Artigo de método

Indução de carcinoma da bexiga invasivo de células transicionais em imunológico intacto Humanos MUC1 Ratos transgênicos: um modelo de desenvolvimento Imunoterapia

DOI:

10.3791/50868

⸱

30 de outubro de 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of California, Davis, 2Comparative Pathology Laboratory, UC Davis School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 3Merck Serono Research, Merck KGaA, Darmstadt, Germany

Neste artigo

Resumo

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Um N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina induzida pelo modelo de cancro da bexiga foi desenvolvido em mucina humana 1 (MUC1) ratinhos transgénicos para o fim de testar a MUC1-imunoterapia dirigida. Após a administração de uma vacina de péptido MUC1-alvo, uma resposta de linfócitos T citotóxicos para MUC1 foi confirmada por medição dos níveis de citocinas no soro e da actividade específica da célula T.

Resumo

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A modelo pré-clínico de câncer de bexiga invasivo foi desenvolvido em mucina humana 1 (MUC1) camundongos transgênicos (MUC1.Tg) com a finalidade de avaliar a imunoterapia e / ou quimioterapia citotóxica. Para induzir o cancro da bexiga, C57BL / 6 (tipo selvagem e MUC1.Tg) foram tratados oralmente com o agente cancerígeno de N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina (OH-BBN) a 3,0 mg / dia, 5 dias / semana durante 12 semanas. Para avaliar os efeitos de OH-BBN no perfil de citocinas no soro durante o desenvolvimento do tumor, sangue foi coletado por meio de hemorragias submandibular antes do tratamento ea cada quatro semanas. Além disso, uma vacina de péptido MUC1-alvo e um placebo foram administrados a grupos de ratinhos por semana durante oito semanas. Multiplex fluorométricos immunoanalyses microbead de citocinas no soro durante o desenvolvimento do tumor e após a vacinação foram realizadas. No término, o interferão gama (IFN-γ) / interleucina-4 (IL-4) análise ELISpot para MUC1 resposta imunitária das células T específicas e as avaliações histológicas do tipo de tumore grau foram realizados. Os resultados mostraram que: (1) a incidência de câncer de bexiga em ratos tipo tanto MUC1.Tg e selvagem foi de 67%, (2) carcinomas de células transicionais (TCC) desenvolvidos na proporção de 2:1 em relação ao carcinoma de células escamosas (SCC) , (3) as citocinas inflamatórias aumentou com o tempo, durante o desenvolvimento do tumor, e (4) a administração do péptido de vacina induz um perfil de citocinas Th1 soro polarizado e uma resposta de células T específica MUC1. Todos os tumores em MUC1.Tg camundongos foram positivos para MUC1 expressão, e metade de todos os tumores em camundongos tipo MUC1.Tg e selvagens foram invasivo. Em conclusão, utilizando uma abordagem de equipe, através da coordenação dos esforços dos farmacologistas, imunologistas, patologistas e biólogos moleculares, desenvolvemos um modelo de camundongo transgênico imune intacto de câncer de bexiga que expressa hMUC1.

Introdução

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O câncer de bexiga é o quarto tipo mais comum de câncer ea oitava causa de morte por câncer em homens americanos. Nos Estados Unidos, estima-se 72.500 novos casos e 15.000 mortes por câncer de bexiga são esperados entre homens e mulheres juntos em 2013 1. A incidência de câncer de bexiga é aproximadamente três vezes maior nos homens em relação às mulheres. Nos Estados Unidos, os carcinomas de células transicionais (TCC) são responsáveis ​​por mais de 90% dos casos, enquanto os carcinomas espinocelular (CEC) têm uma incidência de menos de 2% 2. A taxa de sobrevida em 5 anos relativo global para papilar TCC é de 91,5% em comparação com apenas 30,9% para o SCC 2. Embora TTCs papilares não invasivos representam aproximadamente 75% dos casos no momento do diagnóstico, mesmo com o tratamento de mais de 50% dos pacientes experimentam a recorrência dentro de 5 anos, com um máximo de 30% destes pacientes a progredir para doença invasiva do músculo 3,4 . Regimes de tratamento típicas para inv não-músculodoença ASIVE incluem a ressecção transuretral (TUR), seguido de quimioterapia intravesical. Em pacientes com Ta de alto grau ou tumores T1, um TUR repetição pode ser realizada antes da quimioterapia 3,4. Para os pacientes com recidiva Ta de baixo grau ou de alto grau de Ta ou lesões T1, TUR seguido por quimioterapia adjuvante, imunoterapia ou na forma de Bacilo Calmette-Guerin (BCG), podem ser utilizados 3,4. Intravesical BCG tem sido mostrado para ser superior ao intravesical mitomicina C no que diz respeito ao tempo de recorrência 5. Para doença invasiva muscular T2, cistectomia radical com ou sem quimioterapia neoadjuvante é o curso de tratamento recomendado 3. Em pacientes com SCC, cistectomia radical parece ser o tratamento mais eficaz 6. Dadas as altas taxas de reincidência, apesar dos melhores tratamentos disponíveis, existe claramente uma necessidade de terapias novas e mais eficazes para o câncer de bexiga.

Ampliação de novos immunotherapies para bladdcâncer er é uma abordagem possível, que podem ser uma esperança para prolongar a sobrevivência livre de doença. Historicamente, a BCG tem sido a única imunoterapia para o câncer de bexiga. O seu mecanismo de acção está pensado para envolver a indução não específica de uma resposta imunitária de tipo T helper 1 (Th1), através de aumento dos níveis de interleucina-2 (IL-2) e interferão gama (IFN-γ) 4. Celular, ou a imunidade de Th1, é crítico na imunoterapia do cancro como humoral, ou Th2, a imunidade nunca foi demonstrado ser eficaz contra tumores sólidos, com excepção de anticorpos dirigidos contra os receptores do factor de crescimento de 7. Na tentativa de melhorar os benefícios da BCG monoterapia, IFN-α 2B/BCG combinação de imunoterapia foi avaliada em um ensaio clínico de fase II com resultados inconclusivos 8. Uma abordagem alternativa para a imunoterapia para o câncer de bexiga pode ser alvo antígenos associados a tumores (TAAs), a identificação de que fez imunoterapia do cancro mais específico 7 .

Um tal AT é a mucina 1 (MUC1), que é uma glicoproteína de superfície celular, em muitos cancros superexpresso de células epiteliais, tais como de bexiga, mama, pulmão, e cancro do pâncreas 9,10. A expressão e modificação da proteína MUC1 também é substancialmente alterada durante a carcinogénese, de tal forma que expõe underglycosylation sequências antigénicas de aminoácidos conhecidas como número variável de repetições em tandem (VNTR) no núcleo do péptido. Enquanto MUC1 é um auto-molécula, essas regiões imunodominantes VNTR não são normalmente expostos devido a uma extensa glicosilação e, assim, eles são vistos pelo sistema imune como 11,12 estrangeira. Os linfócitos T citotóxicos (CTLs) que reconhecem especificamente MUC1 epitopos tenham sido isolados a partir dos nódulos linfáticos drenantes tumores de pacientes de cancro da mama 13, bem como do sangue e da medula óssea de doentes com mieloma 14,15, tornando MUC1 um alvo potencial para um resposta imune celular. Os VNTRs imunodominantes da underglycosylateforma d de MUC1 são reconhecidas pelas CTLs, resultando na destruição de células tumorais 16-19. As respostas imunes celulares e / ou humorais nativas para MUC1 cancerosas são, no entanto, não é suficientemente forte para eliminar tumores. Para aumentar a resposta imune fraca já existente para MUC1, os péptidos imunodominantes sintéticos podem ser introduzidas através de vacinação para gerar uma resposta de CTL forte o suficiente para ser de benefício clínico 18,20. Uma vacina lipossomal MUC1 já foi mostrada para aumentar a sobrevivência em pacientes com cancro do pulmão 21,22, gerar CTL capazes de matar as células do tumor MUC-1-positivos, e produzir uma resposta de citocinas tipo Th1 polarizadas 23,24. Com um nível elevado de expressão de MUC-1 9,11,25, cancro da bexiga é um candidato lógico para testar a MUC1 dirigida imunoterapia 26,27. Além disso, a MUC1 tem potencial como fator prognóstico no câncer de bexiga 28, MUC1 expressão em TCC está significativamente associado com o estágio e grau, e metastático TCCFoi demonstrado que continuam a expressar MUC1 29.

A fim de avaliar o potencial utilidade da imunoterapia MUC1 dirigida no cancro da bexiga, foi desenvolvido um MUC-1 humano intacto imune (hMUC1)-expressando Congênicos transgénico modelo de cancro da bexiga de rato (MUC1.Tg) no C57BL / 6 do fundo 30. MUC-1 humana expressa-se como uma auto-proteína sob o controlo do seu próprio promotor, resultando num padrão de expressão do tecido consistente com a observada em humanos 30,31. Os ratinhos foram induzidos com a bexiga cancerígeno conhecido N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina (OH-BBN), 32, e, em seguida, os tumores resultantes foram avaliados quanto à expressão hMUC1 e tipo de tumor e grau. Para avaliar o efeito do agente cancerígeno sobre os níveis de citocinas Th1/Th2, durante o desenvolvimento do tumor, amostras de soro foram recolhidas periodicamente para análise multiplex. Os ratinhos foram, em seguida, tratou-se com uma vacina de péptido MUC1-alvo, e a citoquina de soro e as respostas imunes foram avated por multiplex fluorometric imunoensaio microbead e ELISpot.

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Protocolo

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Todos os estudos em animais e experimentos foram conduzidos em um protocolo aprovado pela University of California, Davis Institutional Animal Care e do Comitê Use Consultivo Administrativo.

1. MUC1.Tg Rato Breeding e Propagação

  1. O Davis Programa de Biologia Rato UC (MBP) raças tipo camundongos C57BL / 6 machos selvagens com heterozigotos MUC1.Tg C57BL / 6 do sexo feminino para estabelecer a nossa colônia de reprodução. MUC1.Tg filhotes são entregues para os estudos, conforme necessário.
  2. Pessoal MBP cortar os dedos do filho em um padrão definido (0-99) para identificação mouse, e quando aplicável clipe da cauda. O dedo do pé ou o tecido da cauda é processado para a genotipagem utilizando a extracção de ADN padrão e Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR), análise.

2. Desenho do Estudo

  1. Estudar trabalhos de grupo
    1. Pesar cada rato separadamente em uma balança e registrar o peso em gramas de cada mouse.
    2. Esta parte do processo de invOlvés a metodologia e desenho do estudo. Para a primeira parte do estudo, atribuir pareados por idade camundongos tipo MUC1.Tg e selvagem para começar a indução de câncer de bexiga com OH-BBN. Eutanásia ratinhos 8 semanas após a última dose de OH-BBN para confirmar a presença de tumores de bexiga por histologia.
    3. Para a segunda parte do estudo, os ratinhos aleatoriamente MUC1.Tg macho para um número adequado de tratamento e grupos de controlo. Estes ratinhos ser monitorizadas as citocinas no soro e as respostas imunitárias de células T durante a indução e desenvolvimento de tumores, e, em seguida, no final do estudo 8 semanas após a última dose de OH-BBN.
  2. Indução de cancro da bexiga
    1. OH-BBN é uma substância cancerígena e altamente tóxica. Por favor, leia e siga as orientações da ficha de segurança ao manusear e armazenar este produto químico.
    2. Calcular a concentração da solução de dosagem necessária para administrar a dose apropriada (3 mg), num volume de 100 ul, a cada rato com base nos pesos médios e number de ratinhos em cada grupo de estudo e.
    3. Dilui-se a OH-BBN em etanol a 100%. Levar a concentração final de 30 mg / ml com água estéril. O final de etanol: concentração de água deve ser de 20:80, v / v
    4. Administrar o OH-BBN oralmente utilizando aço inoxidável, 20 g de agulhas de gavage diárias, 5 dias / semana, durante 12 semanas, com base na atribuição de grupo de tratamento inicial com a idade de 8 semanas.
  3. Tratamentos de vacinação
    1. Reconstituir cada frasco de vacina peptídeo liofilizado em 600 ml de solução salina 0,9% estéril e completamente ressuspender desenhando a solução através de um 0,5 polegadas 27 agulha G 6x. Usando salina, ajustar a concentração de modo que a dose desejada é entregue num volume de 100 ul.
    2. Começando na semana 20, após a última dose de OH-BBN, administrar a vacina numa base semanal, para um ciclo de oito semanas por injecção subcutânea de 100 ul usando uma agulha 25 G (número de semanas corresponde à idade dos ratinhos).
  4. Monitoramento e Coleta de Amostras
    1. Pesar todos os ratinhos e palpar para a presença de novos tumores uma vez por semana. Eutanásia quaisquer ratinhos que perderam ≥ 20% do peso do corpo, ou se existem tumores palpáveis, sangue na urina, e / ou retenção urinária.
    2. Antes da primeira dose de OH-BBN e depois com intervalos de 4 semanas depois, recolher o sangue total através de sangrias submandibulares. Recolher o sangue em tubos de coagulação de soro Microtainer (BD) e 30 min para permitir a coagulação do sangue.
    3. Centrifugar as amostras de sangue numa microcentrífuga a 3500 xg durante 10 min. Transferir cuidadosamente o soro para estragar criotubos tampão usando uma pipeta.
    4. Congelamento flash em azoto líquido e armazenam-se a -80 ° C até análise posterior por multiplex.
    5. Oito semanas após a última dose de OH-BBN, sacrificar todos os animais por asfixia CO 2.
    6. Coloque cada rato em uma placa de dissecção e fechar por quatro membros.
    7. Utilizando uma pinça e tesouras, make uma incisão horizontal na região abdominal superior. Inserir a tesoura na incisão entre a camada epidérmica e parede abdominal e separar cuidadosamente a pele do tecido subjacente com a ajuda de fórceps.
    8. Adicione uma incisão vertical da incisão horizontal seguindo o eixo central em direcção à extremidade anterior do rato. Separe a pele da caixa torácica, e usando uma seringa de 1 ml e uma agulha de 22 G, perfure o coração e coleta de sangue com um empate suave e constante.
    9. Consulte o passo 2.4.3 e 2.4.4 para o isolamento e armazenamento de soro.
    10. Utilizando uma pinça e tesoura, cortar e descascar o resto da camada epidérmica. Corte através da parede abdominal e peritônio e retire assepticamente tumor da bexiga por imuno-histoquímica (IHQ) e Western blot.
    11. Colete baço para análise da viabilidade celular (Muse) e ELISpot. Para IHC, lugar bexiga espécime tumor em cassete tecido e fixar em formol durante a noite gelada à temperatura ambiente.
    12. No dia seguinte, substitui o formol com etanol a 70%.
    13. Para a análise de Western blot de tumor, homogeneizar o tumor, adicionar tampão de extração de proteínas além de inibidores de protease Parada e transferir para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
    14. Vortex para 30-60 segundos e manter em gelo por 5 min. Flash congelar em nitrogênio líquido e descongelamento na água ambiente. Repetir o processo de vórtice, a congelação e descongelação duas vezes.
    15. Centrifugar as amostras a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C e transfere-se os extractos celulares para novos tubos etiquetados.
    16. Quantificar a concentração através da realização de um ensaio de proteína ácida bicinconínico (BCA) para medições de proteínas. Armazenar as amostras a -80 ° C até estar pronto para a análise de Western blot.

3. Biologia Molecular / Western

Os seguintes procedimentos foram realizados para verificar a expressão de MUC-1 no tecido de tumor da bexiga do rato utilizando o protocolo padrão de Western blot (dados não mostramn).

  1. Separa-se os extractos de proteína por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) e em seguida, transferir para uma membrana de PVDF utilizando um aparelho semi-secos.
  2. Bloquear a membrana da proteína transferida com 5% de leite desnatado em 0,1% de Tween-20 em tampão fosfato salino (PBS-T), a pH 7,4, durante 1 hora num agitador orbital à temperatura ambiente.
  3. Incubar a membrana durante 1 hora à temperatura ambiente num agitador com o anticorpo anti-MUC-1 ou anti-β-actina em 0,1% PBS-T.
  4. Lava-se a membrana por meio de decantação da solução e adicionando 0,1% de PBS-T. Redemoinho da membrana no agitador durante 5 minutos e decantar. Repita esta etapa duas vezes.
  5. Incubar a membrana durante 1 hora à temperatura ambiente com peroxidase de rábano (HRP) conjugado com anticorpo secundário.
  6. Lave 3x (consulte o passo 3.4).
  7. Siga o protocolo para o Chemiluminesence kit avançado (ECL) para ativar e ler o fluorografia.

4. Multiplex Fluorimétrica Imunoensaio Microbead

  1. Configuração e Cálculos
    1. Usando um mapa da placa de 96 poços, ceder espaços em branco, padrões, controles e amostras nas cavidades. Calcular o número e volume de analitos, anticorpos de captura e estreptavidina-Ficoeritrina (SA-PE), necessária para o ensaio.
    2. Permitir que todos os tampões e diluentes para equilibrar à temperatura ambiente. Preparar os padrões e as diluições da amostra, utilizando uma placa de 96 poços em branco.
    3. Reconstituir a matriz de soro padrão e liofilizada de acordo com o protocolo e fazer uma série de diluições 1:05 do padrão com o diluente apropriado na placa de 96 poços do fabricante. Para os poços em branco, utilizar o diluente apropriado.
    4. Dilui-se todos os controlos e as amostras desconhecidas 1:02 no diluente apropriado no resto da placa de 96 poços.
    5. Para a mistura de grânulo, pipetar o volume necessário de o diluente apropriado em um tubo de 15 ml. Vortex de cada frasco talão durante 20 seg e pipetar o volume necessário de cada analito para o tubo de 15 ml.
    6. Proteja sempre as contas de luz, para evitar a fotodegradação. Não colocar a placa de 96 poços em material absorvente para evitar a perda de amostra através de capilaridade.
  2. Protocolo de Ensaio
    1. Prewet a placa de fundo de filtro de 96 poços com 200 ul de tampão de ensaio e para permitir a imersão completa do filtro. Suavemente drenar através do aparelho de vácuo de placas de 96 poços e secar o fundo da placa com uma toalha de papel.
    2. Usando uma pipeta multicanal, pipeta 25 ul de soro padrão aos poços designados para os espaços em branco e padrões e pipeta de 25 mL de tampão de ensaio aos poços designados para os controlos e amostras.
    3. Pipetar 25 mL do branco, as normas, controles e incógnitas para os respectivos poços atribuídos. Vortex a mistura de esferas durante 20 segundos e transferir os grânulos a um reservatório.
    4. Pipetar 25 ul da mistura de contas para cada poço. Cobrir a placa com uma folha de alumínio ou de uma tampa de placa opaco para proteger da luz.
    5. Agitar a placa a 500 rpm durante duas horas à temperatura ambiente num agitador de placas. Drenar e lavar a placa com 200 ul de 0,1% de Tween 20 em tampão fosfato salino (PBS-T), duas vezes. Escorrer e secar.
    6. Preparar a solução de anticorpo de captura. Pipetar a quantidade necessária de 0,1% em PBS-T e anticorpo de captura num tubo ml e 15 vórtice durante 10 seg. Transferir a mistura de anticorpo de captura a um reservatório e uma pipeta de 25 uL em cada poço.
    7. Agitar a placa a 500 rpm durante uma hora à temperatura ambiente num agitador de placas. Drenar e lavar a placa com 200 ul de 0,1% de PBS-T por duas vezes. Escorrer e secar.
    8. Prepare a solução de SA-PE. Pipete o volume requerido de 0,1% de PBS-T e SA-PE num tubo ml e vortex durante 10 seg 15. Transferir a solução para um reservatório e uma pipeta de 25 uL em cada poço.
    9. Agitar a placa a 500 rpm durante 30 minutos à temperatura ambiente num agitador de placas. Drenar e lavar a placa com 200 ul de 0,1% de PBS-T por duas vezes. Escorra e bmuito seco.
    10. Pipete 100 pi de 0,1% de PBS-T e agitar num agitador de placas a 500 rpm durante pelo menos dois minutos para ressuspender as esferas. Ler e analisar a placa na máquina LX200 Luminex.

5. IFN-γ/IL-4 ELISpot Elaboração e Análise

  1. Em uma cabine de segurança biológica, processar os baços a 100 tecido Nylon mM peneiras em 5 ml de fosfato estéril, solução salina tamponada (PBS) em placas de Petri estéreis. Camada de esplenócitos em 3 ml de meio de separação de linfócitos em tubos estéreis de 15 ml.
  2. Centrifugar os tubos a 600 xg durante 15 minutos para separar os linfócitos das células vermelhas do sangue. Transferir as camadas de linfócitos acima do gradiente para novos tubos estéreis de 15 ml.
  3. Ajustar o volume para 10 ml com PBS estéril. Centrifugar a suspensão a 600 xg durante 10 min para sedimentar as células.
  4. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de PBS para a viabilidade celular e contar com a Musaanalisador. Siga o Muse Conde & protocolo Kit de Viabilidade.
  5. Fazer diluições seriadas dos linfócitos em 1,5 ml de parafusos de fixação em tubos de centrífuga de factores de diluição de 1:10, 1:20 e 1:40 (ou conforme o necessário) em Contagem & Reagente Viabilidade (mínimo volume total de 300 ul). Pipeta cada diluição cima e para baixo várias vezes para misturar e analisar sobre o Muse.
  6. Prepare um mapa da placa das amostras e as condições para a placa ELISpot. Preparar a placa de ELISpot de acordo com o protocolo do fabricante e pipeta de 100 uL de meio, o péptido (10 ug / ml), ou péptido (10 ug / ml) a cada poço precipitação.
  7. Pipete 100 pi da suspensão de células, proporcionando 1,0 x 10 6 células para cada poço da placa e incubar a 37 ° C durante a noite.
  8. Seguir o protocolo do fabricante para o ensaio ELISPOT. Analisar a placa ELISpot desenvolvido utilizando um microscópio de dissecação.
  9. Quantificar os resultados por meio da contagem do número de manchas coloridas corresng para cada substância, em cada poço. As manchas correspondendo ao número de células formadoras de mancha (SFC) em cada poço.

6. Imuno-histoquímica (IHQ) e Hematoxilina & Eosina (H & E) Coloração

  1. Aqui o tecido do tumor da bexiga conservados, tal como descrito acima (secção 2.4.11), incorporar em parafina e secção passo de 4 mm para análise imuno-histoquímica.
  2. Realizar IHC utilizando um anticorpo que reconhece a proteína MUC1 região de MUC1 de repetições em cadeia. Usar o animal Kit peroxidase Investigação para minimizar a reactividade do anticorpo secundário rato com imunoglobulina endógena presente no tecido.
  3. Realizar coloração H & E, utilizando protocolos padrão.

7. Métodos Estatísticos

Para o Multiplex Fluorimétrica Imunoensaio Microbead, use o teste t de Student bicaudal para comparar a média de concentrações séricas de citocinas entre os grupos de tratamento e controle observado. Para ELISpot, usar um único way ANOVA para comparar o local formando colônias entre o controle da mídia, mexidos peptídeo e grupos de peptídeos. Use teste de comparações múltiplas de Dunnett para diminuir a probabilidade de um resultado falso-positivo. Um valor de p ≤ 0,05 é considerado significativamente diferente de todas as análises.

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Resultados

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A avaliação pré-clínica dos efeitos de novas imunoterapias e combinações no cancro da bexiga, exige o desenvolvimento de um modelo animal adequado. Em nosso modelo de camundongo transgênico, a indução com o carcinógeno químico OH-BBN resultou em uma alta taxa de incidência de câncer de bexiga predominantemente TCC com algum SCC, que é semelhante ao câncer de bexiga em humanos. Para determinar a histologia do tumor, estado de MUC1 expressão e a resposta imunitária ao tratamento com a vacina peptídica, MUC1.Tg 21 e 18 rat...

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Discussão

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A indução bem-sucedida de carcinoma de células transicionais da bexiga e escamosas invasivo em ratos MUC1.Tg humanos oferece um modelo pré-clínico para o desenvolvimento de imunoterapia. Estudos imunoteraptico requerem o uso de um modelo espontâneo intacto, imune a fim de avaliar a resposta inflamatória a progressão do tumor ao longo do tempo, bem como a resposta imunitária a imunoterapia. Em um modelo de desenvolvimento de tumores espontâneos, o microambiente do tumor permanece intacta e os tumores se desenvolvem a uma...

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Divulgações

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DPV, GTW, SMG, CJK, AMG, e GKH declaram que não há interesses conflitantes. MWD é o investigador principal de um subsídio recebido da Merck KGaA, e MW é um funcionário da Merck KGaA.

Agradecimentos

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Os autores gostariam de agradecer ao Programa de Biologia Rato Davis UC para a reprodução dos ratos. Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagente 
N-butil-N-(4-hidroxibutil)-nitrosamina (OH-BBN)TCI AmericaB0938
20 G Agulhas de GavagemPopper Sons, Inc.7921Vacina
PeptídicaN / AN / Aagente investigacional
BD MicrotainersBD365957
de tecidoSimportM490-12
10% Forma tamponada neutraFisher ScientificSF100-4
Lysis BufferPierce87787
Halt Protease & Coquetel de inibidor de fosfataseThermo Scientific78444
Pierce BCA Protein Assay KitPierce23225
Mouse Cytokine 20plex KitInvitrogenLMC006
Contas de microesferas magnéticasLuminexMC100xx-01xx é a região do grânulo
Anti-mouse TNF- Anticorpo de capturaBD Pharmingen551225
Anticorpo de detecção de TNF anti-ratoBD Pharmingen554415
Anticorpo de captura IFN anti-ratoAbcamab10742
Anti-rato IFN- Anticorpo de detecçãoAbcamab83136
PBS, pH 7,4SigmaP3813-10PAK
Tween-20FisherBP337-500
Tampão de ensaioMilliporeL-MAB
Placas de filtro padrãoMilliporeMXM8070
Multi-screen HTS 96wellda Cytokine MilliporeMSBVN1210
SA-PEPeneiras
BD352360
Meios de separação de esplenócitosLonza17-829E
TNF- /IL-4 Placas ELISpotR& D SystemsELD5217
anticorpo monoclonal anti-MUC1 de coelhoEpitomics2900-1
anticorpo monoclonal anti-actina de cabraSigmaA1978
Anticorpo HRP anti-coelhoPromegaW401B
Anticorpo HRP anti-rato de cabraSanta Cruz Biotechnology, Inc.SC-2005
Membrana PVDFBioRad162-0174
Mini Protean TGX Géis Pré-moldadosBioRad456-1083
Muse Count & Kit de ViabilidadeMilliporeMCH100104
MUC1 AnticorpoBD Pharmingen550486IHC
Anticorpo Animal Research PeroxidaseKit DakoK3954Coloração IHC
Equipamento e Software
Millipore Aparelho de vácuo de placaMilliporeMSVMHTS00
Luminex Lx200Millipore / Luminex40-013Fabricado pela Luminex, distribuído pela Millipore
Luminex Xponent SoftwareMillipore / LuminexN/AVersão 3.1; incluído com o Luminex Lx200
Milliple Analyst SoftwareMilliplex / VigeneTech40-086Versão 5.1
Muse Cell AnalyzerMillipore0500-3115
Muse SoftwareMilliporeN/AVersão 1.1.0.0; incluído com
Microscópio de DissecaçãoUnitronZ730
Graphpad Prism SoftwareGraphpad Software Inc.N / AVersão 5.1
Mini Protean Tetra Cell Gel aparelhoBioRad165-8001
Trans Blot SD Cell e PowerPacBioRad170-3849
de aço inoxidável de tecido de nylon de 100 m do SA10044 o

Referências

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