
5. Preparar alíquotas de 20 μl de reagente de trabalho verde malaquita numa placa de 96 poços. Adicione 60 μl do tampão de polimerização do experimento às pistas 1'-8'. A amostra será diluída 4x em comparação com o padrão de fosfato, considere este fato durante os cálculos finais.

   	um	O	O	D	E	O	O	H
   1'	Iii	Iii	eu	eu	Iv	Iv	Ii	Ii
   2'	Iii	Iii	eu	eu	Iv	Iv	Ii	Ii
   3'	Iii	Iii	eu	eu	Iv	Iv	Ii	Ii
   4'	Iii	Iii	eu	eu	Iv	Iv	Ii	Ii
   5'	Iii	Iii	eu	eu	Iv	Iv	Ii	Ii
   6'	Iii	Iii	eu	eu	Iv	Iv	Ii	Ii
   7'	Iii	Iii	eu	eu	Iv	Iv	Ii	Ii
   8'	Iii	Iii	eu	eu	Iv	Iv	Ii	Ii
   9'	Ps	Ps	Ps	Ps	Ps	Ps	Ps	Ps
   10'	Ps	Ps	Ps	Ps	Ps	Ps	Ps	Ps

6. Adicione 20 μl de GTP à pista 1, pipete para cima e para baixo para misturar, inicie o temporizador (este é o ponto de tempo inicial para a reação de 30 minutos).
7. Após 10 min, 30 seg, adicione GTP à pista 2, pipete para cima e para baixo para misturar (reação de 20 min).
8. Após 16 minutos, adicione GTP à pista 3, pipete para cima e para baixo para misturar (reação de 15 minutos).
9. Após 21 min, 30 seg, adicione GTP à pista 4, pipete para cima e para baixo para misturar (reação de 10 min).
10. Após 25 minutos, adicione GTP à pista 5, pipete para cima e para baixo para misturar (reação de 7 minutos).
11. Após 27 min, 30 seg, adicione GTP à pista 6, pipete para cima e para baixo para misturar (reação de 5 min).
12. Após 29 min, adicione GTP à pista 7, pipete para cima e para baixo para misturar (reação de 4 min)..
13. Após 30 minutos, transfira 20 μl da pista 1 para a pista 1', pipete para cima e para baixo para misturar (ponto de partida do desenvolvimento da cor verde malaquita para a reação de 30 minutos).
14. Após 30 min, 30 seg, transfira 20 μl da pista 2 para 2 ', pipete para cima e para baixo para misturar (ponto de partida do desenvolvimento da cor verde malaquita para a reação de 20 min).
15. Repita a etapa para as pistas 3-7 a cada 30 segundos.
16. Após 33 min, 30 seg, adicione 20 μl de GTP à pista 8, pipete para cima e para baixo para misturar e transfira 20 μl para a pista 8 ', pipeta para cima e para baixo para misturar (reação de 0 min e ponto de tempo inicial para o desenvolvimento da cor verde malaquita para a reação).
17. Após 34 minutos, adicione 80 μl da pista 9 a 9 ', pipete para cima e para baixo para misturar (o ponto de tempo inicial para o desenvolvimento da cor verde malaquita para o padrão de fosfato 1).
18. Após 34 min 30 seg, transfira 80 μl da pista 10 para 10', pipete para cima e para baixo para misturar (o ponto de tempo inicial para o desenvolvimento da cor verde malaquita para o padrão de fosfato 2).
19. Remova todas as bolhas de ar das amostras e incube a placa em temperatura ambiente por mais 25 min 30 seg.
20. Coloque a placa no leitor de placas de 96 poços.
21. Após 60 minutos, meça a placa 10x a cada 30 segundos no comprimento de onda de 630 nm (o desenvolvimento da cor verde malaquita agora é de 30 minutos para a primeira reação). Cada medição corresponde a todos os pontos de tempo das etapas 7.6-7.12 e 7.16 e deve ser calculada separadamente durante uma análise de dados.
22. Calcular o fosfato livre em cada amostra utilizando a curva de calibração padrão do fosfato.
23. Plote os dados como liberação de fosfato ao longo do tempo e calcule a atividade de hidrólise do FtsZ GTP a partir da faixa linear da curva.

Resultados

A purificação de FtsZ de diferentes fontes bacterianas foi descrita na literatura e está resumida na Tabela 1.

fonte método modificação Rendimento obtido [mg/L de cultura]> Referências B. subtilis 1) Cromatografia de precipitação / troca iônica de sulfato de amônio Não 40 Este trabalho, 11,15 2) Cromatografia de afinidade Sua tag Nd 17 E. coli 1) Cromatografia de precipitação / troca iônica de sulfato de amônio Não 35 Este trabalho, 11,15 2) Precipitação de cálcio, cromatografia de troca iônica Não 40 18 Methanococcus jannaschii 1) Cromatografia de afinidade em condições de desnaturação / redobramento / precipitação de sulfato de amônio / filtração em gel Sua tag 1.3 19 2) Cromatografia de afinidade / filtração em gel Sua tag Nd 20 Thermotoga maritima Cromatografia de troca iônica/filtração em gel Não 6.7 19 Pseudomonas aeruginosa Cromatografia de afinidade/filtração em gel Strep-tag, His-tag Nd 21 Mycobacterium tuberculosis 1) Cromatografia de afinidade/troca iônica Não Nd 22 2) Cromatografia de afinidade / filtração em gel Não 30 23 Aquifex aeolicus Cromatografia de afinidade/filtração em gel Truncamento C-terminal (331-367) Nd 24 Caulobacter crescentus Cromatografia de troca iônica/precipitação de sulfato de amônio/filtração em gel Não Nd 25

Tabela 1. Protocolos de purificação FtsZ descritos. ND: não determinado.

Sedimentação de polímeros FtsZ

Inicialmente, usamos duas velocidades diferentes para reduzir os polímeros FtsZ. Descobrimos que apenas a uma velocidade de 350.000 x g polímeros simples de FtsZ_Ec são girados para baixo (Figura 1), enquanto a 190.000 x g apenas feixes de FtsZ_Bs estão presentes na fração de pellets (dados não mostrados). Portanto, 350.000 x g foi usado em nossos experimentos posteriores. A porcentagem de FtsZ_Ec e FtsZ_Bs polimerizados é semelhante a 50 mM KCl, embora os experimentos de espalhamento de luz tenham revelado um sinal de espalhamento muito maior para FtsZ_Bs. Isso se deve aos feixes formados por FtsZ_Bs que espalham mais luz do que os polímeros individuais de FtsZ_Ec. Não foi possível obter alta quantidade de polímeros FtsZ na fração pellet no experimento com 300 mM KCl para_{FtsZ Ec} e FtsZ_Bs (Figura 1). Atribuímos isso a uma combinação de desmontagem rápida das estruturas FtsZ e diminuição do agrupamento dos filamentos.

Sedimentação dos túbulos FtsZ-SepF

Para analisar a interação de FtsZ com certos ativadores, os ensaios de sedimentação podem ser realizados em velocidades de centrifugação mais baixas. A esta velocidade, apenas grandes estruturas de FtsZ podem ser peletizadas, por exemplo, os grandes túbulos formados por anéis SepF e filamentos FtsZ_Bs ⁵, ou os feixes formados por FtsZ e ZapA. Utilizamos centrifugação mais baixa (24.600 x g) para demonstrar a viabilidade dessa abordagem para os túbulos formados por FtsZ e SepF. FtsZ foi recuperado no pellet acima dos níveis de fundo apenas quando SepF e GTP estavam presentes na amostra (Figura 2), e a presença de SepF não influencia a atividade da GTPase^{FtsZ 7}, mostrando que FtsZ está totalmente ativo na presença de SepF. A sedimentação específica de SepF e FtsZ é de aproximadamente 45% do total de SepF e 15% do total de FtsZ (em comparação com a sedimentação do material quando o GDP é adicionado). Isso mostra que os túbulos SepF-FtsZ contêm mais SepF do que FtsZ. Isso pode ocorrer porque muitos anéis SepF organizam os túbulos FtsZ-SepF^5,7. A estequiometria exata de SepF-FtsZ nesses túbulos não é conhecida, mas nossos resultados sugerem que há mais SepF presente do que FtsZ.

FtsZ_Ec e FtsZ_{Bs propriedades de} polimerização e agrupamento

Para caracterizar a eficiência de polimerização de FtsZ_Bs e FtsZ_Ec em diferentes tampões, analisamos ambas as proteínas por espalhamento de luz em ângulo de 90°. A 50 mM KCl, FtsZ_Bs fornece um sinal de espalhamento de luz 20-40 vezes maior do que FtsZ_Ec, dependendo do pH do tampão (Figuras 3A e B), confirmando os resultados de Buske et al. ²⁶ O aumento da concentração de KCl no tampão não influenciou significativamente o sinal de espalhamento de luz de FtsZ_Ec (Figura 3D), mas o sinal de FtsZ_Bs diminuiu ~ 80 vezes em pH 7,5, ~ 30 vezes em pH 6,8 e ~ 45 vezes em pH 6,5 em 300 mM KCl (Figura 3C) em comparação com tampões com 50 mM KCl (Figura 3A). A desmontagem dos polímeros FtsZ é mais rápida em concentrações mais altas de KCl para ambas as proteínas (Figuras 3C e D). Estudos de Pacheco-Gómez et al. mostram que a polimerização e o agrupamento de E. coli FtsZ dependem do pH. Esses autores descobriram que em um tampão com 50 mM KCl o sinal de espalhamento de luz da polimerização de FtsZ foi maior, e a desmontagem de FtsZ demorou mais em pH 6,0 em comparação com pH 7,0 ⁸. Esses resultados não estão de acordo com nossos dados de polimerização de FtsZ_Ec a 50 mM KCl (Figura 3B), mas deve-se notar que usamos três tampões diferentes (HEPES, MES e PIPES) onde Pacheco-Gómez et al. usou apenas MES. Assim, não apenas o pH, mas também a composição do tampão (força iônica) afeta a cinética dos polímeros FtsZ a 50 mM KCl. No entanto, a 300 mM de KCl, nem a composição do tampão nem o pH influenciaram a montagem de FtsZ_Ec de maneira detectável.

Um experimento de espalhamento de luz de FtsZ_Bs em tampões sem KCl não foi possível devido à precipitação da proteína nessas condições. Quando a concentração de FtsZ_Bs foi reduzida para 3 μM, a precipitação não ocorreu. No entanto, 3 μM não é a concentração fisiológica de FtsZ na célula. Em cubetas de plástico,_{FtsZ Bs} não precipitou a 12 μM em pH 7,5, mas em pH 6,8 e 6,5 FtsZ ainda precipitou na ausência de KCl.

Morfologias de estruturas FtsZ de E. coli e B. subtilis

As estruturas formadas por FtsZ foram inspecionadas por TEM. FtsZ_Bs montados em polímeros compactados que cobriam toda a grade em todos os tampões com baixo teor de sal (Figuras 4A-C). FtsZ_Ec formou longos filamentos, cabos e feixes em todos os buffers com baixo teor de sal (Figuras 4D-F). No entanto, a quantidade observável de polímeros formados por FtsZ_Ec foi menor do que a quantidade formada por FtsZ_Bs. Em tampões com alto teor de sal, os FtsZ_Bs formaram protofilamentos de fita simples mais longos que não se associaram em feixes (Figuras 4G-I). Enquanto os protofilamentos FtsZ_{Bs mudaram de} estrutura em maior concentração de sal, FtsZ_Ec formou estruturas indistinguíveis daquelas de tampão de baixo teor de sal (Figuras 4J-L). Não houve influência observável do pH na polimerização de FtsZ_Ec, mas FtsZ_Bs forma mais feixes em pH 6,5 que são visíveis como polímeros e folhas compactados ( Figura 4B ). Esses resultados estão de acordo com nossos experimentos de espalhamento de luz e trabalhos TEM publicados anteriormente^8,11,26.

A atividade GTPase de FtsZ em altas e baixas concentrações de KCl

A atividade de hidrólise GTP de FtsZ foi medida em diferentes condições usando um ensaio colorimétrico para fosfato livre. Como relatado anteriormente¹⁵, a atividade GTPase de FtsZ aumentou com o aumento da concentração de KCl: dependendo do tampão usado FtsZ_Bs. mostrou um aumento de 3-7 vezes, e FtsZ_Ec mostrou um aumento de 1,5-2,5 vezes na atividade da GTPase em 300 mM KCl em comparação com 50 mM KCl. A atividade reduzida da GTPase a 50 mM KCl é devido ao agrupamento de filamentos FtsZ_Bs. A 50 mM KCl FtsZ_Ec teve uma atividade GTPase 3-6 vezes maior do que FtsZ Bs devido à desmontagem mais rápida dos_polímeros FtsZ_Ec. A diferença na atividade de hidrólise de GTP entre FtsZ_Bs e FtsZ_Ec foi reduzida a 300 mM KCl, possivelmente devido ao agrupamento reduzido de_filamentos FtsZ Bs (Figura 5).

Figura 1. Quantificação da polimerização de FtsZ por sedimentação. (A) 12 μM de FtsZ foi polimerizado na presença de 2 mM de GTP ou GDP em pH 7,5 (barras pretas), 6,8 (barras cinzas) ou 6,5 (barras brancas). A quantidade de proteína peletizada foi determinada por análise densitométrica de géis corados com Coomassie. O GDP serviu como controle para uma sedimentação específica e a porcentagem de FtsZ sedimentada com GDP foi subtraída da porcentagem de FtsZ sedimentada com GTP para obter os valores plotados no gráfico. À esquerda: FtsZ sedimentado a 50 mM KCl, à direita: FtsZ sedimentado a 300 mM KCl. (B) Resultados representativos de géis corados com Coomassie. Polimerização de FtsZ_Bs (gel superior) e FtsZ_Ec (gel inferior) a 50 mM KCl. (S) sobrenadante, (P) frações de pellets do experimento. Clique aqui para ver a imagem ampliada.

Figura 2. Sedimentação dos túbulos SepF/FtsZ em baixa velocidade. (A) 12 μM FtsZ_Bs foi polimerizado com 2 mM GDP (barras brancas) ou GTP (barras pretas). A quantidade de proteína peletizada foi determinada por análise densitométrica de géis corados com Coomassie. Os sinais + e - sob o eixo x indicam a presença ou ausência de FtsZ e SepF na reação. (B) Resultados representativos de um gel corado de Coomassie. Polimerização de FtsZ_Bs na presença e ausência de SepF. Como controle, foi utilizado SepF sem FtsZ. A polimerização foi realizada com GTP e GDP. (S) sobrenadante, (P) frações de pellets do experimento. Clique aqui para ver a imagem ampliada.

Figura 3. Espalhamento de luz de 12 μM FtsZ_Ec e 12 μM FtsZ_Bs. Os FtsZs foram montados na presença de GTP 2 mM e a polimerização foi monitorada por espalhamento de luz em ângulo de 90°. Polimerização de FtsZ_Bs (A) e FtsZ_Ec (B) a 50 mM KCl a pH 7,5, pH 6,8, pH 6,5. Polimerização de FtsZ_Bs (C) e FtsZ_Ec (D) a 300 mM KCl em pH 7,5, pH 6,8 e pH 6,5. Clique aqui para ver a imagem ampliada.

Figura 4. Estruturas de_polímeros FtsZ Bs e FtsZ_Ec visualizadas por microscopia eletrônica. (A-L) Imagens de 12 μM FtsZ_Bs (A-C e G-I) e FtsZ_Ec (D-F) e (J-L) polimerizadas com 2 mM GTP. (AC) FtsZ_Bs em tampão com 50 mM KCl e pH 7,5, 6,8 e 6,5, respectivamente. (D-F) FtsZ_Ec em tampão com 50 mM KCl e pH 7,5, 6,8 e 6,5, respectivamente. (G-I) FtsZ_Bs em tampão com 300 mM KCl e pH 7,5, 6,8 e 6,5, respectivamente. (JL) FtsZ_Ec em tampão com 300 mM KCl e pH 7,5, 6,8 e 6,5, respectivamente. Barra de escala: 100 nm. Clique aqui para ver a imagem ampliada.

Figura 5. Hidrólise de GTP durante a polimerização de FtsZ em 6 tampões diferentes. Em todos os experimentos foi utilizado GTP 2 mM. Como amostra controle sem MgCl_{foi utilizado 2}. A atividade de FtsZ sem MgCl₂ foi subtraída da atividade de FtsZ na presença de MgCl₂. À esquerda: atividade GTPase de FtsZ a 50 mM KCl, à direita: atividade GTPase de FtsZ a 300 mM KCl. Clique aqui para ver a imagem ampliada.

Discussão

Descrevemos um conjunto de métodos que permite uma análise rápida da atividade de FtsZ e sua interação com outras proteínas. Ensaios de espalhamento de luz, sedimentação e GTPase, bem como microscopia eletrônica, têm sido amplamente utilizados para estudar a polimerização de FtsZ. Fizemos algumas melhorias nos protocolos existentes, mostramos a influência de diferentes condições na montagem do FtsZ e propomos controles que devem ser incluídos nos estudos do FtsZ.

Introduzimos centrifugação de baixa velocidade para distinguir grandes estruturas formadas pela associação entre FtsZ e suas proteínas de interação de polímeros FtsZ. Este método mostra duas vantagens sobre o ensaio de sedimentação padrão. Primeiro, nenhum fundo é formado pelos polímeros FtsZ na fração do pellet, pois eles não são girados a 24.600 x g. Em segundo lugar, a quantidade de FtsZ presente na estrutura formada com uma proteína que interage pode ser calculada a partir do gel. Duas etapas críticas neste método são o tempo de incubação e a concentração de GTP. É importante centrifugar a grande estrutura da proteína quando ela estiver completa, mas antes que ela se desmonte quando todo o GTP for hidrolisado. O melhor controle para este estudo é a polimerização de FtsZ com GDP. Há uma limitação potencial do ensaio. FtsZ forma um complexo estável com SepF, que pode ser facilmente girado a 24.600 x g. Se for realizada a sedimentação com outro ativador ou um fármaco que agrupa polímeros FtsZ, pode ser necessário adaptar o ensaio. Isso pode ser feito alterando o tempo de incubação ou aumentando a velocidade de centrifugação.

A preparação adequada da amostra é a mais importante para experimentos de espalhamento de luz. As proteínas devem ser pré-eliminadas por centrifugação e todos os tampões devem ser filtrados antes do uso. Se algum agregado estiver presente na amostra, ele interromperá um sinal estável obtido dos polímeros FtsZ. Para a análise das estruturas FtsZ por microscopia eletrônica, a preparação de uma grade é a etapa principal. O tempo de incubação da amostra na grade terá o efeito de produzir polímeros mais ou menos compactados. Para feixes de FtsZ_Bs, o tempo de incubação deve ser menor do que para FtsZ_Ec e FtsZ_Bs em alta concentração de KCl. Usamos uma concentração de 12 μM para cada amostra para poder comparar os resultados. No entanto, para FtsZ_Bs a 50 mM KCl, uma concentração mais baixa de FtsZ deve ser usada, pois 12 μM resultou em uma saturação total da grade. Isso torna os polímeros altamente compactados e difíceis de detectar. Polímeros menos compactados são melhores para detectar no EM.

O ensaio GTPase é o único experimento usado para estudar a atividade em vez das estruturas de FtsZ. Mg²⁺ é necessário para a renovação de GTP em polímeros FtsZ. Assim, na ausência de Mg²⁺, FtsZ não hidrolisa GTP. Portanto, uma amostra sem Mg²⁺ é o controle correto neste ensaio, mas cátions de Mg estão presentes no tampão de armazenamento FtsZ. Podem ser removidos por adição de 1 mM de EDTA à amostra de controlo. A etapa crítica neste ensaio é o tempo de incubação. É importante interromper a atividade do FtsZ após um determinado tempo. Isso é obtido transferindo a amostra FtsZ para uma solução verde de malaquita em uma placa de 96 poços. No entanto, o desenvolvimento da cor verde malaquita é um processo contínuo. Assim, as medições devem ser feitas ao mesmo tempo para cada amostra. Usando um protocolo de adição de GTP bem planejado com medições feitas a cada 30 segundos de intervalo em uma ordem estabelecida, é possível obter o mesmo tempo de incubação e manuseio de amostras para cada ponto de tempo. Outra etapa crítica é escolher a concentração da proteína para o experimento. No experimento foram utilizadas duas concentrações diferentes para FtsZ_Ec e FtsZ_Bs. A hidrólise do GTP é muito mais rápida para FtsZ_Ec em comparação com FtsZ_Bs. A atividade GTPase de FtsZ_Ec sob condições escolhidas e a 12 μM é linear apenas por no máximo 5 min e após esse tempo a taxa de hidrólise se estabiliza. Assim, é difícil interpretar os dados do experimento quando realizado nessas condições. Neste caso, o FtsZEc deve ser usado em concentração mais baixa do que o FtsZ_Bs para poder comparar as atividades de ambas as proteínas. A atividade GTPase de FtsZs de diferentes fontes pode variar. Assim, a concentração certa deve ser escolhida. A concentração para polimerização FtsZ deve estar bem acima da concentração crítica (em geral de 2,5-10 μM). A dinâmica de montagem e desmontagem do FtsZ também é importante. Algumas proteínas mostram um atraso significativo na polimerização após a adição de GTP, como mostrado para FtsZBs a 50 mM KCl. É útil realizar o ensaio de espalhamento de luz antes do ensaio GTPase para aproximar o tempo de montagem e desmontagem dos polímeros FtsZ. Depois disso, o tempo de incubação e concentração de proteína podem ser escolhidos. Como as condições escolhidas para a polimerização de FtsZ são cruciais, é importante usar o pH correto e a concentração de KCl em cada método. Neste trabalho estudamos 9 tampões diferentes com pH variando de 6,5-7,5 e concentrações de KCl de 0 M a 300 mM. Observamos que a melhor condição para analisar FtsZs de B. subtilis e E.coli e sua atividade biológica é em pH próximo ao nível fisiológico (7,5) juntamente com uma alta concentração de KCl. Em uma alta concentração de KCl, o FtsZ tem uma atividade GTPase mais alta e produz polímeros que são mais detectáveis por microscopia eletrônica. Também confirmamos que o pH fisiológico e uma alta concentração de KCl são melhores para o estudo da interação entre FtsZ e proteínas reguladoras do que quaisquer outros tampões usados principalmente para estudar a montagem de FtsZ. FtsZBs mostra uma atividade semelhante a FtsZEc quando estudado em alta concentração de KCl. Além disso, em baixa concentração de sal, a influência do pH é mais visível do que nos tampões com alta concentração de sal. FtsZ às vezes precipita ao usar tampões sem KCl, como resultado, tampões sem sal devem ser evitados. A sedimentação de polímeros FtsZ é baixa quando se usa tampões com altas concentrações de KCl. Isso pode ser uma vantagem ao estudar as interações entre FtsZ e proteínas que montam filamentos de FtsZ, como SepF e ZapA, pois essas estruturas de ordem superior são fáceis de detectar com centrifugação. Em todos os nossos experimentos, usamos MgCl₂ em uma concentração de 10 mM. Foi demonstrado que uma concentração relativamente alta de Mg²⁺ estabiliza os polímeros de FtsZ e reduz a atividade de GTPase de FtsZ. Na Tabela 2 , os resultados de vários estudos são resumidos descrevendo a polimerização de FtsZ e a atividade da GTPase em diferentes concentrações de Mg²⁺ usando condições tampão idênticas ²⁷. A concentração medida de Mg 2⁺ citoplasmático livre é de 0,9 mM³. Deve-se notar que o GTP quelará uma quantidade equivalente de Mg²⁺. Assim, a concentração ideal de Mg²⁺ para experimentos de GTPase é de cerca de 2-2,5 mM, que está próxima do nível fisiológico³. No entanto, em nossos experimentos, usamos MgCl₂ em uma concentração de 10 mM para obter um sinal de espalhamento de luz facilmente detectável e estabilizar polímeros FtsZ durante o ensaio de sedimentação.

Embora tenhamos aplicado nossos protocolos ao FtsZ dos organismos modelo E. coli e B. subtilis, eles podem ser adaptados ao FtsZ de qualquer outro organismo. Deve-se notar que o pH fisiológico e as concentrações de cátions monovalentes e divalentes diferem entre os organismos. Assim, as condições ideais para a polimerização de FtsZ podem variar. Diferenças no tempo de duplicação e nas condições de crescimento de diferentes bactérias podem resultar em diferentes cinéticas de montagem de FtsZ e condições ótimas dos experimentos. No entanto, nosso protocolo fornece um bom ponto de partida para os experimentos com FtsZs de outros organismos. Os protocolos devem ser úteis para o estudo de FtsZ com proteínas reguladoras ou para o estudo dos efeitos de pequenos compostos e fármacos sobre FtsZ.

Fonte	Polimerização [% de FtsZ sedimentado]	GTPase [Pi/FtsZ/min]	Concentraçãode Mg 2+ [mM]	Concentração de FtsZ [μM]	Referências
FtsZEc	~ 28%	~ 2,1	10	12	Este trabalho
	~ 50%	~ 2,4	10	12.5	27
	~ 43%	~ 3,5	5	12.5	27
	~ 27%	~ 4,6	2.5	12.5	27
	ND	~ 5,4	2.5	5	26
FtsZBs	~ 30%	~ 0,8		12	Este trabalho
	~ 52% (com DEAE dextrano)	~ 0,5	10	10	11
	ND	~ 2,25	2.5	5	26

Tabela 2. Efeito sobre Mg²⁺ na polimerização de FtsZ e GTPase. Resultados deste trabalho comparados com dados publicados. Todos os experimentos foram realizados em 50 mM MES/NaOH, pH=6,5, 50 mM KCl.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
GTP	Roche 10106399001		Parte 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
Tubos de policarbonato de parede espessa	Beckman Coulter	343776	Parte 2
Ultracentrífuga Optima MAX-XP	Beckman Coulter	393315	Parte 2, 3
Tubo de polialômero com tampa de encaixe	Beckman Coulter	357448	Parte 3
AIDA Bio-package, 1D, 2D, FL	Raytest Isotopenmessgerä te GmbH	15000001	Parte 4
Analisador de Imagem de Luminescência LAS-4000	Fujifilm		Parte 4
Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Espectrômetro de Luminescência	Spectronic Instruments		Parte 5
Célula de Fluorescência	Hellma Analytics	105-250-15-40	Parte 5
Quadrado 400 Mesh, Cobre, 100/frasco	Microscopia Eletrônica Ciências	G400-	Parte 6
Microscópio eletrônico CM120 operando a 120 kV	Philips		Parte 6
96 ml x 0,2 ml Placa	BIOplastics	B70501	Parte 7
Kit de ensaio de fosfato verde malaquita	de ensaio	POMG-25H	Parte 7
Espectrofotômetro de microplacas PowerWave HT	BioTek		Parte 7