Um modelo murino de hemorragia subaracnóide

Resumo

Um modelo de rato padronizado de hemorragia subaracnóide por Círculo intraluminal de Willis perfuração é descrito. Perfuração de vasos e hemorragia subaracnóide são monitorados pela monitorização da pressão intracraniana. Além disso os vários parâmetros vitais são registadas e controlada para manter as condições fisiológicas.

Resumo

Nesta publicação de vídeo de um modelo padronizado rato de hemorragia subaracnóide (HSA) é apresentado. Sangramento é induzida pelo Círculo endovascular de Willis perfuração (CWP) e comprovada por pressão intracraniana (PIC) de monitoramento. Assim, uma distribuição homogênea de sangue em espaços subaracnóide em torno da circulação arterial e fissuras do cerebelo é alcançado. Fisiologia animal é mantido por entubação, ventilação mecânica, monitorização contínua e on-line de vários parâmetros fisiológicos e cardiovasculares: temperatura corporal, pressão arterial sistêmica, freqüência cardíaca e saturação de hemoglobina. Deste modo, a pressão de perfusão cerebral pode ser firmemente monitorado resultando em um volume variável de menos de sangue extravasado. Isto permite uma melhor padronização de perfuração filamento endovascular em ratos e faz todo o modelo altamente reprodutível. Assim, é facilmente disponível para os estudos farmacológicos e fisiopatológicos no tipo selvagem e genéticaly alterada ratinhos.

Introdução

HAS é o subtipo tempos com o resultado menos benéfica para os pacientes: 40% dos pacientes morrem dentro de um mês após o sangramento ¹ e sobreviventes raramente têm um resultado clinicamente favorável.

A grande maioria da SAHOS espontâneas (80%) são causados ​​pela ruptura de aneurismas intracranianos, que são na sua maioria localizadas ao longo da anterior e posterior da artéria, a artéria basilar, artéria cerebral média (MCA) ² comunicando.

Tais aneurismas são difíceis de modelar em animais e, portanto, os modelos animais de SAH são realizadas quer por injecção do sangue para dentro do espaço / ventrículos cerebrais subaracnoideos ou por perfuração de um navio de endovascular subaracnóide.

Injeção de sangue autólogo na cisterna magna é de fácil execução e reprodutível, como o volume de sangue pode ser controlada diretamente ^3. Infelizmente, alguns aspectos da fisiopatologia da HAS, por exemplo, olesão do vaso, não pode ser modelado por este procedimento. Outra abordagem técnica para indução de HAS é a abertura de uma veia intracisternal ^4.

No entanto, o CWP intraluminal no ramo MCA parece ser o processo de que os modelos da fisiopatologia em seres humanos mais estreita ^5. O método foi desenvolvido e descrito pela primeira vez em ratos por Bederson e colegas, e ao mesmo tempo por Veelken e colegas ^6,7. Mais tarde, o modelo da perfuração intraluminal foi adaptado para ratinhos ^8,9. Um filamento é introduzido na artéria carótida externa (ECA) e avançada até à base do crânio, através da artéria carótida interna (ICA). No ponto de ramificação do MCA filamento perfura o vaso e induz a uma hemorragia no espaço subaracnóide da base do crânio. O sangue, em seguida, distribui para o espaço subaracnóide restante ao longo de fissuras e vasos sanguíneos. A hemorragia é parada pela formação de coágulos no local da perfuração, mas rebleedings, which são muitas vezes prejudiciais em pacientes ^{de 10,} pode ocorrer. Por conseguinte, o modelo de filamentos endovascular se tornou um modelo amplamente usado HAS durante os últimos anos. A desvantagem mais citada do modelo filamento perfuração é que o volume de sangramento não pode ser diretamente controlado e pode, portanto, ser variável. Esta variabilidade pode ser significativamente reduzido por um rígido controle de fisiologia animal e pós-hemorrágica ICP.

Os ratos têm a grande vantagem de que um grande número de estirpes geneticamente modificados estão disponíveis. No entanto, devido ao seu pequeno tamanho procedimentos cirúrgicos tendem a ser mais complexo do que em espécies maiores, por exemplo, ratos ou coelhos. Portanto, a redução de escala de técnicas desenvolvidas para os ratos para os ratos costumam não leva aos resultados desejados, por exemplo, como os ratos têm um peso corporal e volume de sangue muito limitadas técnicas não invasivas para a pressão arterial e análise de gases sanguíneos, bem como para a saturação de hemoglobina e monitoramento da freqüência cardíacatem que ser aplicada sempre que possível. Por conseguinte, o objectivo da publicação é descrever o modelo da perfuração de filamentos para HSA em ratinhos e para demonstrar como este modelo pode ser realizado de uma forma padronizada e altamente reprodutível.

Protocolo

Todos os procedimentos cirúrgicos foram submetidos à revisão ética e aprovado pelo governo da Alta Baviera (número de referência: 55.2-1-54-2532.3-13-13 e -2532-136-11). Os animais são macho C57BL / 6 com um peso corporal de aproximadamente 25 g.

1. Preparação animal

1. Induzir a anestesia, colocando o mouse em uma câmara. Lave a câmara com 5% de isoflurano até que o animal perde a consciência.
2. Injectar anestésicos pré-misturados por via intraperitoneal: o fentanil (0,05 mg / kg), o midazolam (5 mg / kg) e medetomidina (0,5 mg / kg). Verifique reflexos antes e regularmente durante o procedimento. Reinject um terço do volume inicial por hora para manter a anestesia.
3. Entubar orotracheally com um tubo feito a partir de um cateter venoso 20 L ^11. Para intubação fixar o animal em uma plataforma inclinada (30 °), retrair a língua com uma pinça dobrados, visualizar as cordas vocais sob um microscópio de operação e inserir o tubo na traquéiadurante a inspiração.
4. Posicione o mouse em uma posição propensa e verificar o correto posicionamento do tubo com um pedaço de algodão ou um microcapnograph.
5. Ligue o tubo de intubação com o respirador. Ventile o mouse com ar ambiente suplementado com 25% de oxigênio com uma frequência de 180-220 ciclos / min e um volume de ejeção de 200-250 mL.
6. Ligue o tubo de intubação com a microcapnograph. Manter o final da expiração de pCO ₂ a 30 mmHg, ajustando a frequência de ventilação.
7. Insira uma sonda de temperatura rectal e colocar o animal numa almofada de aquecimento, a fim de manter a 37 ° C de temperatura corporal central.
8. Aplicar o sensor Pulsoximeter anelar na pata traseira direita.
9. Abra a pele acima do crânio com um par de tesouras. A incisão deve ser de aproximadamente 0,5 cm de comprimento e entre olhos e ouvidos.
10. Dissecar o músculo temporal esquerdo com um bisturi do osso temporal.
11. Cole o fluxômetro laser Doppler (LDF) da sonda emo osso temporal esquerdo. Segurar a sonda numa posição fixa até que a cola endurece.
12. Faça um furo de aproximadamente 1,5 mm de diâmetro com uma broca de dentista dentro do osso temporal esquerdo. Arrefecer o osso com uma solução salina para evitar danos causados ​​pelo calor.
13. Insira a sonda de ICP na cavidade craniana. Empurrar para a frente como dorsalmente quanto possível para impedir danos no tecido cerebral e hemorragia.
14. Se a sonda estiver na posição certa, corrigir e selá-lo com cimento. Deixe secar cimento por 5 min.
15. Vire o mouse com cuidado para a posição supina.
16. Para monitorização contínua da pressão arterial, cateterização da artéria femoral esquerda.
17. Conectar o cateter femoral para o dispositivo de monitorização da pressão arterial.

2. SAH Indução

1. Abra a pele com um par de tesouras de esterno de queixo (2 cm). Dissecar o tecido conjuntivo sem rodeios e empurre as glândulas salivares de lado.
2. Exponha a artéria carótida comum esquerda (CCA) e mobilizá-la. Preserve onervo vago, que corre na mesma bainha do tecido conjuntivo, como o CCA. Mova craniana e expor e mobilizar a ICA ea ECA usando a mesma técnica.
3. Ligadura do ECA, tanto cranial possível.
4. Prearrange mais duas ligaduras para o filamento ao redor do ECA.
5. Ocluir o CCA ea ICA temporariamente com microclips. Posicione os microclips com um aplicador microclipe. Certifique-se que os grampos são aplicados corretamente, puxando-os para trás.
6. Corte um buraco para a inserção de filamento no ECA com uma tesoura dos vasos.
7. Insira um filamento Prolene 5-0 com 12 mm de comprimento no ECA.
8. Feche o local de inserção com uma ligadura premeditado.
9. Retire os microclips com um aplicador microclipe do CCA e da ACI.
10. Avançar o filamento com uma pinça para o ICA até o ICP sobe. Um aumento repentino do ICP indica indução sangramento.
11. Retire o filamento imediatamente e ligadura do ECA, fechando tanto prligaduras earranged consecutivamente. Isso evita que o sangramento fora do local de inserção.
12. Suturar o ferimento da pele.
13. Monitorar os parâmetros fisiológicos do animal por mais 20 min.
14. Remover ICP e sondas FDL e suturar o ferimento da pele.

3. Fim da Experiência

1. Perfundir o animal transcardíaca com 20 ml de solução salina (temperatura ambiente), seguido de 20 ml de 4% de PFA em PBS (4 ° C).
2. Dissecar o cérebro fora do crânio. Cortar o crânio, na linha média e entre as cavidades orbitais. Em seguida, descascar o osso a partir do cérebro.
3. Avaliar a distribuição de sangue no espaço subaracnóide.

4. Considerações Em caso de cirurgia de sobrevivência (não mostrado no vídeo)

1. Injetar carprofeno (4 mg / kg por via subcutânea) para analgesia pós-operatória imediatamente após a indução da anestesia. Durante o período de observação pós-operatória carprofeno (4 mg / kg por via subcutânea) é injectada a cada 24 horas.
2. Em vez de medição de pressão arterial invasiva fazer uso de um sistema de monitoramento de pressão arterial não invasiva.
3. Para a interrupção da anestesia injectar agentes antagonizar subcutaneamente: naloxona (1,2 mg / kg), flumazenil (0,5 mg / kg) e atipamezol (2,5 mg / kg).
4. Extubar o animal.
5. Depois de recuperar de reflexos colocar o animal em uma câmara de pré-aquecido. Manter o animal em cerca de 32 ° C durante 24 hr.
6. Os animais são verificados regularmente para a respiração espontânea e seu estado geral durante as primeiras horas após a cirurgia. Se o tronco cerebral é afectada animais têm problemas respiratórios e deve ser sacrificados.
7. Os animais são controlados diariamente para a sua condição geral e do peso corporal, assim como para os défices neurológicos e sensoriais ^15.

Resultados

Mortalidade

Uma vez que a técnica de cirurgia é dominado o procedimento não provocou quaisquer mortalidade intra-operatória. Além disso o sangramento pode ser conseguida em quase todos os animais. Mortalidade pós-operatória é de 30-40%, com a maior parte dos animais morrer no dia 1 após a cirurgia (Figura 5).

ICP valores após SAH

O ICP antes de sangramento é de cerca de 4 mmHg. Sangramento resulta em um aumento acentuado do...

Discussão

As opções de tratamento após SAH são escassos e pouco ineficaz. Portanto, a fisiopatologia da lesão cerebral pós-hemorrágica precisa ser mais bem compreendidos, a fim de identificar novos alvos terapêuticos e desenvolver novas abordagens terapêuticas. Padronizado e modelos animais bem reprodutíveis em animais geneticamente modificados, ou seja, ratos, são cruciais para tais investigações. O modelo CWP tornou-se um modelo amplamente utilizado para a HAS, uma vez que se assemelha a fisiopatologia em seres humanos...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipment
operation microscópio	Leica	KL2500
vaporizador de isoflurano	Harvard Instruments	vaporizador
	Hugo Sachs	Minivent 845
microcapnógrafo	Hugo Sachs	Tipo 340
controlador de temperatura	FHC	DC Controlador
broca odontológica	Paggen	Labset- N
Monitor ICP	Monitor Codman	ICP monitor
de pressão arterial	AD Instruments	Bridge Amp FE221
bomba de seringa	World Precision Instruments	SP101IZ
pulsoxímetro	Kent Scientific	MouseSTAT
LDF		Perimed Periflux 5000
	AD Instruments	Power Lab 16/35
Material
cimento para fixação de sonda ICP	cimento		Speiko
para fixação de sonda LDF	Bob Smith Industries	(Maxi Cure e Insta Set)
cateter venoso	Johnson Johnson	Jelco cateter intravenoso alado; REF 4076	tubo de intubação modificado
para cateter femoral	Smiths Medical	Fine Bore Polythene Tubing; ID 0,28 mm OD 0,61 mm; REF 800/100/100	filamento de 30 cm de comprimento
para perfuração de vaso	Ethicon	Prolene 5-0	corte de 12 mm
de comprimento equipamento cirúrgico	Fine Scientific Instruments	fórceps médico #5, tesoura de vaso 8 cm, microclip mandíbula

respirador de de fluxo contínuode Temperatura Monitor de dados analógico Cola de carboxilato Cola de cianoacrilato de 4 mm