Summary
静止卫星细胞的纯群体的分离和培养，肌肉干细胞群，是必不可少的肌肉干细胞生物学和再生，以及干细胞移植在肌营养不良症和其他退行性疾病的治疗方法的理解。
Abstract
肌卫星细胞是必需的产后骨骼肌发育和再生干细胞群，占sublaminal核2-5％的肌纤维。在成人的肌肉，卫星细胞通常有丝分裂的静态。以下损伤，然而，卫星细胞引发细胞增殖以产生成肌细胞，它们的子代，介导肌肉的再生。的卫星细胞衍生的成肌细胞移植已被广泛研究作为一种可能的治疗为几个再生的疾病，包括肌营养不良，心脏衰竭，和泌尿功能障碍。成肌细胞移植到营养不良骨骼肌，心肌梗死心脏和正常运作尿导管表明，嫁接成肌细胞能分化成肌纤维在宿主组织并在这些疾病中显示的部分功能改善。因此，从骨骼MUSCL静止卫星细胞的有效的纯化方法的开发E，以及建立卫星细胞来源的成肌细胞的培养和移植方法，成肌细胞，对于理解后面卫星细胞的自我更新，活化和分化的分子机制是必不可少的。此外，基于细胞的疗法的肌肉萎缩症和其它再生疾病的发展，也取决于这些因素。
然而，静态卫星细胞的当前预期的纯化方法需要使用昂贵的荧光激活细胞分选术（FACS）的机器。在这里，我们提出了一种新的方法从成年小鼠骨骼肌通过酶解静止卫星细胞的快速，经济，可靠的净化后的磁激活细胞分选（MACS）。继纯静态的卫星细胞的分离，这些细胞可以培养几个段落后获得大量的成肌细胞。这些新鲜分离静止卫星细胞或活体外扩增的成肌细胞可移植到心脏毒素（CTX）诱导再生小鼠骨骼肌检查，以再生肌纤维供体来源的细胞的贡献，以及对卫星细胞车厢自我更新的检查活动。
Introduction
肌卫星细胞是一小口位于骨骼肌纤维基底层下方生肌干细胞。它们的特点是表达Pax7，PAX3，c-Met的M-钙粘蛋白，CD34，配体蛋白聚糖-3的表达，和降钙素是1 - 3。卫星细胞已被证明是负责肌肉再生肌肉干细胞。在成人的肌肉，卫星细胞通常有丝分裂的静态4-8。损伤后，卫星细胞被激活，启动MyoD的表达，并进入细胞周期，以扩大他们的后代，称为肌前体细胞或成肌细胞3。经过几轮细胞分裂，成肌细胞退出细胞周期和保险丝彼此以进行分化成多成核肌管，随后成熟的肌纤维。成肌细胞从成年肌肉中分离可容易地体外扩增。成为肌纤维的再生和肌肉的能力，成肌细胞在非肌肉组织形式异位肌纤维是由成肌细胞移植，为杜氏肌营养不良症（DMD）4一个潜在的治疗方法，泌尿功能障碍9，和心脏衰竭10利用。事实上，成肌细胞已经成功移植在这两个MDX（DMD模型）小鼠和DMD患者11-14的肌肉。注入的正常成肌细胞与宿主肌纤维融合，以改善病变肌肉的组织学和功能。以前的工作表明，成肌细胞的亚群更干细胞样和在肌肉再生5保持在未分化状态在较长的肌肉。最近的工作表明，从成年肌肉新鲜分离的卫星细胞含有干细胞样群体表现出更有效的植入和自我更新的活动在再生肌肉5-8。因此，从成年骨骼肌亩静止卫星细胞的纯人口的纯化SCLE是必不可少的理解卫星细胞，成肌细胞和肌再生的生物，和基于细胞的疗法的发展。
然而，静态卫星细胞的当前预期的纯化方法需要使用昂贵的荧光激活细胞分选术（FACS）机1,2,6-8的。此外，流式细胞仪激光曝光通常的分离，这将导致静态卫星细胞15的下屈服过程中诱导细胞死亡。在这里，我们提出了从成年小鼠骨骼肌静止卫星细胞的快速，经济，可靠提纯的新方法。此方法利用酶解随后磁激活细胞分选（MACS）。继纯静态的卫星细胞的分离，这些细胞可以培养几个段落后获得大量的成肌细胞。我们还表明，这些注入新鲜分离的静止卫星细胞或前六肌内画外音扩展的成肌细胞可移植到心脏毒素（CTX）诱导再生小鼠骨骼肌检查供体来源的细胞的再生肌纤维，以及对卫星细胞区室为自我更新的活动的检查的贡献。
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Protocol
动物被容纳在一个SPF环境和由研究动物资源明尼苏达大学（RAR）进行了监测。该动物以适当的方式安乐死（CO 2吸入或氯化钾注射液被麻醉的IP注射圣阿韦坦（250毫克/公斤）后，所有协议获得批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC，码数：1304-30492明尼苏达大学的）。
1，从分离小鼠骨骼肌单个核细胞
- 适当牺牲1或2年轻的成年小鼠（3-8周）。
- 捏和狭缝与锋利的剪刀腹部的皮肤。剥落的皮肤完全展现三头肌和后肢肌肉（拉在相反方向的皮肤）。
- 删除所有腿部骨骼肌肉（胫前肌，腓肠肌，股四头肌）和三头肌沿着骨头用剪刀。然后在10cm平板转移至肌肉冰冷的无菌PBS中。
- 1-2小鼠1盘：洗血脱在PBS肌肉和肌肉转移到一个新的无菌6厘米板。
- 解剖显微镜下去除结缔组织，血管，神经束和成脂组织。
- 用剪刀用于眼科，切割和切碎的组织成光滑的纸浆（ 图1A和1B）。尽量不留下大的碎片，因为它们将不容易被酶溶液进行细分。
- 转移剁碎肌肉成猎鹰50ml管中，并加入5 ml的胶原酶溶液（0.2％胶原酶类型的DMEM 2在10％FBS）。在37℃下60分钟。
- 磨碎（向上和向下与18号针头），以均匀的混合物（ 图1C）。然后进一步在37℃孵育混合物15分钟。
- 再次磨碎，以均质混合物中解离成单细胞悬液。添加的DMEM 2％FBS的最多至50ml成单细胞悬浮液并混合好。
- 放置一个细胞过滤网（70微米）至Falcon 50ml管中（ 图1D）。传送含有脱落的细胞到细胞过滤上清液，吸取细胞悬液向上和向下的过滤器，直到它穿过。
- 通过血球计数细胞数。离心管在2,000 rpm在4℃下5分钟;吸，弃上清。
- 重悬在DMEM10毫升2％FBS。离心管在2,000 rpm在4℃下5分钟;吸，弃上清。
- 重悬于200微升2％胎牛血清的DMEM和转移的细胞悬液注入的1.5 ml离心管中。通常情况下，约2×10 6个细胞应从1小鼠的肌肉被收获。细胞将稀释至1×10 6个细胞在DMEM中加入100μl2％FBS的浓度。
2，抗体染色分离 - MACS
在接下来的公关ocedures，用无菌缓冲液保持无菌条件。加入抗体的每个卷和细胞悬浮介质是计算从1小鼠全肌肉细胞。如果细胞是从2个或更多的小鼠收获，试剂的量应被优化。
- 添加每个CD31-PE，CD45-PE，的Sca-1-PE和整合素α7抗体为200微升的细胞悬浮液的1微升。在冰上孵育30分钟。
- 洗涤细胞：温育后，加入DMEM1毫升2％FBS到细胞悬浮在1.5mL管中，并离心分离机在2000rpm下在4℃下3分钟。重复此步骤两次。
- 吸，弃上清。
- 悬浮细胞用200微升2％FBS的DMEM培养基中，并加入10微升的抗PE磁珠。在冰上孵育30分钟。
- 洗涤细胞：温育后，加入1 ml的MACS缓冲液，以细胞悬浮液中的1.5 ml离心管，然后离心以2,000 rpm在4℃下3分钟。重复此步骤，总重量冰。请注意，电池应通过MACS缓冲液由磁性柱被分离之前洗涤。
- 吸，弃上清。重悬细胞用1.0毫升的MACS缓冲液中。
- 成立LD柱在磁板上，并冲洗色谱柱2.0毫升MACS缓冲液（ 图1E）。
- 细胞悬液转移到LD柱，并收集流过级分至1.5 ml管中。该馏分含有PE-阴性细胞。
- 离心机以2,000 rpm在4℃下进行3分钟，吸出并弃去上清液。
- 悬浮细胞用200μl2％FBS的DMEM中，并加入10微升的抗小鼠IgG磁珠。在冰上孵育30分钟。
- 洗涤细胞：温育后，加入1 ml的MACS缓冲液进入细胞悬浮在1.5ml管中，然后离心以2,000 rpm在4℃下3分钟。吸，弃上清。重复此步骤两次。重悬细胞用500μlMACS缓冲液。
- 设置MS柱在磁板上，并冲洗色谱柱用500μlMACS缓冲液（ 图1F）。
- 转移细胞悬浮液涂布到MS柱，并弃去流过级分（整合素α7-阴性细胞）。
- 冲洗用1毫升MACS缓冲液，然后重复此步骤两次。
- 漂洗后，从分离器的磁场删除的列。申请1.0毫升的MACS缓冲液上柱，并通过从塔的顶部推压注射器柱塞洗脱磁性标记的细胞（整合素α7-阳性细胞）至1.5 ml微量离心管中。收集流过到1.5ml的试管中。重复洗脱用1.5ml的MACS缓冲液和收集流过。
- 离心机以2,000 rpm在4℃下进行3分钟，吸出并弃去上清液。
- 悬浮纯化的细胞用1ml的成肌细胞培养基（20％FBS的含火腿的F-10与bFGF）的，并且板单元上的Matrigel包被的10厘米板用8ml成肌细胞中的（5毫升6厘米板）（ 图1G）。需要注意的是1-2×10 5细胞可以潜在地从1完整小鼠肌肉中分离。
3。维护
- 与成肌细胞培养基喂养细胞每隔一天。越来越多的成肌细胞的外观是一个小而圆的形状在其核MyoD的表达（ 图2），并表达Pax7（数据未显示）。
- 成肌细胞应该50％汇合之前启动细胞融合时进行传代或。用PBS漂洗一次后，培养细胞用0.25％胰蛋白酶溶液，在37℃下在CO 2培养箱中3分钟，并收集分离的细胞，成肌细胞培养基中。离心细胞（1,000 rpm离心5分钟）后，暂停与成肌细胞介质和replate细胞到新的基质胶包被的平板上。胶原包被的板可以通道3后使用。一板通常可以分成三到五个板块。
4。迪菲rentiation
- REFEED与分化中的每一天。
- 通过在分化培养基2天，成肌细胞退出细胞周期和进行分化成肌球蛋白重链（MHC）阳性细胞。这些myoctyes开始细胞融合与对方产生多核肌管。通常情况下，大部分的成肌细胞成为MHC-阳性差分单核细胞或肌管（ 图2）通过在分化培养基3-5天。
5，成肌细胞移植到小鼠的骨骼肌再生
- 腹腔（IP）注射麻醉小鼠与圣阿韦坦（250毫克/千克）。
- 剃了头发皮肤上绕胫前（TA）的肌肉。成肌细胞移植二十四小时前，10微米CTX（50微升）肌内注射到NOD / SCID小鼠的TA肌肉通过一个31 G胰岛素注射器通过剃光皮肤（ 图诱发肌肉再生60，3）。
- 增殖的成肌细胞解离，用0.25％胰蛋白酶溶液中，以1,000 rpm离心5分钟。吸，弃上清。重悬1×10 6个细胞与50μl的DMEM 2％FBS的。转移悬浮细胞成一个31 G的胰岛素注射器。
- 受体小鼠将通过IP注射进行麻醉，用阿佛丁（250毫克/千克），以及1×10 6个成肌细胞（ 图2）肌内注射到再生的TA肌肉。
- 收获的TA肌肉由1-4周细胞注射用于组织学分析（ 图3）之后。
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Representative Results
新鲜分离的静止卫星细胞显示一个小的，圆形（ 图1G），并且明确表达Pax7作为一个明确的标志静止卫星细胞。超过90％的新鲜分离细胞的表达表达Pax7（ 图1H和1I）。污染最严重的细胞是由血细胞体外成肌以下培养条件不高效发展。因此，卫星细胞来源的成肌细胞中占主导地位的文化。任选地，可以重复该步骤为MS柱纯化（步骤2.11-2.14），以增加分离的卫星细胞的纯度。这些静止卫星细胞会进入细胞周期在24小时内分离后经过生肌前体细胞或成肌细胞。这些细胞可通过胰蛋白酶消化进行传代，每4天，直到细胞增殖率降低。通常，这些细胞可以被保持，直到通道10，这些增殖的成肌细胞表达MyoD的（
图1：准备从小鼠骨骼肌肌卫星细胞。答 ：用剪刀切绞肉两用解剖的三头肌和后肢肌肉B：板A的放大图C：通过18号针头Ð捣碎胶原酶治疗肌肉绞碎件：遍过滤通过细胞过滤分离肌肉准备E：的MACS分离分离肌细胞的LD列F：游离肌细胞的MACS经MS柱分离G：。新鲜分离的卫星细胞H：表达Pax7阳性新鲜分离的卫星细胞我 ：DAPI染色为图G。
图2。培养分离卫星细胞。 A，B，C：抗肌球蛋白重链（MHC）阳性的分化多有核肌管：从新鲜分离的卫星细胞D，E，F源性抗MyoD的抗体阳性的成肌细胞。
图3。肌内注射膨胀成肌细胞到小鼠的骨骼肌。答 ：X-gal的成肌细胞从MYF5 + / nLacZ小鼠中分离的染色B，C：肌肉注射MYF5 + / nLacZ成肌成助教肌肉。
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Discussion
在这个协议中，静态卫星细胞可以容易地从小鼠通过胶原酶消化和表面抗体介导的MACS分离成年骨骼肌纯化。这种方法大约需要6小时，不需要任何昂贵的设备，如流式细胞仪机。此外，相比表面抗体介导的FACS分离这种方法是相对便宜的。较高的收益率静态卫星细胞也有望在比较FACS这个方法，因为流式细胞仪激光曝光趋于分离15时诱导细胞死亡。其他的隔离方法，例如预镀或单个肌纤维的培养需要数天到文化，因而，这些方法有利于激活卫星细胞或成肌细胞的分离。然而，静态卫星细胞不能用这些方法进行纯化。预镀的方法排除激活卫星细胞和成肌细胞之间的粘附差异的基础上，成纤维细胞污染第21条。在单个肌纤维的文化22时激活卫星细胞或成肌细胞的生长。我们还注意到，年轻小鼠（1-2月龄）表现出较高的收益率静态卫星细胞（1-5×10 5 /鼠标）此MACS分离纯化方法相比，老年小鼠。然而，从受损的肌肉静止卫星细胞的纯度此表面抗体介导的MACS纯化后降低，因为损坏的肌肉中含有较多的渗透的血细胞。对于静止卫星细胞的MACS分离，我们利用CD45，CD31，和SCA-1为阴性选择的细胞表面标志物。 CD45是一个制造商对泛造血细胞; CD31是一个标记的内皮细胞;的Sca-1是一个标记为内皮细胞和间质细胞23。对于正选择，我们利用一种抗整合素α7的单克隆抗体，其染色静止卫星细胞以及一些非肌肉细胞在骨骼肌中。几组还利用一种抗整合素α7抗体为基于FACS的静止卫星细胞纯化，在与其他阳性和阴性选择标记物组合7,24。此外，其它基团使用的抗CXCR4 25，CD34 7，配体蛋白聚糖-3 26，或配体蛋白聚糖-4 27作为阳性选择标记物为基于FACS的静态卫星细胞的纯化。一个SM/C-2.6单克隆抗体也可用于阳性选择而表位此单克隆抗体还没有被确定尚未1。没有这些阳性选择标记物是静止卫星细胞特异性。因此，彻底消除这些表达阳性选择标记如非附属的细胞是获得静止卫星细胞纯度高排序后必不可少的。它可能是使用卫星细胞特异性细胞表面标记物，例如M-钙粘蛋白作为阳性选择标记物更为有用。
Freshly分离静态卫星细胞可用于基因和蛋白质表达谱，培养实验，得到的成肌细胞和细胞移植的卫星细胞的自我更新的实验中，与细胞的治疗方法。以前的研究表明，基因表达图谱显著有别于激活卫星细胞，这也许可以解释一些这两种细胞类型之间的生物学差异（如细胞的休眠期比 。活跃的细胞分裂）1，28。最近的工作已经表明，新鲜分离的静止卫星细胞具有显著更高植入和自我更新的活性相比，活化的卫星细胞或成肌细胞当移植到再生肌肉6-7。例如，小于100静止卫星细胞显示对再生肌纤维以及为自我更新的卫星细胞5,7健壮的贡献。因此，静止卫星细胞可以分离出ð测试他们的潜力，有效地嫁接在受损的肌肉，其肌肉纤维再生的贡献，以及其改善DMD患者的肌肉功能。
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Disclosures
没有利益冲突声明。
Acknowledgments
我们感谢Shahragim Tajbakhsh博士提供MYF5 + / nLacZ小鼠。我们也感谢亚历山大HRON和迈克尔Baumrucker这个手稿的批判性阅读。这项工作是由肌肉萎缩症协会（MDA）和格雷戈里Marzolf小的MD中心奖助学金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Collagenase Type 2 | Worthington | CLS-2 | 100 mg |
| Marigel | BD Biosciences | 356234 | 5 ml |
| DMEM | Gibco-Invitrogen | 10569010 | 500 ml |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | 100 mg (3-4 mg/ml) |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | 500 ml |
| bFGF, human, Recombinant | Gibco-Invitrogen | PHG0263 | 1 mg |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A5611-1G | 1 g |
| Ham’s F10 Medium | Gibco-Invitrogen | 11550-043 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 3600511 | 500 ml |
| Horse Serum | Gibco-Invitrogen | 26050088 | 500 ml |
| Penicillin/Streptmycin | Gibco-Invitrogen | 15640055 | 100 ml |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco-Invitrogen | 14190144 | 500 ml |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco-Invitrogen | 25200072 | 500 ml |
| 18 G needle with 12 ml Syringe | Fisher Scientific | 22-256-563 | |
| Cell strainer (70 μm) | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Falcon 50 ml tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Falcon 15 ml tube | BD Biosciences | 352097 | |
| 10 cm Tissue culture plate | BD Biosciences | 353003 | |
| 6 cm Tissue culture plate | BD Biosciences | 353004 | |
| Falcon 10 ml disposable pipette | BD Biosciences | 357551 | |
| Anti-CD31 antibody-PE | eBiosciences | 12-0311 | |
| Anti-CD45 antibody-PE | eBiosciences | 30-F11 | |
| Anti-Sca1 antibody-PE | eBiosciences | Dec-81 | |
| Anti-Integrin α7 antibody | MBL International | ABIN487462 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-Mouse IgG MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-402 | |
| Mini & MidiMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-632 | |
| MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| LD Column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Cardiotoxin | Sigma Aldrich | C9759-1MG | Stock 10 μM in PBS |
| 31 G Insulin syringe | BD Biosciences | 328438 | |
| Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) | Beckman Coulter | 368826 | |
| S241.5 Swinging Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368882 | |
| Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) | Beckman Coulter | 392187 | |
| Nod/Scid immunodeficient mice | Charles River Laboratories | Strain Code 394 | Use 2 months old mice |
| Reagents | Recipe | ||
| 10% and 2% FBS DMEM | DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 0.2% Collagenase solution | Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM. | ||
| 10% Matrigel solution | Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20 °C until use. | ||
| Matrigel-coated plate | Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temperature for 1 min. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37 °C for 30 min after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 min. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20 °C for reuse. | ||
| 0.01% Collagen solution | Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O. | ||
| Collagen-coated plate | Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months. | ||
| bFGF stock solution | bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80 °C. | ||
| Myoblast medium | 500 ml HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock). | ||
| Differentiation medium | 500 ml DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 10 μM Cardiotoxin stock | 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS. | ||
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