Artigo de método

Atuação Remoto magnética de micrométricas para Sondas

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DOI:

10.3791/50857

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2 de maio de 2014

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1Physicochime Curie, CNRS UMR 168, Institut Curie, Sorbonne Universités, UPMC, 2Unité de Génétique des Biofilms, Institut Pasteur, 3Laboratoire Jean Perrin, CNRS UMR 8237, Sorbonne Universités, UPMC

Neste artigo

Resumo

Este documento mostra uma metodologia original baseado na actuação remota de partículas magnéticas semeadas num biofilme bacteriano e o desenvolvimento de uma pinça magnéticos dedicados para medir in situ as propriedades mecânicas locais da matéria viva complexo construído por micro-organismos nas interfaces.

Resumo

Aderência bacteriana e crescimento em interfaces levar à formação de estruturas tridimensionais heterogéneos chamados biofilmes. As células que habitam estas estruturas são mantidas juntas por interacções físicas mediadas por uma rede de substâncias poliméricas extracelulares. Biofilme bacteriano impactar muitas atividades humanas ea compreensão de suas propriedades é fundamental para um melhor controle do seu desenvolvimento - manutenção ou erradicação - dependendo de seu resultado adverso ou benéfico. Este artigo descreve uma nova metodologia com o objetivo de medir in situ as propriedades físicas locais do biofilme que tinha sido, até agora, examinada apenas a partir de uma perspectiva macroscópica de material e homogênea. A experiência aqui descrita envolve a introdução de partículas magnéticas num biofilme em crescimento sobre as sementes de sondas locais que podem ser comandadas à distância, sem perturbar as propriedades estruturais do biofilme. Pinças magnéticas Dedicados foram desenvolvido para exercer uma força definida em cada partícula incorporada no biofilme. A instalação é montada sobre a plataforma de um microscópio, para permitir a gravação de imagens de lapso de tempo do período de puxar partícula. As trajectórias das partículas são, em seguida, extraiu-se a partir da sequência de puxar e os parâmetros locais viscoelásticas são derivados a partir de cada curva de deslocamento das partículas, proporcionando assim a distribuição 3D-espacial dos parâmetros. Ganhar insights sobre o perfil mecânico do biofilme é essencial do ponto de vista de um engenheiro de vista para fins de controle do biofilme, mas também a partir de uma perspectiva fundamental para esclarecer a relação entre as propriedades arquitetônicas e biologia específico dessas estruturas.

Introdução

Biofilme bacteriano são comunidades de bactérias associadas com superfícies biológicas ou artificiais 1-3. Eles formam por um mecanismo de adesão-crescimento juntamente com a produção de matriz extracelular rica em polissacárido que protege e estabiliza o edifício 4,5. Estes biofilmes não são assemblages simplesmente passivos de células aderidas a superfícies, mas organizado e sistemas biológicos complexos dinâmicos. Quando bactérias mudar de planctônicas de biofilme estilo de vida, as alterações na expressão de genes e fisiologia celular estão observada, bem como um aumento da resistência aos antibióticos e as defesas do hospedeiro imunes estando na origem de muitas infecções persistentes e crónicas 6. No entanto, o desenvolvimento controlada dessas estruturas vivas também oferecem oportunidades para aplicações industriais e ambientais, como a biorremediação de depósitos de resíduos perigosos, bio-filtração de água industrial ou formação de bio-barreiras para proteger o solo e as águas subterrâneas de contaminção.

Embora as características moleculares específicos para forma de biofilme de vida estão cada vez mais descrito, os mecanismos que impulsionam o desenvolvimento da comunidade e persistência permanecem obscuros. Usando os recentes avanços nas medidas microescala usando eletroquímica de varredura ou microscopia de fluorescência, essas organizações vivas têm sido mostrados para apresentar considerável estrutural, química e biológica heterogeneidade 7. No entanto, até agora, a mecânica do biofilme foram principalmente examinados macroscopicamente. Por exemplo, a observação de flâmulas biofilme deformação devido a variações nas taxas de fluxo de fluido 8,9, compressão uniaxial de peças de biofilme levantar de ágar ou cultivadas em cobertura desliza 10,11, cisalhamento de biofilme coletado do ambiente e, em seguida, transferido para um paralelo placa reômetro 12,13, espectroscopia de força atômica usando uma conta de vidro e revestido com um biofilme bacteriano ligado a um cantilever AFM 14 ou um micr dedicadoocantilever método para medir a resistência à tracção de fragmentos de biofilme destacadas 15,16 foram aplicadas durante os últimos dez anos, fornecendo informação útil sobre a natureza viscoelástica do material 17. No entanto, parece provável que a informação sobre as propriedades mecânicas de biofilme in situ é perdida quando o material é removido do seu ambiente nativo, que era muitas vezes o caso em tais abordagens. Além disso, o tratamento do biofilme como um material homogéneo, falha a informação sobre a possível heterogeneidade das propriedades físicas dentro da comunidade. Portanto, as implicações exatas da mecânica da estrutura na formação de biofilme e traços biológicos, como a expressão do gene padrões ou gradientes químicos dificilmente pode ser reconhecido. Para avançar no sentido de uma descrição microescala das propriedades físicas do biofilme, as novas ferramentas dedicadas são obrigatórios.

Este documento detalha uma abordagem original concebido para alcançarmedição dos parâmetros mecânicos locais in situ, sem perturbar o biofilme e permitindo que o desenho da distribuição espacial das propriedades dos materiais em microescala e, em seguida, a heterogeneidade mecânica. O princípio do ensaio baseia-se na dopagem de um biofilme cresce com micropartículas magnéticas, seguida da sua carga remota usando uma pinça magnéticos no biofilme maduro. Deslocamento de partículas sob controlado aplicação de força magnética fotografada ao microscópio permite derivação parâmetro viscoelástico local, cada partícula relatando seu próprio ambiente local. A partir destes dados, o perfil mecânico 3D do biofilme pode ser desenhada, revelando dependências condições espaciais e ambientais. Todo o experimento será mostrado aqui em um E. biofilme coli feito por uma cepa geneticamente modificado carregando um plasmídeo F-like desreprimidas. Os resultados detalhados em um artigo recente 18 fornecer uma visão única do interior da mecânica do biofilme intactas.

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Protocolo

1. Cultura das bactérias e preparação de suspensão

  1. Escolha de uma colónia recentemente crescido a partir de uma placa de ágar Lisogenia Broth (LB), inocula-o em 5 mL de meio líquido LB contendo 100 μ g / ml de ampicilina e 7,5 μ g / ml de tetraciclina e incube-para de 5 a 6 horas a 37 ° C em uma plataforma de agitação.
  2. Em seguida, adiciona-se 100 μ l de cultura bacteriana, em 5 ml de meio mínimo (M63B1) suplementado com 0,4% de glucose e as mesmas concentrações de antibiótico. Incubar durante a noite desta cultura recém diluído a 37 ° C em uma plataforma de agitação.
  3. Após 16 horas de incubação, adiciona-se 100 ul da cultura durante a noite a 5 ml M63B1, 0,4% de glucose. Manter o tubo a 37 ° C para a plataforma de agitação até uma OD de 0,5 seja alcançado. A suspensão é em seguida, pronto para a injecção para dentro do canal experiência para a formação de biofilme.

2. Preparação de Partículas Magnéticas

  1. Tome 10 partículas magnéticas ul -2,8 μ m de diâmetro, - a partir do estoque e lavá-los 3x em 190 ul de meio mínimo, com o auxílio de um suporte de amostras magnético.
  2. Ajustar a concentração de partículas de 5 x 10 6 / ml grânulos. Tipicamente, 50 uL da solução do grânulo lavado é misturado com um outro 950 μ l de M63B1 com 0,4% de glucose.

3. Canal Preparação e crescimento do biofilme

  1. Montagem Canal
    1. Corte dois quadrados (800 μ m de comprimento lado) capilares de vidro borosilicato 10 cm de comprimento para obter peças de dois 8 cm de comprimento.
    2. Cole as duas partes capilares em duas lâminas de vidro - cortado pela metade primeiro - 2 cm de distância de 1 cm de saliência em cada extremidade, como na Figura 1, usando uma cola de cianoacrilato de ação rápida (os chamados super-cola).
    3. Autoclave toda a configuração ea tubulação necessária exigida para posterior conexão de canal.
    4. Reúna todos os materiais estéreis sobuma capela de fluxo laminar: i) o canal e prender um montado, ii) a tubulação e os conectores, iii) as duas armadilhas bolha - o filtro bolha comumente usados ​​para proteger as crianças que se alimentam de gotejamento (armadilha 1) ea bolha armadilha caseira como um tubo de 4 cm de comprimento de diâmetro maior (armadilha 2), iv) braçadeiras, v) 30 ml seringas cheias de M63B1, 0,4% de glicose, e vi) o frasco de resíduos.
    5. Conecte toda a configuração com conectores Luer Lock ou junções na seguinte ordem: 50 ml M63B1 seringa controlada pela bomba de seringa, filtro bolha pediátrica, caseiro borbulhador, capilar (Figura 1, painel B), e do tubo para o frasco de resíduos. Em seguida, preencha a configuração com M63B1 estéril, 0,4% de glicose, de ligar a bomba de seringa a uma taxa de cerca de 10 ml / h, superior às taxas experimentais. Monitorar cuidadosamente e eliminar todas as bolhas no circuito.
    6. Fluxo o meio através do sistema por 10-15 min; concorrentemente misturar 1 ml da suspensão de bactérias em OD 0.5 da Seção1.3 com 1 ml da solução de talão lavado preparado na Seção 2.2.
    7. Anexar (mas não feche) braçadeiras para a tubulação em duas posições: antes e depois dos capilares. Mudar o fluxo fora.
    8. Introduzir a mistura de bactérias talão no capilar após a casa feita bolha armadilha usando uma seringa de 1 ml, tendo o cuidado de segurar o tubo de extremidades para evitar a entrada de ar. Re-conectar o tubo e feche os grampos.
    9. Repita o mesmo procedimento para o segundo capilar e verificar todos os tubos para bolhas.
    10. Transferir o aparelho para o microscópio e deixar em repouso durante 15-20 minutos para permitir que as bactérias que se contentar e aderem à superfície do capilar. Instale o capilar para o palco microscópio com o recipiente de resíduos a um nível ligeiramente superior. Coloque a bomba de seringa em cima do balcão ao lado do microscópio. Elevar a retenção de bolhas antes da capilar ligeiramente mais elevada do que o plano capilar para capturar bolhas.
  2. Biofilme Growth
    1. Ajuste a velocidade de fluxo da bomba de seringa e iniciar o fluxo, o biofilme se agora desenvolver na superfície do capilar durante o período necessário - geralmente 24 ou 48 horas nestas experiências.
    2. Concentre-se no plano inferior capilar e iniciar a gravação de lapso de tempo as imagens da amostra - geralmente uma freqüência de aquisição de 2 imagens / min irá relatar adequadamente o crescimento do biofilme. Este biofilme crescimento pós-controle de monitores de vídeo (ver extratos em Vídeos 1, 2 e 3).

4. Pinças magnéticas Instalação

  1. Parafuso as pinças magnéticos em micromanipuladores XYZ controlado manualmente e parafuso micromanipuladores na platina do microscópio para ajustar a posição das pinças relativamente ao capilar. Coloque a pinça como na Figura 2 para assegurar o gradiente de campo magnético apropriado é gerado na zona de observação.
  2. Ligue as pinças tO gerador de função através de um amplificador de potência para gerar um período de 40 segundos de tempo de 24 s fez sinal zero e 16 seg de 4 uma corrente directa com um gatilho enviada para o campo de luz brilhante do obturador depois de 20 segundos para a sincronização de sinal proporcionando uma sequência de eventos como na Figura 3.
    Nota: Estas duas operações pode ser conseguida em qualquer altura entre a instalação do capilar e medição de início. Ver experimentar esboço visão geral na Figura 4.

5. Creep Curve Aquisição

  1. Usar o controle do movimento xy de platina do microscópio para trazer a aresta do pólo magnético do lado esquerdo e do bordo do lado esquerdo do capilar no mesmo campo de observação. Leve a origem do referencial de análise na intersecção de x e y-eixos definidos pela aresta do capilar e a aresta da peça polar, respectivamente (ver Figura 2).
  2. Ajusta a posição vertical do capilar usando fina foco cbotão ontrol da posição microscópio. Tipicamente, o primeiro plano examinados situa-se entre 4 a 7 μ m acima do fundo do capilar. Vídeo 1 corresponde ao campo xy que tem o seu canto superior esquerdo na origem do referencial espacial.
  3. Desencadear a sequência de 40 seg dos eventos descritos na secção 4.2 e a Figura 3, ao ligar o gerador de corrente e ao mesmo tempo, desencadear manualmente a sequência de aquisição de imagens de vídeo 1.
  4. Mover o capilar para o campo direito vizinho por uma μ m de tradução 250 da platina do microscópio para a esquerda e utilizar, como na secção 5.3 para gerar video 2 de fatia de 2 e de modo a obter os vídeos necessários. Normalmente 3 a 4 campos de 250 x 250 μ m 2 são coletados ao longo do eixo-x antes de mudar o plano e repetir mesmas operações para o novo avião.

Calibração Força 6.

  1. Prepare uma solução de glicerol pela mistura de 39,8 g de glicerol com 190 μ l de água bi-destilada e 10 ml de partículas magnéticas em um 2 x 10 9 partículas / ml e encher um canal experimental com esta mistura e coloque-o no palco microscópio como descrito para a amostra de biopelícula.
  2. Depois de instalar as pinças magnéticas, como indicado no capítulo 4, aplicar a força magnética, como indicado na seção 5.4 e fazer imagens de lapso de tempo para extrair cada velocidade única partícula (v) ea sua posição no capilar para obter o arquivo de calibragem. Este ficheiro deve conter a força aplicada como uma função da sua posição na zona de análise do capilar de acordo com a lei de Stokes, F = 6πRηv (R: raio da partícula).

7. Análise

  1. Use um software de "partícula rastreador" para obter arquivos de texto com as posições das partículas em cada quadro para todas as pilhas de imagens adquiridas, como indicado na seção 5. Using a imagem de frequência de aquisição pilha, calcular o deslocamento das partículas em função do tempo (por exemplo, Figura 5 e vídeo 4).
  2. Utilizando o ficheiro de calibração de força, converter as curvas de deslocamento para as curvas de conformidade (compliance total do material - J (t) - como uma função do tempo) de acordo com a fórmula de conformidade:
    figure-protocol-1
    o que dá a relação entre a deformação do material e tensão aplicada por uma sonda de partícula de raio R embutido, um meio viscoelástico homogéneo incompressível tal como anteriormente estabelecido por Schnurr e colegas de trabalho 19.
  3. Ajuste as curvas de conformidade com o modelo de fluência Burgers geral para materiais viscoelásticos e derivar os parâmetros viscoelásticos, J 0, J 1, η 0, η 1 para cada partícula ( Figura 6) de acordo com a fórmula Burgers:
    figure-protocol-2
    Nota: Esta análise fenomenológico foi anteriormente empregue para uma grande variedade de materiais, incluindo materiais biológicos, tais como biofilme para interpretar os dados de reologia macroscópicas 20-22.

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Resultados

Uma análise típica irá proporcionar a distribuição espacial dos parâmetros viscoelásticos na escala mícron sobre um biofilme viver sem perturbar o seu arranjo original. Os resultados típicos são mostrados na Figura 7, em que os valores de J 0 - o cumprimento elástico - são dadas como uma função do eixo-z ao longo da profundidade e do eixo-y ao longo de uma dimensão lateral do biofilme. Cada ponto corresponde a um cordão que a análise da curva de fluência tem proporcionado um valor J 0.

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Discussão

Esta partícula magnética semeadura e puxando experimento permitiu in situ mapeamento 3D dos parâmetros viscoelásticos de um biofilme crescendo em seu estado original. Esta abordagem revelou heterogeneidade mecânica da E. coli biofilme cultivadas aqui e deu pistas para apontar os componentes do biofilme que suportam as propriedades físicas de biofilme, o que sugere fortemente uma implicação fundamental da matriz extracelular e mais precisamente o seu grau de cross-linking.

O...

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Divulgações

Não temos nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi em parte apoiada por doações da Agence Nationale pour la Recherche, programa PIRIbio Dynabiofilm e do CNRS programa Risco Interdisciplinar. Agradecemos Philippe Thomen por sua leitura crítica do manuscrito e Christophe Beloin por fornecer a E. coli cepa utilizada neste trabalho.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tabela 1: Reagentes e células
Partículas magnéticasLife technologies14307DPartícula magnética micrométrica, 2.8 µ m de diâmetro
Ampicilina (Antibiótico)Sigma-AldrichA9518
Tetraciclina (Antibiótico)Sigma-Aldrich87128
Cepa bacteriana MG1655gfpFUGB, Institut Pasteur, FrançaProduz F pili em sua superfície, resistente à Ampicilina e tetraciclina.
Tabela 2: Capilares e tubos
Filtros para perfusão pediátricaProdimed-Plastimed6932002
Capilares Quadrados OcosMetal CompósitoCientífico 8280-100Fabricado em vidro borossilicato. Quadrado 0,8 mm x 0,8 mm
Tubo de peróxido de siliconeVWR international228-0512Diâmetro 1 mm
Tubo de peróxido de siliconeVWR international228-0700Diâmetro 3 mm
Tabela 3: Crescimento de biofilme
Solução de caldo de lisogenia (LB)Amresco-VWRJ106-10PKMeio padrão usado para cultivar bactérias.
Solução M63B1Meio mínimo padrão caseirousado para cultivar bactérias.
GlicoseSigma-AldrichG8270Usado para fazer meio M63B1 com 0,4% de glicose.
Tabela 4: Câmera Eletrônica
EMCCD   HamamatsuC9100-02
Controladorde aquecedor Instrumentos de precisão mundial300354
Gerador de funçõesAgilent technologies33210A
Amplificador de potênciacaseiroDá um sinal de corrente com amplitudes de até 4 A.
Bombas de seringaKd ScientificKDS-220
ObturadorVincent AssociatesUniblitz T132
Pinças magnéticasFeitas emDois pólos eletromagnéticos, cada um feito de uma bobina de cobre com 2.120 voltas de fio de cobre de 0,56 mm de diâmetro e núcleos de liga magnética macia (Supra50-Arcelor Mittal, França) em forma quadrada de acordo com o modelo mostrado em Figura 10. Os dois núcleos são montados no pólo norte voltado para o pólo sul, a fim de gerar uma força magnética em uma direção ao longo do comprimento do capilar. Consulte os detalhes da fiação da bobina em Figura 11.
Tabela 5: Óptica
Microscópio invertido Objetiva NikonTE-300
S Fluor x40 (NA 0.9, WD0.3)NikonEsta é uma objetiva de longa distância de trabalho que permite a observação do biofilme em profundidade.
Filtros de epifluorescência: 1) para fluorescência verde: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20  2) para fluorescência vermelha: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55Chroma1)#49020 2)#31002O deslocamento de partículas após a aplicação de força é registrado usando o bloco de filtro de fluorescência vermelho.
Tabela 6: Análise de imagem
ImageJNIH - plug-in
casa rastreador de partículas

Referências

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