As proteínas podem adotar uma estrutura nativa ou se dobrar em amilóide insolúvel. As condições que favorecem a via de desdobramento levam à formação de diferentes tipos de fibrilas amilóides. Os métodos descritos aqui permitem a rápida conversão de proteínas nativas em amilóide in vitro.
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Artigo de método
Geração rápida de amilóide a partir de proteínas nativas in vitro
Neste artigo
Resumo
Resumo
As proteínas realizam tarefas cruciais nos organismos, exercendo funções provocadas a partir de suas dobras tridimensionais específicas. Embora as estruturas nativas dos polipeptídeos cumpram muitos propósitos, agora é reconhecido que a maioria das proteínas pode adotar uma montagem alternativa de amilóide rica em folha beta. As fibrilas amilóides insolúveis são inicialmente associadas a várias doenças humanas, mas são cada vez mais mostradas como atores funcionais que participam de vários processos celulares importantes. Além disso, a amiloide depositada nos tecidos do paciente contém componentes não proteicos, como ácidos nucléicos e glicosaminoglicanos (GAGs). Esses cofatores podem facilitar a formação de amilóide, resultando na geração de diferentes tipos de precipitados insolúveis. Aproveitando nossa compreensão de como as proteínas se dobram incorretamente por meio de um estágio intermediário de precursor amilóide solúvel, desenvolvemos um método para converter proteínas nativas em fibrilas amilóides in vitro. Essa abordagem permite preparar amilóide em grandes quantidades, examinar as propriedades do amilóide gerado a partir de proteínas específicas e avaliar as mudanças estruturais que acompanham a conversão.
Introdução
As proteínas são as macromoléculas biológicas mais abundantes presentes em todos os tipos de células. Eles ocorrem em uma grande variedade de tamanhos, estruturas e modificações pós-traducionais e cumprem uma enorme gama de funções biológicas importantes quando em suas formas nativas. Mais de duas dúzias de polipeptídeos aberrantes foram implicados em inúmeras condições patológicas humanas, como doença de Alzheimer, doença de Parkinson e diabetes tipo 21-4. As proteínas terminais mal dobradas acumulam como fibrilas amilóides os agregados estáveis insolúveis que ocorrem extracelularmente ou intracelularmente.
Apesar da implicação de proteínas específicas em certas doenças, evidências crescentes apóiam a noção de que todos os polipeptídeos têm propriedades intrínsecas que permitem a transformação amilóide. Uma pesquisa de sequência genômica completa identificou o "amiloma", pelo qual fragmentos propensos a amilóide constituem cerca de 15% de todos os segmentos peptídicos codificantes de E. coli a humanos5. Assim, um número crescente de amilóides funcionais, que participam de vários processos celulares importantes, foi descoberto nos últimos anos. Por exemplo, as bactérias montam amilóides para formar biofilme e estruturas de esporos que são críticas para sua sobrevivência e patogênese6-9. Os hormônios peptídicos formam depósitos amilóides durante o armazenamento dentro dos grânulos secretores de mamíferos antes de serem liberados, implicando ainda que a forma amilóide da proteína pode servir a funções biológicas benéficas6,10,11. Além disso, as proteínas também podem se reunir em fibrilas amilóides para transmitir sinais celulares críticos12,13.
Por muitos anos, os amilóides mais estudados são preparados a partir de peptídeos individuais associados a doenças humanas, como o beta-amilóide ou o peptídeo príon. Esses peptídeos geralmente carecem de estrutura bem definida e formam espontaneamente amilóide em solução ao longo do tempo, um processo mediado por um intermediário parcialmente mal dobrado que serve como precursor da amilóide insolúvel. O precursor da amiloide também é chamado de oligômero de proteína solúvel, que é raro e instável quando gerado a partir de peptídeos naturais14,15. No entanto, conforme descrito anteriormente, quase qualquer proteína, em princípio, pode adotar a conformação amilóide sob as condições apropriadas. Recentemente, estabelecemos um método para preparar oligômeros solúveis estabilizados de proteínas nativas, que prontamente formam amilóide na presença de vários cofatores16. As fibrilas amilóides resultantes refletem a natureza complexa dos agregados de dobramento incorreto da proteína terminal17,18. Aqui usamos o termo amilóide somente de proteína para nos referir às fibrilas proteicas sem cofatores e amilóide híbrida para as fibrilas contendo componentes não proteicos.
Anteriormente, vários métodos foram desenvolvidos para gerar amilóide in vitro aplicando condições conhecidas por favorecer o desdobramento de proteínas, como alta temperatura, ambiente hidrofóbico e variaçõesde pH 19-23. No entanto, eles se associam a vários problemas, como baixa eficiência, dobra reversível, grandes variações de lote ou cinética lenta. A abordagem descrita aqui é reprodutível, fácil de escalar e permite controlar com precisão o tempo e a condição da conversão amilóide.
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Protocolo
1. Preparar o buffer MES
- Use tampão MES (ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico 0,1 M e NaCl 0,9 M) para preparar oligômeros de amilóide somente de proteína e oligômeros de proteína solúvel estabilizados. Pesar 1,95 g de MES e 5,27 g de NaCl. Adicione H2O e ajuste o pH para 4,7. Perfazer o volume final de 100 ml. Conservar a 4º C até 6 meses.
2. Prepare amilóide somente de proteína diretamente de proteínas nativas
- Pesar a proteína de escolha (qualquer proteína ou peptídeo nativo) e reconstituir a 10 mg/ml em tampão MES.
- Incubar a 65 ºC em banho-maria durante 4 horas. No final do período, o precipitado branco é visível em solução.
- Neutralize a amostra com 10% (v/v) de Tris-HCl (1 M, pH 10,5).
- Dialise a proteína em um de diálise durante a noite para trocar para o tampão desejado para análise posterior.
- Uma amostra de controle de proteína nativa pode ser preparada seguindo as etapas 2.1, 2.3 e 2.4 sem precipitação de calor (etapa 2.2).
3. Prepare amilóide híbrido a partir de oligômeros solúveis estabilizados de proteínas nativas
- Preparar oligômeros de proteínas solúveis estabilizadas
- Pesar a proteína de sua escolha e reconstituir a 10 mg/ml em tampão MES. Deixe em temperatura ambiente por 15 min.
- Pesar cloridrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) e preparar uma nova matéria-prima de 20 mg/ml em tampão MES.
- Misture soluções de proteínas e EDC na proporção de 2:5 (v/v), ou seja, 2 mg de proteína para cada 10 mg de EDC.
- Incube em temperatura ambiente por 2 horas.
- Neutralize a amostra com 10% (v/v) de Tris-HCl (1 M, pH 10,5).
- Dialise a proteína em um de diálise durante a noite para trocar para o tampão desejado para análise posterior.
- Conservar o oligómero de proteínas solúveis estabilizado a 4 ºC durante 4 semanas.
- Prepare amilóides híbridos a partir de oligômero de proteína solúvel estabilizada.
- Para preparar amilóide contendo DNA, misture DNA e oligômero de proteína solúvel estabilizada na proporção de 1:1 (p/p). Deixar a 4 ºC durante, pelo menos, 2 horas. Durante este período, o precipitado insolúvel é visível em solução quando a concentração inicial de proteína é de 0,5 mg / ml ou superior.
- Para preparar amilóide contendo RNA, misture RNA e oligômero de proteína solúvel estabilizada na proporção de 1:1 (p/p). Deixar a 4 ºC durante, pelo menos, 2 horas. Durante este período, o precipitado insolúvel é visível em solução quando a concentração inicial de proteína é de 0,5 mg / ml ou superior.
- Para preparar amilóide contendo heparina, misture heparina e oligômero de proteína solúvel estabilizada na proporção de 1:1 (p/p). Deixar a 4 ºC durante, pelo menos, 2 horas. Durante este período, o precipitado insolúvel é visível em solução quando a concentração inicial de proteína é de 0,5 mg / ml ou superior.
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Resultados
A capacidade de converter proteínas nativas diretamente em amiloides depende da mudança conformacional provocada em alta temperatura no tampão MES. A precipitação na solução é um bom indicativo de agregação proteica e possivelmente da formação de amiloides. Por outro lado, para permitir a estabilização de oligômeros proteicos solúveis, o EDC é utilizado para reticulação das proteínas, consolidando a conformação oligomérica induzida no tampão MES. Como resultado, os oligômeros proteicos estabilizados são proteínas multimé...
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Discussão
O método descrito aqui oferece um meio rápido e flexível para preparar fibrilas amilóides in vitro a partir de praticamente qualquer proteína ou peptídeo de sua escolha. Vários tipos diferentes de amilóide podem ser preparados de forma confiável - fibrilas somente de proteínas ou agregados híbridos contendo DNA, RNA ou glicosaminoglicanos. Os procedimentos envolvidos são simples, diretos e não requerem treinamento técnico avançado. O amiloide preparado por este método é bastante estável e pode ser armazenado com...
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Divulgações
Não temos nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado por doações para W.C. do National Institutes of Health Grant AI074809 e do Programa de Bolsas de Pesquisa Institucional do MD Anderson Cancer Center da Universidade do Texas.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (MES) | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| Cloridrato de 1-etil-3-[3-dimetil-aminopropil] carbodiimida (EDC) | Thermo/Pierce | 22980 | |
| DNA de esperma de salmão | Sigma | D1626 | |
| RNA de levedura torula | Sigma | R6625 | |
| Heparina da mucosa intestinal suína | Sigma | H3149 | |
| Tris base | Fisher | BP152-1 | |
| Equipamento: | |||
| Banho-maria | Fisher Science | Isotemp 210 | |
| Slide-A-Lyzer de diálise | Thermo / Pierce | 66380 |
Referências
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Reimpressões e permissões
