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Artigo de método

A suplementação dietética de ácidos graxos poliinsaturados em

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DOI:

10.3791/50879

⸱

29 de novembro de 2013

 ,  , 
1School of Molecular Biosciences, Washington State University, 2Center for Reproductive Biology, Washington State University

Neste artigo

Resumo

Caenorhabditis elegan é um modelo útil para explorar as funções de ácidos graxos poliinsaturados em desenvolvimento e fisiologia. Este protocolo descreve um método eficiente de complementar o C. elegans dieta com ácidos graxos poliinsaturados.

Resumo

Os ácidos graxos são essenciais para inúmeras funções celulares. Eles servem como moléculas de armazenamento de energia eficientes, compõem o núcleo hidrofóbico das membranas, e participe de várias vias de sinalização. Caenorhabditis elegans sintetiza todas as enzimas necessárias para produzir uma gama de ácidos graxos ômega-6 e ômega-3. Isto, combinado com a anatomia simples e variedade de ferramentas genéticas disponíveis, torná-lo um modelo atraente para estudar a função de ácidos graxos. A fim de investigar as vias genéticas que medeiam os efeitos fisiológicos dos ácidos gordos alimentares, temos desenvolvido um método para complementar a C. elegans dieta com ácidos gordos insaturados. A suplementação é um meio eficaz para alterar a composição de ácidos gordos de vermes e também pode ser usado para recuperar defeitos de mutantes deficientes em ácidos gordos. O nosso método utiliza nematóide de meio de crescimento de ágar (NGM), suplementado com sais acidsodium gordo. Os ácidos graxos nas placas suplementadas se tornar incorporaçãoted nas membranas da fonte alimentar bacteriana, a qual é então feita pela C. elegans que se alimentam de bactérias suplementados. Os requerentes também descrevem um protocolo de cromatografia em fase gasosa para monitorar as alterações na composição de ácidos gordos que ocorrem em vermes suplementados. Esta é uma maneira eficiente para complementar as dietas de grandes e pequenas populações de C. elegans, permitindo uma gama de aplicações para este método.

Introdução

Os ácidos gordos são componentes estruturais essenciais das membranas, bem como moléculas de armazenamento de energia eficiente. Além disso, os ácidos gordos podem ser clivada a partir das membranas celulares por lipases e ser enzimaticamente modificada para produzir uma sinalização efectores. De ocorrência natural de ácidos gordos poli-insaturados (PUFAs) contêm duas ou mais ligações duplas cis. Os ômega-3 os ácidos gordos e os ácidos graxos ômega-6 são distinguidos um do outro com base nas posições de ligações duplas em relação ao final de metila do ácido graxo. Dietas saudáveis ​​exigem tanto de ômega-3 os ácidos graxos ômega-6 e. No entanto, as dietas ocidentais são particularmente ricas em ômega-6 ácidos graxos e pobre em ômega-3 ácidos graxos. Uma alta ómega-6 para ácidos gordos ómega rácio-3 está associada com um risco aumentado de doenças cardiovasculares e inflamatórias, no entanto, as funções benéficas e prejudiciais precisas de ácidos gordos específicos não são bem compreendidos 2. Os lombriga elega Caenorhabditisns é útil no estudo de função ácido graxo porque sintetiza todas as enzimas necessárias para produzir uma gama de ácidos graxos ômega-6 e ômega-3, incluindo um omega-3 dessaturase, uma atividade que está ausente na maioria dos animais 3,4. Mutantes sem enzimas dessaturases de ácido gordo não produzem PUFA específicos, que conduz a uma variedade de defeitos do desenvolvimento e neurológicas 4-6.

Para estudar os efeitos fisiológicos dos ácidos gordos alimentares, temos desenvolvido um ensaio bioquímico compatível com a análise genética utilizando tanto mutante e RNAi técnicas knock-down em C. elegans. A suplementação com PUFA específicos é conseguida por adição de uma solução de sal de sódio de ácido gordo para o meio de agar antes do vazamento. Isto resulta em PUFA absorção pela E. fonte de alimento coli, onde se acumula nas membranas bacterianas. C. elegans ingerir a bactéria contendo PUFA, e essa suplementação alimentar é suficiente para resgatar a defecst de mutantes PUFA com deficiência. A suplementação da maioria dos ácidos graxos não tem efeitos prejudiciais para os animais selvagens, no entanto, ômega-6 ácidos graxos específicos, especialmente o ácido gama-linolênico dihomo (DGLA, 20:3 n-6) causam uma destruição permanente de C. células germinativas elegans 7,8.

Cromatografia em fase gasosa é usado para monitorar a absorção do ácido gordo completada na fonte alimentar bacteriana (ou OP50 ou HT115), bem como nos nemátodes. A adição do Tergitol detergente (NP-40) nos meios permite a distribuição uniforme de ácidos gordos através de toda a placa e uma absorção mais eficiente dos ácidos gordos pela E. coli e os nemátodos. Verificou-se que os ácidos gordos insaturados são facilmente absorvido pelas bactérias e C. elegans, mas a absorção de ácidos gordos saturados, é muito menos eficiente. Este artigo irá descrever passo a passo a forma de complementar o ágar com ácidos graxos, bem como a forma de controlar a absorção de ácidos graxos em poe nematóide utilizando cromatografia gasosa.

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Protocolo

Os ácidos graxos poliinsaturados são sensíveis ao calor, luz e oxigênio. Portanto, é preciso ter cuidado ao preparar pratos de suplementação de ácidos graxos de tal forma que os ácidos graxos não estão expostos ao excesso de calor e luz. Meios de NGM contendo 0,1% de Tergitol (NP-40) é esterilizado e parcialmente arrefecida, após o que os sais de sódio de ácido gordo são adicionados com agitação constante. As placas são deixadas a secar no escuro. A absorção de ácidos gordos por C. elegans cultivadas nestas placas podem então ser monitorizado por cromatografia em fase gasosa.

1. Preparação de Ácidos Graxos Supplemented Mídia

  1. Medir componentes de mídia em um frasco de tamanho adequado. Por 1 L, adicionar 17 g de Bacto-ágar, 2,5 g de triptona, 3 g de NaCl, 1 mL de 5 mg / ml de colesterol dissolvido em etanol, e 10 ml de 10% de Tergitol dissolvido em água.
  2. Adicionar 80% do volume final pretendido de água Millipore e autoclave os meios de comunicação, juntamente com os frascos de vidro vazio (igual ao número de diferenteAs concentrações de ácido gordo a ser testado), bem como apropriado provetas.
  3. Frescos mídia em um banho-maria regulado a 55 ° C. Enquanto a mídia está esfriando preparar a solução estoque de trabalho do sal sódico do ácido graxo por quebrar aberto o frasco de vidro, utilizando-se as precauções de segurança e garantindo partículas de vidro não se misturam com os ácidos graxos. Pesar ácido graxo suficiente para fazer um estoque de trabalho de 100 mm.
  4. Levar a solução de ácido gordo para uma concentração final de 100 mM com a água purificada. Totalmente dissolvendo o sal de sódio de ácido gordo, tipicamente leva cerca de 20-30 minutos. Purga-se o estoque de trabalho de ácido gordo com de árgon ou de azoto, porque o contacto com um gás inerte, impede a oxidação. Tapar o frasco e armazenar o material a trabalhar, no escuro, até meios de ter arrefecido.
  5. (Opcional) Se o material de RNAi é desejado, medir a ampicilina e isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) soluções aqui.
  6. Quando o agar foi arrefecida a 55 ° C adicionar por 1 L: 1ml de 1 M de MgSO4, 1 ml de 1 M de CaCl2, e 25 ml de tampão fosfato (108,3 g de KH 2 PO 4 e 35,6 g de K 2 HPO 4 por 1 L autoclavado). Adicionar o filtro ampicilina esterilizados e soluções IPTG se fazer placas de RNAi. Para todos os tipos de placas, adicionar água estéril para levar o volume do meio final a 1 L.
  7. Perto de uma chama, a transferência de mídia a uma autoclave e adequadamente dimensionado cilindro graduado e adicione água estéril morna para volume desejado. Mídia de transferência de volta ao frasco inicial e misturar por agitação.
  8. Perto de uma chama, transferir mídia para um número de garrafas igual ao número de concentrações a serem testadas através da medição com um autoclavado e dimensionado adequadamente cilindro graduado. Manter os meios de comunicação distribuídos em alíquotas como líquido usando um banho de água até que o estoque de trabalho de ácido gordo foi totalmente dissolvida.
  9. Coloque uma garrafa em uma placa de agitação e mexa até que a mídia é quente ao toque, mas não quente. Certifique-se de deixar-se suficientetempo para mexer na solução estoque de ácidos graxos e despeje placas perante a mídia começa a solidificar. Se placa de agitação tem controle de temperatura, ajuste-o a 55 ° C.
  10. Diluir o estoque trabalhando ácido graxo 100 mM na mídia para a concentração final desejada. Mídia Agitar até o precipitado branco é, em solução (aproximadamente um minuto). Mídia pode ainda estar um pouco nublado depois.
  11. (Opcional) Se o material de RNAi é desejado adicionar ampicilina para 0,1 mg / mL e IPTG a 2 mM de concentração final.
  12. Despeje mídia usando uma ajuda pipeta automática e uma estéril 25 ml pipeta, adicionando 8 ml de meio por placa de 60 mm ou 25 ml de mídia por placa de 100 mm. Repetir a adição de ácido gordo e de placa de derramamento passos para as garrafas restantes.
  13. Após o ágar se ter solidificado, cobrir as placas com suplemento de ácidos graxos com uma caixa ou armazenar em temperatura ambiente em uma gaveta bem ventilada para proteger da oxidação luz.
  14. Semente E. coli OP50 em placas de dois dias depois de ter placas secas.Para placas de 60 mm, uma pipeta 300 uL de uma cultura durante a noite OP50 (cultivados a 37 ° C). Se as placas de ARNi foram vertidas, semear com 300 uL de bactérias de RNAi depois as placas foram secas durante quatro dias. Placa tempo de secagem pode precisar de ser ajustado devido a diferenças de umidade em vários ambientes de laboratório.
  15. Incubar as placas num ambiente escuro a temperatura ambiente, enquanto a camada de bactérias é a secagem.

2. Induzir a destruição das células germinativas por suplementação de ADGL

  1. C. elegans cultivadas em placas contendo 0,3 mM de DGLA (20:3 n-6) se tornar estéril devido à destruição das células germinais em ambos os estágios larvais e adultas nemátodos.
    1. Prepara-se uma população de larvas L1 sincronizado por tratamento hermafroditas grávidas com solução de hipoclorito alcalino (para uma solução de 10 ml: 0,5 ml de NaOH a 5M, 2,5 ml de lixívia doméstica, e 7 mL de H2O). Agite suavemente os hermafroditas grávidas nesta solução até que o verme adultos dissolver. Os ovos serão preservados, e pode ser sedimentado por centrifugação a baixa velocidade.
    2. Lavar a preparação de ovo 3 vezes em tampão M9 (3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 mL de 1 M de MgSO4, H 2 O a 1 L. Adicionar MgSO4 após autoclavagem). Para fornecer oxigénio suficiente, ressuspender os ovos em um tubo de 15 ml de plástico para um volume final de 5 ml de tampão M9 e rocha num agitador durante a noite.
    3. Larvas L1 devem ser adicionados às placas suplementadas dois dias após a sementeira com OP50, ou um dia após o plaqueamento das bactérias de RNAi. Incubar vermes a 20 ° C durante três dias, ou até se alcançar o estágio adulto.
  2. Os vermes adultos podem ser marcados para a esterilidade, utilizando um microscópio de dissecação com suficientemente alta ampliação para visualizar os embriões em desenvolvimento no útero. Perda de células germinativas de sucesso aparecerá como um vazio útero clara de ovos.
  3. Worms também pode ser marcado por fixação e coloração com um nucleicocid corante diamindinophenylindole (DAPI), o que facilita a visualização de núcleos de células germinais e de embriões em desenvolvimento. Uma mancha DAPI rápida é conseguida seleccionando vermes em uma gota de tampão M9 sobre um vidro de relógio 9.
    1. Flood relógio de vidro com 1 ml de 0,2 ng / m. DAPI em solução de etanol a 95%, deixar repousar durante aproximadamente 5 min.
    2. Escolha vermes em uma gota de Vectashield em um slide, e depois cobrir com uma lamela.
    3. Lamela Seal e armazenar a 4 ° C no escuro durante a noite para a coloração ideal, no entanto slides podem também ser vistos imediatamente. Marcar a presença ou ausência de núcleos de células germinativas, utilizando um microscópio de fluorescência equipado com uma lâmpada de UV e um filtro.

3. Confirmando Ácidos Graxos Captação por Cromatografia Gasosa

Composição geral de ácidos graxos do C. elegans pode ser determinado através da produção de ésteres metílicos de ácidos gordos (FAMEs), que são então separados e quantificados usando gás chromatography 4.

  1. Colete 500-1.000 vermes adultos, lavando-as fora das placas com água e transferir para um 13 milímetros x 100 mm parafuso de vidro tubo superior silanizada.
  2. Vamos resolver vermes pela gravidade, e, em seguida, remover o máximo de água possível com uma pipeta Pasteur de vidro.
  3. Lave vermes uma vez com água, e depois novamente remover o máximo de água possível.
  4. FAMEs são formados por adição de 1 ml de 2,5% de H 2 SO 4, em metanol, e, em seguida, o aquecimento a 70 ° C durante 1 hora em um banho de água.
  5. Retire os tubos do banho-maria e deixe esfriar por 1 min.
  6. Extrair EMAGs pela adição de 1,5 ml de água e 0,25 ml de hexano.
  7. Recap tubos e agitar vigorosamente.
  8. Tubos de centrifugação numa centrífuga clínica de mesa durante 1 min na velocidade máxima para separar o hexano a partir de um solvente aquoso.
  9. Transferir hexano (camada superior) para uma inserção de GC frasco dentro de um frasco de GC, tomando cuidado para não transferir qualquer da fase aquosa. Para GC umnálise, 1-2 ul de FAMEs em hexano é injectada numa coluna capilar de cromatografia gasosa polar adequado para análise EMAGs. O Agilent 7890 GC injector é de 250 ° C, com uma taxa de fluxo de 1,4 ml / min, e o forno do GC foi programado para uma temperatura inicial de 130 ° C, que é mantida durante 1 min. Subsequentemente, a temperatura é em rampa de 10 ° C / min até 190 ° C, e, em seguida, em rampa novamente a 5 ° C / min até 210 ° C e mantida durante mais 1 min.
  10. Para assegurar que a absorção de DGLA ocorreu, analisar EMAGs por detecção de ionização de chama (FID) ou espectrometria de massa (MS) de detecção, utilizando-se padrões autênticos para a identificação de C. elegans ácidos graxos.

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Resultados

A suplementação de C. elegans dieta é limitada pela capacidade da fonte de alimentação das bactérias a absorção e incorporação de ácidos gordos na membrana bacteriana. Para determinar a capacidade de E. coli OP50 assimilar vários ácidos gordos nas suas membranas, OP50 foram semeados em meios sem suplemento, 0,1 mM e 0,3 mM, concentrações de ácido esteárico (18:00), oleato de sódio (18:1 n-9), e DGLA de sódio (20 : 3n-6). As placas foram secas à temperatura ambiente durante 2 dias no escuro, e incubados...

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Discussão

Aqui, descrevemos um método de suplementação de C. elegans com ácidos gordos insaturados na dieta. Como mencionado acima, é preciso ter cuidado na preparação dos pratos PUFA suplementados porque a natureza reativa das ligações duplas em PUFAs faz com que esses ácidos graxos para ser sensível à oxidação através do calor e da luz 11. Para evitar a oxidação, é importante adicionar o AGPI para o meio de agar depois de os meios de comunicação de líquido tenha arrefecido para 55 ° C e armazena placas em um...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos a Chris Webster para a realização dos experimentos preliminares apresentadas na Figura 3 dos resultados representativos e Jason Watts e Chris Webster pelos comentários úteis sobre o manuscrito. O financiamento para este estudo foi fornecido por uma concessão do National Institutes of Health (USA) (R01DK074114) para JLW. Algumas cepas de nematóides utilizados neste trabalho foram fornecidos pelo Centro de Genética Caenorhabditis, que é financiado pelo Escritório de Investigação NIH Programas de Infra-estrutura (P40 OD010440).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Bacto-AgarDifco214010
TriptonaDifco211705
NaClJ.T. Baker3624-05
TergitolSigmaNP40S-500mL
ColesterolSigmaC8667-25G(5 mg/mL em etanol)
MgSO4J.T. Baker2504-01
CaCl2J.T. Baker1311-01
K2HPO4J.T. Baker3254-05
KH2PO4J.T. Baker3246-05
Linolenato de dihomogama de sódioNuCHEKS-1143
ÁguaMillipore estéril morna
Água estéril para coleta de vermes
Água livre de nuclease para solução estoque DGLAAmbionAM9932
AmpicilinaFisher ScientificBP1760-25100 mg/ml em água (para placas de RNAi)
Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG)Gold Biotechnology12481C1001 M em água (para placas de RNAi)
HSO4J.T. Baker9681-03
MetanolFisher ScientificA452-4
HexanoFisherScientific H302-4
diamindinofenilindol (DAPI)SigmaD9542
VectaShieldVector LaboratoriesH-1000
Frasco de vidroCorning4980-2L
Garrafas de vidro autoclaváveis com barras de agitaçãoFisherbrandFB-800
Cilindro graduado de vidro autoclavávelFisherbrand08-557
Placa de agitaçãoVWR97042-642
Banho-maria a 55+ ° CPrecision Scientific Inc.66551
Frasco de vidro marrom com tampa de roscaSun SRI200 494
Tanque
Auxiliar de pipeta automatizadoPipeta-AidP-90297
Pipetas sorológicas estéreis (25 ml)Bico de Bunsen Corning4489
VWR89038-534
Microscópio de dissecçãoLeica
Tubo de vidro silanizadoThermo ScientificSTT-13100-Spara derivitização FAMEs
PTFE Tampas de roscaKimble-Chase1493015D
Centrífuga de mesa clínicaIEC
GC Crimp VialSUN SRi200 000
GC Inserção do frascoSUN SRi200 232
GC Tampa do frascoSUN SRi200 100
Cromatógrafo GasosoAgilent7890A
Detector de Espectrometria de MassaColuna Agilent5975C
para cromatografia gasosaSuppelcoSP 238030 m x 0,25 mm coluna capilar de sílica fundida
de gás argônioTLB3000

Referências

  1. Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).
  2. de Lorgeril, M., Salen, P. New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids. BMC Med. 10, 50(2012).
  3. Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).
  4. Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
  5. Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants. Genetics. 163, 581-589 (2003).
  6. Kahn-Kirby, A. H., et al. Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo. Cell. 119, 889-900 (2004).
  7. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PLoS Genet. 2, e108(2006).
  8. Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).
  9. Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line. Genetics. 145, 111-121 (1997).
  10. Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).
  11. Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides. Lipids. 11, 370-379 (1976).
  12. Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26, 554-566 (2012).
  13. Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
  14. O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes Dev. 27, 429-440 (2013).
  15. Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans. Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).
  16. Lesa, G. M., et al. Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).
  17. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 176, 865-875 (2007).
  18. Goudeau, J., et al. Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans. PLoS Biol. 9, e1000599(2011).
  19. Yang, F., et al. An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis. Nature. 442, 700-704 (2006).

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