Summary
Hareketsiz uydu hücrelerin saf nüfusun izolasyonu ve kültürü, kas kök hücre topluluğu, kas kök hücre biyolojisi ve rejenerasyon, hem de kas distrofisi ve diğer dejeneratif hastalıklarda tedavileri için kök hücre nakli anlaşılması için gereklidir.
Abstract
Kas uydu hücreleri kas lifleri sublaminal çekirdekleri% 2-5 için muhasebe, doğum sonrası iskelet kas gelişimi ve yenilenmesi için gerekli bir kök hücre nüfus vardır. Yetişkin kas olarak, uydu hücreleri, normal olarak sakin mitotikal olarak bulunmaktadır. Yaralanma sonrasında, ancak, kas uydu hücreleri, rejenerasyonunu aracılık etmek miyoblastları kendi yavrularıyla üretmek için hücre çoğalmasını başlatabilir. Uydu hücresinden türetilmiş miyoblastların nakli yaygın müsküler distrofi, kalp yetmezliği, ve ürolojik işlev bozukluğu dahil olmak üzere birçok reaktif hastalıklar için olası bir tedavisi olarak incelenmiştir. Distrofik iskelet kası, enfarkte kalp ve disfonksiyonu idrar kanallarına Miyoblast nakli engrafted miyoblastlardır, ev sahibi dokulardaki kas lifleri farklılaşmak ve bu hastalıklarda kısmen fonksiyonel iyileşme görüntüleyebilir göstermiştir. Bu nedenle, iskelet muscl ikinci hareketsiz uydu hücrelerin verimli saflaştırma yöntemlerinin geliştirilmesie yanı sıra uydu hücre kaynaklı myoblast kültürler ve miyoblastların için nakli yöntemlerinin kurulması gibi, uydu hücre kendini yenileme, aktivasyonu ve farklılaşması arkasında moleküler mekanizmalarını anlamak için gereklidir. Buna ek olarak, kas distrofisi ve diğer hastalıklar için rejeneratif hücre bazlı terapiler geliştirilmesi, aynı zamanda, bu faktörlere bağlıdır.
Ancak, sakin uydu hücrelerin prospektif saflaştırma yöntemleri pahalı floresan-aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) makinalarının kullanımını gerektirir. Burada, (MACS) manyetik ayırma ile aktive edilmiş hücre ardından enzimsel aynşma ile yetişkin fare iskelet kasından hareketsiz uydu hücreleri, hızlı, ekonomik ve güvenilir bir saflaştırma için yeni bir yöntem sunulmaktadır. Saf hareketsiz uydu hücrelerin izolasyonundan sonra, bu hücreler, birkaç geçiş sonrasında miyoblastların sayıda elde edilmesi için kültürlenebilir. Bu taze izole edilmişsakin uydu hücreleri veya ex vivo genişletilmiş miyoblastlardır kalbi etkileyen naklediliyor olabilir (CTX) kas lifleri rejenere için donör kaynaklı hücrelerin katkısını incelemek için fare iskelet kas yenileyici kaynaklı, hem de kendini yenileme incelenmesi için uydu hücre bölmelerine faaliyetleri.
Introduction
Kas uydu hücreleri iskelet kas liflerinin bazal lamina altında bulunan miyojen kök hücrelerin küçük bir nüfus vardır. Bunlar Pax7, Pax3, c-Met, M-kaderin, CD34, sindekan-3 ekspresyonu ile karakterize edilir ve kalsitonin 1 - 3. Uydu kas hücreleri, kök hücreleri gibi kas rejenerasyon sorumlu olduğu kanıtlanmıştır. Erişkin kas, uydu hücreler normalde 4-8 mitotikal durgundur. Yaralanma sonrasında, uydu hücreleri MyoD ekspresyonunu başlatmak ve bunların döl genişletmek için hücre döngüsüne girmelerini, aktive edilir, miyojenik öncü hücreleri veya miyoblastları 3 olarak adlandırılır. Hücre bölünmesinin birkaç tur sonra miyoblastlardır olgun kas lifleri ve ardından çok çekirdekli miyotüplerinin içine farklılaşmasını geçmesi amacıyla birbirine hücre döngüsü ve sigorta çıkar. Erişkin kas izole miyoblastlardır kolayca ex vivo genişletilebilir. Kas yenileyici ve kas lifleri olmak miyoblastların için kapasitenonmuscle dokularda form ektopik kas lifleri myoblast nakli, Duchenne müsküler distrofi (DMD) 4 için potansiyel bir tedavi yaklaşımı, ürolojik disfonksiyon 9, ve kalp yetmezliği 10 tarafından istismar edilmektedir. Nitekim, miyoblastlardır başarıyla hem mdx (DMD modeli) fareler ve DMD hastalarında 11-14 kas nakil edilmiştir. Enjekte Normal miyoblastlardır hastalıklı kas histoloji ve işlevini geliştirmek için konak kas lifleri ile sigorta. Önceki iş miyoblastların subpopülasyonunun fazla hücre-benzeri kök ve kas rejenerasyon 5 sırasında kas uzun bir farklılaşmamış durumda kalır olduğunu göstermiştir. Son çalışmalar, yetişkin kas uydu hücreleri, taze izole edilmiş kas 5-8 rejenere daha verimli uyumunu ve kendini yenileme aktivite sergileyen bir kök hücre benzeri popülasyonu içeren göstermiştir. Bu nedenle, yetişkin iskelet mu ikinci hareketsiz uydu hücrelerin saf nüfus saflaştırılmasıSCLE uydu hücreleri, kas iskelet hücreleri ve yenilenme biyolojisi anlamak için ve hücre bazlı terapiler geliştirilmesi için önemlidir.
Ancak, sakin uydu hücrelerin prospektif saflaştırma yöntemleri pahalı bir floresan-aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) makine 1,2,6-8 kullanılmasını gerektirir. Buna ek olarak, lazer FACS maruz hareketsiz uydu hücrelerin 15 daha düşük verim neden ayrılması sırasında, hücre ölümüne neden olma eğilimindedir. Burada, yetişkin fare iskelet kasından hareketsiz uydu hücreleri, hızlı, ekonomik ve güvenilir bir saflaştırma için yeni bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntem, (MACS) manyetik ayırma ile aktive edilmiş hücre ardından enzimatik ayrışma kullanır. Saf hareketsiz uydu hücrelerin izolasyonundan sonra, bu hücreler, birkaç geçiş sonrasında miyoblastların sayıda elde edilmesi için kültürlenebilir. Ayrıca göstermektedir ki bu yeni izole edilmiş hareketsiz uydu hücrelerin ya da eski vi intramüsküler enjeksiyonuvo genişletilmiş miyoblastlardır kalbi etkileyen naklediliyor olabilir (CTX) kas lifleri yanı sıra, kendini yenileme faaliyetlerinin incelenmesi için uydu hücre bölmelerine yenileyici için donör kaynaklı hücrelerin katkısını incelemek için fare iskelet kas yenileyici kaynaklı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanlar, bir SPF ortamında barındırıldı ve Research Animal Resources Minnesota Üniversitesi (RAR) ile izlendi. . Animals (Avertin (250 mg / kg) IP enjeksiyonu ile anestezi sonra CO2 inhalasyon veya püskürtme KCl uygun araçlar ile kurban edilmiştir tüm protokoller, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC, kod numarası tarafından onaylanmıştır: 1304-30492 ) Minnesota Üniversitesi.
Fare İskelet Kası Mononükleer Hücreleri 1. İzolasyon
- Düzgün 1 ya da 2 genç erişkin fareler (3-8 hafta) kurban.
- Çimdik ve keskin bir makas ile karın cildi yarık. Tamamen (yön karşı cildi çekin) triseps ve arka bacak kas göstermek için deri soyulabilir.
- Makasla kemiklerinden tüm bacak iskelet kasları (tibialis anterior, gastrokinemius ve kuadriseps) ve triseps çıkarın. Daha sonra, 10 cm plaka içinde buz soğukluğunda steril PBS'ye transferi kasları.
- Yeni bir steril 6 cm plaka PBS kasları ve transfer kasları kan yıkayın: 1 tabak 1-2 fareler için.
- Bir diseksiyon mikroskobu altında bağ dokusu, kan damarları, sinir demetleri ve adipogenic doku çıkarın.
- (Şekil 1A ve 1B) kesilmiş ve pürüzsüz bir hamur haline doku kıyma, Oftalmoloji için makas kullanma. Bu enzim solüsyonu ile kolayca aşağı kırık olmayacak gibi büyük parçaları bırakmamaya çalışın.
- Bir Falcon 50 ml tüp içine kıyılmış kas transferi, ve kolajenaz çözeltisi (% 0.2 'lik kolajenaz Tip DMEM içerisinde 2,% 10 FBS) 5 ml. 60 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
- Öğütün (yukarı ve aşağı 18 G iğne ile) karışımı (Şekil 1C) homojenize etmek. Daha sonra 15 dakika daha 37 ° C'de inkübe karışımı.
- Tek bir hücre süspansiyonu içine ayırmak için karışımın homojenize edilmesi tekrar toz haline getirin. Kadar olan tek bir hücre süspansiyonu içine 50 ml DMEM içinde% 2 FBS ilave et ve karıştıriyi.
- Falcon 50 ml'lik bir tüp (Şekil 1D) üzerine bir hücre süzgeç (70 mikron) yerleştirin. Bir hücre süzgeç üzerine ayrışmış hücreleri içeren süpernatant aktarın ve geçer kadar aşağı ve filtre üzerinde hücre süspansiyonu pipetle.
- Hemositometreyle hücre sayısını sayın. 5 dakika boyunca 4 ° C'de 2,000 rpm'de santrifüj tüpleri; aspirat ve süpernatant atın.
- DMEM içinde 10 ml% 2 FBS ile yeniden süspanse edin. 5 dakika boyunca 4 ° C'de 2,000 rpm'de santrifüj tüpleri; aspirat ve süpernatant atın.
- 200 DMEM içinde% 2 FBS ul ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine transferi hücre süspansiyonu ile yeniden süspanse edin. Genellikle, yaklaşık 2 x 10 6 hücre 1 fare kaslardan hasat edilmelidir. Hücreler, DMEM içinde% 2 FBS 100 ul içinde 1 x 10 6 hücre bir konsantrasyona seyreltilmiş olacaktır.
2.. Antikor Boyama ve MACS ile Ayırma
Aşağıdaki pr sırasındaocedures, steril tamponlar kullanılarak steril koşullarda muhafaza. Antikorların her biri hacmi eklenmiş ve hücre süspansiyon ortamı 1 fare, tüm kas hücreleri için hesaplanır. Hücreler 2 ya da daha fazla fareden hasat edilir ise, reaktifler miktarının optimize edilmelidir.
- 1 ul CD31-PE, CD45-PE, Sca-1-PE ve hücre süspansiyonu 200 ul içine İntegrin α7 antikorun her ekleyin. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
- Hücreleri yıkayın: kuluçkalamadan sonra, 1.5 ml bir tüp içinde bir hücre süspansiyonu içine DMEM içinde 1 ml% 2 FBS ekleyin ve 3 dakika boyunca 4 ° C'de 2,000 rpm'de santrifüj. Iki kez bu adımı tekrarlayın.
- Aspire ve süpernatant atın.
- 200 DMEM içinde% 2 FBS ul ve Anti-PE Manyetik boncuklar 10 ul ekle ile yeniden süspanse edin hücreleri. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
- Hücreleri yıkayın: kuluçkalamadan sonra, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde hücre süspansiyonu MACS tamponu 1 ml ekleyin ve daha sonra 3 dakika boyunca 4 ° C'de 2,000 rpm'de santrifüj. Bu adımı tw tekrarlayınbuz. Hücreleri manyetik sütun ayrılmış önce MACS tamponu ile yıkanmıştır gerektiğini not edin.
- Aspire ve süpernatant atın. MACS tamponu 1.0 ml hücreleri yeniden süspanse edin.
- Manyetik gemide LD sütun kurmak ve MACS tamponu (Şekil 1E) 2.0 ml sütun durulayın.
- LD kolonuna hücre süspansiyonu aktarın ve 1.5 ml tüp içine-akış fraksiyonu toplamak. Bu fraksiyon PE-negatif hücreleri içerir.
- 3 dakika, aspirat ve süpernatantı atmak için 4 ° C'de 2,000 rpm'de santrifüj.
- 200 DMEM içinde% 2 FBS ul ve anti-fare IgG Manyetik boncuklar 10 ul ekle ile yeniden süspanse edin hücreleri. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
- Hücreleri yıkayın: kuluçkalamadan sonra, 1.5 ml bir tüp içinde bir hücre süspansiyonu içine MACS tamponu 1 ml ekleyin ve daha sonra 3 dakika boyunca 4 ° C'de 2,000 rpm'de santrifüj. Aspire ve süpernatant atın. Iki kez bu adımı tekrarlayın. MACS tamponu 500 ul hücreleri tekrar.
- Manyetik gemide MS sütun kurmak ve MACS tamponu (Şekil 1F) 500 ul ile sütun durulayın.
- Aktarım MS kolona hücre çözümü süspansiyon haline getirildi ve akış boyunca fraksiyonu (İntegrin α7-negatif hücreleri) atın.
- MACS 1 ml tampon ile durulayın, ve iki kez bu adımı tekrarlayın.
- Duruladıktan sonra, ayırıcı manyetik alandan sütun kaldırmak. Kolona MACS tamponu içinde 1.0 ml uygulayın ve kolonun üstünden şırınga pistonu iterek bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine manyetik olarak etiketlenmiş hücrelerin (İntegrin α7-pozitif hücreleri) elute. 1.5 ml tüp içine flow-through toplayın. MACS tamponu, 1.5 ml ile elüsyon tekrarlayın ve akış yoluyla toplayın.
- 3 dakika, aspirat ve süpernatantı atmak için 4 ° C'de 2,000 rpm'de santrifüj.
- Miyoblast ortamı, 1 ml saflaştırılmış hücrelerin tekrar (% 20 FBS bFGF ile Hams F-10 içeren) ve Matrigel kaplı 10 cm plaka hücreleriMiyoblast Orta 8 ml (6 cm bir plaka içerisinde 5 mi) (Şekil 1G) ile plaka. 1-2 x 10 5 hücre potansiyel olarak 1 dokunulmamış fare kas izole edilebilir unutmayın.
3. Bakım
- Miyoblast ortamı ile her geçen gün hücreleri besleyin. Artan miyoblastların görünümü çekirdeklerinde MyoD (Şekil 2) ve Pax7 (veriler gösterilmemiştir) eksprese eden bir küçük ve yuvarlak şekle sahiptir.
- Hücre füzyon başlatırken iskelet hücreleri% 50 birleştiği önce ya da geçişli olmalıdır. Bir kez PBS ile yıkandıktan sonra, bir CO2 kuluçka makinesi içinde 3 dakika boyunca 37 ° C'de% 0.25 tripsin solüsyonu ile inkübe edilir ve hücreleri Miyoblast ortam maddesi ile ayrışmış hücreleri toplamak. Santrifüj hücreleri (5 dakika boyunca 1000 rpm) sonra, Miyoblast ortamı ile askıya ve yeni Matrigel kaplı plakalar üzerine hücreleri replate. Kollajen kaplanmış plakalar geçit 3 sonra kullanılabilir. Bir plaka, genellikle 3-5 plakalar halinde bölünebilir.
4. Yönünrentiation
- Her gün Farklılaşma Orta ile yeniden yükleme.
- Farklılaşma Ortamda 1. günde, miyoblastlardır hücre döngüsünden çıkmak ve miyozin ağır zincir (MHC)-pozitif miyositler içine farklılaşma tabi. Bu myoctyes çok çekirdekli miyotüplerinin oluşturmak için birbirleriyle hücre füzyon başlar. Tipik olarak, en miyoblastlardır MHC-pozitif farklılaştırıcı çekirdekli miyositler veya miyotüpleri Farklılaşma Orta günde 3-5 (Şekil 2) olur.
İskelet kas Rejenerasyon için Fare içine 5. Miyoblast Transplantasyon
- Intraperitonal (IP) enjeksiyon ile Avertin (250 mg / kg) ile fare anestezi uygulayın.
- Tibialis anterior (TA) kas üzerindeki deri saç etrafında tıraş. Yirmi dört saat miyoblast transplantasyonundan önce, 10 uM CTX (50 ul), kas içinden traş edilmiş derisine (Şekil yoluyla bir 31 G insülin şırınga ile kas yenilenmesini meydana Nod / Scid fare TA kas içine enjekte60, 3).
- Proliferatif miyoblastlardır% 0.25 tripsin solüsyonu ile ayrıştırılmış, ve 5 dakika boyunca 1000 rpm'de santrifüje tabi tutulur. Aspire ve süpernatant atın. DMEM içinde% 2 FBS ile yeniden süspanse edin, 50 ul 1 x 10 6 hücre. Bir 31 G insülin şırınga içine askıya hücreleri aktarın.
- Alıcı farenin IP enjeksiyonu ile Avertin (250 mg / kg) ile anestezi edilir, ve 1 x 10 6 miyoblastlardır (Şekil 2), kas içinden, kas TA yenileyici içine enjekte edilir.
- Histolojik analiz için hücre enjeksiyonu (Şekil 3) sonrasında 1-4 hafta hasat TA kas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Taze izole sakin uydu hücreler pasif uydu hücreler için kesin bir belirteç olarak küçük, yuvarlak bir şekil (Şekil 1G) ve ekspres Pax7 gösterilecek. Taze izole hücrelerin% 90'dan fazlası Pax7 (Şekil 1H ve 1I) ifade eder. En çok kirlenmiş miyoblast hücreleri verimli bir şekilde kültür koşulları aşağıdaki in vitro olarak büyümez kan hücreleri bulunmaktadır. Bu nedenle, uydu hücre türetilmiş miyoblastlardır kültüründe hakim. İsteğe bağlı olarak, biz izole uydu hücrelerin saflığı arttırmak için (2,11-2,14 adımlar) MS kolon saflaştırılması için adımları tekrarlayabilirsiniz. Bu durgun uydu hücreler miyojen öncü hücreleri veya miyoblastları geçmesi izolasyondan sonra 24 saat içinde hücre döngüsünü girecek. Hücre proliferasyon hızı azalır kadar bu hücreler, her 4 günde bir tripsinizasyon ile geçişli olabilir. Tipik olarak, bu hücreler, geçit 10 kadar muhafaza edilebilir. Bu çoğalan miyoblastlardır (MyoD ekspres
Fare iskelet kası kas uydu hücreleri Şekil 1.. Hazırlanması. A:. Makasla tarafından disseke triseps ve arka bacak kas kıyma B:. Panel A'nın Büyütülmüş görünüm C:. 18 G iğne D tarafından kollajenasa tedavi kıyılmış kas parçaları öğütülerek: Filtrating hücre süzgecinden kas hazırlık ayrışmış E:. MACS ayrılması ayrışmış LD sütuna göre kas hücreleri F:. MS sütuna göre ayrışmış kas hücreleri MACS ayırma G:.. Taze izole uydu hücreler H:. Pax7 pozitif taze izole uydu hücreler I: Panel G DAPI boyama.
Izole edilmiş uydu hücrelerin Şekil 2.. Kültürü. A, B, C:. Anti-miyozin ağır zincir (MHC)-pozitif çok-çekirdekli miyotüplerinin ayırt: taze olarak izole edilen uydu hücrelerin D, E, F türetilmiş anti-MyoD antikor-pozitif miyoblastlardır.
Şekil 3.. Fare iskelet kas içine genişletilmiş miyoblastların İntramüsküler enjeksiyon. A: Myf5 + / nLacZ farelerden izole miyoblastların X-gal lekeleme B, C:. TA kas içine Myf5 + / nLacZ miyoblastların kas içi enjeksiyonu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, hareketsiz uydu hücreleri kolayca kollajenaz sindirimi ve yüzey antikor aracılı MACS ayırma ile farelerin yetişkin iskelet kasından saflaştırılabilir. Bu yöntem, yaklaşık olarak 6 saat sürer ve bir makine gibi bir FACS pahalı ekipman gerek yoktur. Buna ek olarak, bu yöntem, yüzey antikor aracılı FACS ayrımına göre daha ucuzdur. FACS lazer maruz ayrılması sırasında 15 hücre ölümüne neden olmaya eğilimli olduğu için pasif uydu hücrelerin daha yüksek bir verim, aynı zamanda bu yöntem için FACS ile karşılaştırıldığında beklenmektedir. Bu tür preplating ya da tek bir kas lifi kültürlenmesi gibi diğer izolasyon yöntemleri kültüre birkaç gün gerektirir ve bu nedenle, bu yöntemler, aktif uydu miyoblast hücreleri veya izolasyonu için iyidir. Bununla birlikte, pasif uydu hücreleri, bu yöntemlerle saflaştırılabilir edilemez. Preplating yöntemler aktif uydu miyoblast hücreleri ve bunların arasındaki aderans fark temelinde fibroblast kontaminasyonu ortadan21 s. Aktive uydu hücre veya myoblast akıbet tek bir kas lifi kültür 22. sırasında oluşur. Ayrıca, (1-2 aylık) daha küçük olan farenin büyük farelerine göre bu MACS ayırma yöntemiyle arıtılmış, hareketsiz uydu hücreleri (1-5 x 10 5 / fare) daha yüksek bir verimini göstermektedir dikkat edin. Hasarlı kas daha infiltre kan hücreleri içeren Bununla birlikte, zarar görmüş kas uydu hücreleri hareketsiz saflığı bu yüzey, antikor aracılı MACS saflaştırmadan sonra azalır. Hareketsiz uydu hücrelerin MACS ayrılması için, negatif seçim için hücre yüzeyi markerleri olarak CD45, CD31, ve Sca-1 kullanılmıştır. CD45 pan-hematopoetik hücreler için bir yapımcısı; CD31 endotel hücreleri için bir marker; Sca-1 'in endotel hücreleri ve interstitial hücrelerin 23 hem de bir belirteçtir. Pozitif seçim için, hareketsiz uydu hücreleri hem de iskelet kasında bir nonmuscle hücreleri boyayan bir anti-integrin α7 monoklonal antikor kullanmıştır. Birçok grupaynı zamanda diğer pozitif ve negatif seçim ile bir arada, FACS-bazlı hareketsiz uydu hücre saflaştırma için bir anti-integrin antikoru kullanılmıştır α7 7,24 işaretler. Buna ek olarak, diğer gruplar CXCR4 25, CD34 7, sindekan-3 26, ya da sindekan-4 FACS tabanlı bir hareketsiz uydu hücre arıtma için 27 pozitif seçim işaretçileri karşı antikorlar kullanılmıştır. Bu monoklonal antikor için epitop 1 henüz tespit edilmemiştir sırasında bir SM/C-2.6 monoklonal antikoru ayrıca, pozitif seçim için kullanıldı. Bu pozitif seçim marker hiçbiri hareketsiz uydu hücreye özeldir. Bu nedenle, bu pozitif seçim işaretleyicileri gibi nonsatellite sentezleyen hücrelerin tamamen ortadan kaldırılması sıralama sonra hareketsiz uydu hücrelerin yüksek saflık elde etmek için gereklidir. Bu, bir pozitif seçim marker gibi M-kaderin olarak uydu hücreye spesifik hücre yüzey belirteçleri kullanmak daha yararlı olabilir.
Freshly izole edilmiş hareketsiz uydu hücreleri, gen ve protein ekspresyon profilleri, miyoblastları ve uydu hücre kendini yenileme deneyler için hücre nakli elde etmek için kültür deneyleri ve hücre tedaviler için kullanılabilir. Önceki çalışmaları gen ekspresyonu profilleri 1, 28 (örneğin,. Aktif hücre bölünmesi vs atıl aşamasında hücreleri gibi), bu iki hücre tipi arasındaki farklar bazı biyolojik açıklayabilir aktive uydu hücrelerinden önemli ölçüde farklı olduğunu göstermiştir. Son çalışma kas 6-7 yenileyici içine nakledilen zaman taze izole sakin uydu hücreleri aktive uydu hücrelerin veya miyoblastların göre anlamlı ölçüde yüksek uyumunu ve kendini yenileme aktiviteye sahip olduğunu göstermiştir. Örneğin, en az 100 hareketsiz uydu hücreleri, kendi kendini yenileyen uydu hücrelerin 5,7 kas lifleri rejenere hem de sağlam bir katkı göstermektedir. Bu yüzden, hareketsiz uydu hücreleri izole edilebilir birverimli hasarlı kas, kas lifi rejenerasyon katkılarından ve DMD hastalarında kas fonksiyonlarının kendi iyileşme aşılamak için kendi potansiyeli için test d.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz Myf5 + / nLacZ fareler sağlamak için Dr Shahragim Tajbakhsh teşekkür ederim. Biz de bu yazının eleştirel okuma için Alexander HRON ve Michael Baumrucker teşekkür ederim. Bu çalışma Müsküler Distrofi Derneği (MDA) ve Gregory Marzolf Jr MD Merkezi Ödülü hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Collagenase Type 2 | Worthington | CLS-2 | 100 mg |
| Marigel | BD Biosciences | 356234 | 5 ml |
| DMEM | Gibco-Invitrogen | 10569010 | 500 ml |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | 100 mg (3-4 mg/ml) |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | 500 ml |
| bFGF, human, Recombinant | Gibco-Invitrogen | PHG0263 | 1 mg |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A5611-1G | 1 g |
| Ham’s F10 Medium | Gibco-Invitrogen | 11550-043 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 3600511 | 500 ml |
| Horse Serum | Gibco-Invitrogen | 26050088 | 500 ml |
| Penicillin/Streptmycin | Gibco-Invitrogen | 15640055 | 100 ml |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco-Invitrogen | 14190144 | 500 ml |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco-Invitrogen | 25200072 | 500 ml |
| 18 G needle with 12 ml Syringe | Fisher Scientific | 22-256-563 | |
| Cell strainer (70 μm) | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Falcon 50 ml tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Falcon 15 ml tube | BD Biosciences | 352097 | |
| 10 cm Tissue culture plate | BD Biosciences | 353003 | |
| 6 cm Tissue culture plate | BD Biosciences | 353004 | |
| Falcon 10 ml disposable pipette | BD Biosciences | 357551 | |
| Anti-CD31 antibody-PE | eBiosciences | 12-0311 | |
| Anti-CD45 antibody-PE | eBiosciences | 30-F11 | |
| Anti-Sca1 antibody-PE | eBiosciences | Dec-81 | |
| Anti-Integrin α7 antibody | MBL International | ABIN487462 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-Mouse IgG MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-402 | |
| Mini & MidiMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-632 | |
| MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| LD Column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Cardiotoxin | Sigma Aldrich | C9759-1MG | Stock 10 μM in PBS |
| 31 G Insulin syringe | BD Biosciences | 328438 | |
| Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) | Beckman Coulter | 368826 | |
| S241.5 Swinging Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368882 | |
| Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) | Beckman Coulter | 392187 | |
| Nod/Scid immunodeficient mice | Charles River Laboratories | Strain Code 394 | Use 2 months old mice |
| Reagents | Recipe | ||
| 10% and 2% FBS DMEM | DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 0.2% Collagenase solution | Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM. | ||
| 10% Matrigel solution | Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20 °C until use. | ||
| Matrigel-coated plate | Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temperature for 1 min. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37 °C for 30 min after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 min. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20 °C for reuse. | ||
| 0.01% Collagen solution | Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O. | ||
| Collagen-coated plate | Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months. | ||
| bFGF stock solution | bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80 °C. | ||
| Myoblast medium | 500 ml HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock). | ||
| Differentiation medium | 500 ml DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 10 μM Cardiotoxin stock | 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS. | ||
References
- Fukada, S., et al. Purification and cell-surface marker characterization of quiescent satellite cells from murine skeletal muscle by a novel monoclonal antibody. Exp. Cell Res. 296, 245-255 (2004).
- Hirai, H., Verma, M., Watanabe, S. C. T., Asakura, Y., Asakura, A. MyoD regulates apoptosis of myoblasts through microRNA-mediated down-regulation of Pax3. J. Cell Biol. (191), 347-365 (2010).
- Asakura, A. Stem cells in adult skeletal muscle. Trends Cardiovasc. Med. 13, 123-128 (2003).
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122, 289-301 (2005).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309, 2064-2067 (2005).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456, 502-506 (2008).
- Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods Mol. Biol. 621, 165-173 (2010).
- Yokoyama, T., Huard, J., Chancellor, M. B. Myoblast therapy for stress urinary incontinence and bladder dysfunction. World J. Urol. 18, 56-61 (2000).
- Menasche, P. Skeletal muscle satellite cell transplantation. Cardiovasc. Res. 58, 351-357 (2000).
- Huard, J., et al. Myoblast transplantation produced dystrophin-positive muscle fibres in a 16-year-old patient with Duchenne muscular dystrophy. Clin. Sci. 81, 287-288 (1991).
- Tremblay, J. P., et al. Results of a triple blind clinical study of myoblast transplantations without immunosuppressive treatment in young boys with Duchenne muscular dystrophy. Cell Transplant. 2, 99-112 (1993).
- Gussoni, E., Blau, H. M., Kunkel, L. M. The fate of individual myoblasts after transplantation into muscles of DMD patients. Nat. Med. 3, 970-977 (1997).
- Palmieri, B., Tremblay, J. P., Daniele, L. Past, present and future of myoblast transplantation in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Pediatr. Transplant. 14, 813-819 (2010).
- Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Acute hydrodynamic forces and apoptosis: a complex question. Biotechnol. Bioeng. 98, 772-788 (2007).
- Asakura, A., Rudnicki, M. A. Side population cells from diverse adult tissues are capable of in vitro hematopoietic differentiation. Exp. Hematol. 30, 1339-1345 (2002).
- Asakura, A., et al. Increased survival of muscle stem cells lacking the MyoD gene after transplantation into regenerating skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 16552-16557 (2007).
- Gerard, X., et al. Real-time monitoring of cell transplantation in mouse dystrophic muscles by a secreted alkaline phosphatase reporter gene. Gene Ther. 16, 815-819 Forthcoming.
- Tajbakhsh, S., Rocancourt, D., Cossu, G., Buckingham, M. Redefining the genetic hierarchies controlling skeletal myogenesis Pax-3 and Myf-5 act upstream of MyoD. Cell. 89, 127-138 (1997).
- Beauchamp, J. R., et al. Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J. Cell Biol. 151, 1221-1134 (2000).
- Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Seale, P., Asakura, A., Rudnicki, M. A. Reduced differentiation potential of primary MyoD-/- myogenic cells derived from adult skeletal muscle. J. Cell Biol. 144, 631-643 (1999).
- Bischoff, R. Regeneration of single skeletal muscle fibers in vitro. Anat. Rec. 182, 215-235 (1975).
- Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J. Cell Biol. 159, 123-134 (2002).
- Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
- Farina, N. H., et al. A role for RNA post-transcriptional regulation in satellite cell activation. Skelet. Muscle. 2, 21-21 (2012).
- Tanaka, K. K., Hall, J. K., Troy, A. A., Cornelison, D. D., Majka, S. M., Olwin, B. B. Syndecan-4-expressing muscle progenitor cells in the SP engraft as satellite cells during muscle regeneration. Cell Stem Cell. 4, 217-225 (2009).
- Pallafacchina, G., et al. An adult tissue-specific stem cell in its niche: a gene profiling analysis of in vivo quiescent and activated muscle satellite cells. Stem Cell Res. 4, 77-91 (2009).
