Abordagens para testar os efeitos de drogas antipsicóticas (APDs) em Caenorhabditis elegans são demonstrados. Os ensaios estão descritos para testar efeitos de drogas sobre o desenvolvimento ea viabilidade e sobre a taxa de bombeamento da faringe. Estes métodos também são aplicáveis para as experiências de farmacogenética com outras classes de drogas que APD.
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Métodos para o estudo dos mecanismos de ação dos antipsicóticos Drogas em
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Resumo
Resumo
Caenorhabditis elegans é um organismo genético simples passíveis de grande escala para a frente e reverter telas genéticos e telas genéticos químicos. O C. elegans genoma inclui potencial antipsicótico (APD) alvos conservados em seres humanos, incluindo genes que codificam proteínas necessárias para a síntese de neurotransmissores e para a estrutura e função sináptica. Exposição APD produz atraso e / ou letalidade em nemátodos desenvolvimento de uma forma dependente da concentração. Estes fenótipos são causados, em parte, pela inibição induzida por TPA de bombeamento da faringe 1,2. Assim, o fenótipo de desenvolvimento tem uma base neuromuscular, tornando-o útil para estes estudos de neurolépticos. Aqui demonstramos procedimentos detalhados para testar efeitos APD sobre o desenvolvimento do nematóide e da faringe de bombeamento. Para o ensaio de desenvolvimento, os embriões são sincronizados colocado em meio de crescimento de nemátodos placas (NGM) contendo APD, e as fases de desenvolvimento de animals são, então, marcou diária. Para o ensaio de taxa de bombeamento da faringe, encenado animais adultos jovens são testados em placas NGM contendo APDs. O número de bombas da faringe por unidade de tempo é gravado, ea taxa de bombeamento é calculado. Estes ensaios podem ser utilizados para estudar muitos outros tipos de moléculas pequenas ou até mesmo moléculas grandes.
Introdução
Caenorhabditis elegans é um organismo genético simples passíveis de telas genéticos frente e verso em grande escala e telas genéticos químicos. C. elegans é sensível a um amplo espectro de compostos bioactivos e, por conseguinte, tem sido usado com sucesso para definir os mecanismos de acção de uma variedade de tais compostos. Por exemplo, os compostos bioactivos estudada usando farmacogenética vermes incluem agonistas de receptor de acetilcolina (por exemplo, levamisole, nicotina, morantel, pirantel e), anestésicos (p.ex. halotano), cafeína, os inibidores da colinesterase (por exemplo, aldicarbe, Lannate, e TRICLORFOM), flúor, relacionadas-GABA compostos (por exemplo, GABA e muscimol), ivermectina, paraquat, ésteres de forbol e drogas relacionados com a serotonina (por exemplo, serotonina e imiprimine) 3. Além disso, C. elegans foi usado para telas de pequenas moléculas de grande escala, permitindo a descoberta de novos compostos bioactivoss e identificação de alvos genéticas novas 4.
O C. elegans genoma inclui potencial antipsicótico (APD) alvos conservados em seres humanos, incluindo genes que codificam proteínas necessárias para a síntese de neurotransmissores e para a estrutura e função sináptica 5. Assim, C. elegans neurogenetics e métodos oferta neurobiologia para descobrir os mecanismos moleculares de ação dos APDs. Em nematóides, exposição DPA no início do desenvolvimento produz atraso do desenvolvimento, e em concentrações mais elevadas, a letalidade 2,6. Exposição APD durante a idade adulta produz fenótipos comportamentais. Por exemplo, a exposição a clozapina inibe locomoção e bombeamento da faringe e aumenta a postura de ovos 1,2,7.
Atraso de desenvolvimento e letalidade induzida pela APD são fenótipos poderosas para telas genéticos químicos em larga escala. Estes fenótipos são complexa na medida em que eles provavelmente têm mais do que um basi celulares e genéticass. Portanto, tais telas genéticas são esperados para produzir uma variedade de alvos de drogas indirectos. No entanto, o nosso laboratório tem conduzido telas de genes candidatos e uma tela de RNAi de todo o genoma para supressores de atraso e a letalidade induzida por TPA de desenvolvimento e foi recuperado com sucesso genes que codificam provavelmente alvos directos, incluindo a dopamina, a insulina, e os receptores de acetilcolina nicotínicos 2,8. Telas genéticos baseados em comportamentos induzidos-APD no adulto também levaram à identificação de alvos APD novela, e agora estamos validando alvos das telas tanto de desenvolvimento e comportamentais em mamíferos 7. Assim, uma abordagem genética química invertebrados para descobrir os mecanismos moleculares de ação dos APDs parece ser viável 5,8.
O C. elegans faringe é um órgão que inclui 20 neurônios, células musculares, 20 e 20 células acessórias, envolto por uma membrana basal. Semelhante ao coração dos mamíferos, a faringe é um autónomaª constantemente bombas alimentos a partir do ambiente externo 9. A inibição da taxa de bombeamento da faringe comprometendo a absorção de alimentos e, portanto, mutações ou drogas que inibem bombeamento da faringe causa atraso no desenvolvimento ou prender 9. APDs inibir a taxa de bombeamento da faringe, o que representa, em parte, por seus efeitos sobre o desenvolvimento e viabilidade 1,2. Aqui, usamos a clozapina APD atípico como um exemplo para demonstrar testes de drogas para o desenvolvimento de nematóides e da faringe de bombeamento.
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Protocolo
1. Developmental Delay / Letalidade Ensaio: The Wild-Type (N2) e Dois Mutant (Mut1 e Mut2) Cepas são testadas em três concentrações de clozapina em 12 poços da placa
- No dia 1, 2 ml de derramar NGM médio de 10 em cada cavidade de uma placa de 12 poços (cada poço com um diâmetro de 2 cm) e deixa-se endurecer sobre o banco, à temperatura ambiente (RT) durante a noite. No mesmo dia, escolher uma colônia de bactérias Escherichia coli OP50, infectar uma garrafa de 50 ml de solução de LB e cultura-lo em um shaker 37 ° C a 220 rpm de rotação durante a noite.
- No dia 2, transferir 20 ul de cultura bacteriana OP50 para o centro de cada NGM bem. Incubar as placas numa incubadora a 37 ° C, ou deixá-los à TA durante a noite para permitir que a camada de bactérias que crescem mais espessa.
- Adicione uma solução de estoque 80 mM de clozapina por dissolução de clozapina em DMSO (dimetilsulfóxido) solvente. Em seguida, faça uma solução de trabalho de 80 mL com a solução estoque diluída em 1,7 mM de ácido acético based na Tabela 1.
Nota: A solução de trabalho para uma droga em particular de interesse pode ser determinada fazendo uma série de provas preliminares de concentração para obter a concentração mais adequada para distinguir o tipo selvagem a partir dos mutantes. - Transferência de 80 uL de solução de trabalho clozapina na placa NGM semeado bem e agita-se a placa para permitir que a solução para distribuir uniformemente sobre a superfície. Esperar para a placa secar. Usar a placa para o ensaio, no mesmo dia ou colocá-lo em uma incubadora a 20 ° C até ser utilizado no dia seguinte.
Nota: A solução de trabalho é uma suspensão do fármaco, devido à baixa solubilidade da clozapina, especialmente em concentrações mais elevadas. Portanto, vortex do tubo antes de se transferir a solução para a placa de droga, a fim de garantir que a concentração de fármaco é preciso. - Lave vermes de uma placa 3,5 centímetros contendo muitos adultos grávidas com tampão M9 e então colocá-los para baixo em um tubo de 15 mla 2.000 rpm durante 1 min.
- Aspirar o sobrenadante. Adicionar 5 ml de solução de lixívia (NaOH: hipoclorito: DDH 2 O em 4:1:5) e perturbar os nematóides invertendo os tubos.
- Observar os animais até a metade deles são dissolvidos em cerca de 5 min. Girar os ovos a 2.000 rpm por 1 min.
- Aspirar o sobrenadante e adicionar 14 ml de tampão M9 rapidamente.
- Girar os ovos a 2.000 rpm por 1 min e aspirar o sobrenadante, deixando cerca de 100 mL solução. Vortex para suspender os ovos.
- Transferência de 2 ovos ul suspensa em M9 em uma placa NGM regulares para testar quantos ovos são transferidos. Ajustar o volume dos ovos em suspensão para assegurar que existem aproximadamente 30-35 ovos em cada transferência. Transferir 30-35 ovos de cada poço da placa de ensaio, e depois incubar numa incubadora a 20 ° C durante 24 hr.
- No primeiro dia do ensaio, marcar o número de ovos eclodidos. Ajuste o número total de animais eclodidos para 25/well por Picking fora os vermes suplementares, se necessário.
- Nos dias seguintes, observar os animais e pontuá-los a cada 24 horas. Estágio de desenvolvimento é pontuada com base no tamanho do animal, e a forma da vulva 11. O experimento dura 5-6 dias, com o efeito mais forte, tipicamente visto no terceiro ou no quarto dia.
- Introduza os dados em um arquivo de Excel e calcular a percentagem de animais em cada fase de desenvolvimento para todos os dias do experimento. Gerar gráficos com a função '100% Stacked Column 'no '2-D coluna' menu.
2. Pharyngeal Bombeamento Ensaio: Jovem Adulto Animais para o tipo selvagem e estirpes mutantes são pontuados em placas Clozapina Ensaio
- A placa de ensaio é feito seguindo o mesmo protocolo utilizado para o ensaio de atraso / letalidade desenvolvimento.
- Escolha 50 animais L4 para cada estirpe de placas NGM semeadas 24 horas antes do ensaio e incubar os vermes, a 20 ° C.
- Escolha 10 animais para uma assay placa também. Em seguida, escolher 10 animais para o próximo bem a cada 15-20 min.
- Depois de os animais no primeiro poço foram expostas ao fármaco durante 30 minutos, iniciar o ensaio, observando bombeamento da faringe sob um microscópio de dissecção e marcar as bombas durante 20 seg 9. Uma vez bombeamento da faringe é marcado, pegar o verme para fora do prato.
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Resultados
1. Atraso no desenvolvimento / resultado do ensaio de letalidade
Um resultado típico para o ensaio de atraso / letalidade no desenvolvimento, é demonstrada nas Figuras 1a e 1b. Quando os animais do tipo selvagem no grupo de controle têm crescido para a fase adulta gravídico (Figura 1a), do tipo selvagem animais expostos à clozapina ainda estão nos estágios larvais jovens ou estão mortos (Figura 1b). Figura 1c mostra um resultad...
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Discussão
Aqui, descrevemos métodos para testar os efeitos de APDs sobre o desenvolvimento e comportamento de C. elegans. DMSO ou o etanol é usado para dissolver a clozapina, uma vez que o fármaco é relativamente insolúvel em água. Porque os solventes foram relatados para afectar C. elegans biologia 12, grupos de controle de etanol-alone DMSO-alone ou são essenciais. A concentração mais elevada de DMSO utilizada nos ensaios é superior a 3%, o que não tem um efeito óbvio sobre C. elegans desen...
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Divulgações
Os autores declaram que não há conflito de interesse envolvidos.
Agradecimentos
O trabalho foi financiado pelo NIH um prêmio Desenvolvimento Scientist Clínica K08NS002083, um Grant Instituto de Pesquisa Shervert Frazier, e uma Investigator Award NARSAD Young para Edgar A. Buttner.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Clozapina | Sigma | C6305 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Ácido acético (HAC) | Fisher | BP2401 | |
| Hidróxido de sódio (NaOH) | EMD | SX0590-13 | |
| Hipoclorito | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Centrífuga 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 | |
| Agitador de incubadora | New Brunswick Scientific | M1246-0006 | |
| Incubadora de baixa temperatura 815 | Precision Scientific | J1790-1B | |
| Estereomicroscópio | Olympus | SZX12 | |
| Placa de Petri 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 | |
| 12 poços Placa de cultura de tecidos | BD Falcon | REF 353043 |
Referências
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- Karmacharya, R., et al. Behavioral effects of clozapine: involvement of trace amine pathways in C. elegans and M. musculus. Brain Res. 1393, 91-99 (2011).
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Reimpressões e permissões
