Caenorhabditis elegan é um modelo útil para explorar as funções de ácidos graxos poliinsaturados em desenvolvimento e fisiologia. Este protocolo descreve um método eficiente de complementar o C. elegans dieta com ácidos graxos poliinsaturados.
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Artigo de método
A suplementação dietética de ácidos graxos poliinsaturados em
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Resumo
Resumo
Os ácidos graxos são essenciais para inúmeras funções celulares. Eles servem como moléculas de armazenamento de energia eficientes, compõem o núcleo hidrofóbico das membranas, e participe de várias vias de sinalização. Caenorhabditis elegans sintetiza todas as enzimas necessárias para produzir uma gama de ácidos graxos ômega-6 e ômega-3. Isto, combinado com a anatomia simples e variedade de ferramentas genéticas disponíveis, torná-lo um modelo atraente para estudar a função de ácidos graxos. A fim de investigar as vias genéticas que medeiam os efeitos fisiológicos dos ácidos gordos alimentares, temos desenvolvido um método para complementar a C. elegans dieta com ácidos gordos insaturados. A suplementação é um meio eficaz para alterar a composição de ácidos gordos de vermes e também pode ser usado para recuperar defeitos de mutantes deficientes em ácidos gordos. O nosso método utiliza nematóide de meio de crescimento de ágar (NGM), suplementado com sais acidsodium gordo. Os ácidos graxos nas placas suplementadas se tornar incorporaçãoted nas membranas da fonte alimentar bacteriana, a qual é então feita pela C. elegans que se alimentam de bactérias suplementados. Os requerentes também descrevem um protocolo de cromatografia em fase gasosa para monitorar as alterações na composição de ácidos gordos que ocorrem em vermes suplementados. Esta é uma maneira eficiente para complementar as dietas de grandes e pequenas populações de C. elegans, permitindo uma gama de aplicações para este método.
Introdução
Os ácidos gordos são componentes estruturais essenciais das membranas, bem como moléculas de armazenamento de energia eficiente. Além disso, os ácidos gordos podem ser clivada a partir das membranas celulares por lipases e ser enzimaticamente modificada para produzir uma sinalização efectores. De ocorrência natural de ácidos gordos poli-insaturados (PUFAs) contêm duas ou mais ligações duplas cis. Os ômega-3 os ácidos gordos e os ácidos graxos ômega-6 são distinguidos um do outro com base nas posições de ligações duplas em relação ao final de metila do ácido graxo. Dietas saudáveis exigem tanto de ômega-3 os ácidos graxos ômega-6 e. No entanto, a....
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Protocolo
Os ácidos graxos poliinsaturados são sensíveis ao calor, luz e oxigênio. Portanto, é preciso ter cuidado ao preparar pratos de suplementação de ácidos graxos de tal forma que os ácidos graxos não estão expostos ao excesso de calor e luz. Meios de NGM contendo 0,1% de Tergitol (NP-40) é esterilizado e parcialmente arrefecida, após o que os sais de sódio de ácido gordo são adicionados com agitação constante. As placas são deixadas a secar no escuro. A absorção de ácidos gordos por C. elegans cultivadas nestas placas podem então ser monitorizado por cromatografia em fase gasosa.
1. Preparação de Ácidos Graxos Supplemented Mídia
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Resultados
A suplementação de C. elegans dieta é limitada pela capacidade da fonte de alimentação das bactérias a absorção e incorporação de ácidos gordos na membrana bacteriana. Para determinar a capacidade de E. coli OP50 assimilar vários ácidos gordos nas suas membranas, OP50 foram semeados em meios sem suplemento, 0,1 mM e 0,3 mM, concentrações de ácido esteárico (18:00), oleato de sódio (18:1 n-9), e DGLA de sódio (20 : 3n-6). As placas foram secas à temperatura ambiente durante 2 dias no escuro, e incubados.......
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Discussão
Aqui, descrevemos um método de suplementação de C. elegans com ácidos gordos insaturados na dieta. Como mencionado acima, é preciso ter cuidado na preparação dos pratos PUFA suplementados porque a natureza reativa das ligações duplas em PUFAs faz com que esses ácidos graxos para ser sensível à oxidação através do calor e da luz 11. Para evitar a oxidação, é importante adicionar o AGPI para o meio de agar depois de os meios de comunicação de líquido tenha arrefecido para 55 ° C e armazena placas em um.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos a Chris Webster para a realização dos experimentos preliminares apresentadas na Figura 3 dos resultados representativos e Jason Watts e Chris Webster pelos comentários úteis sobre o manuscrito. O financiamento para este estudo foi fornecido por uma concessão do National Institutes of Health (USA) (R01DK074114) para JLW. Algumas cepas de nematóides utilizados neste trabalho foram fornecidos pelo Centro de Genética Caenorhabditis, que é financiado pelo Escritório de Investigação NIH Programas de Infra-estrutura (P40 OD010440).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Bacto-Agar | Difco | 214010 | |
| Triptona | Difco | 211705 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Tergitol | Sigma | NP40S-500mL | |
| Colesterol | Sigma | C8667-25G | (5 mg/mL em etanol) |
| MgSO4 | J.T. Baker | 2504-01 | |
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3254-05 | |
| KH2PO4 | J.T. Baker | 3246-05 | |
| Linolenato de dihomogama de sódio | NuCHEK | S-1143 | |
| Água | Millipore estéril morna | ||
| Água estéril para coleta de vermes | |||
| Água livre de nuclease para solução estoque DGLA | Ambion | AM9932 | |
| Ampicilina | Fisher Scientific | BP1760-25 | 100 mg/ml em água (para placas de RNAi) |
| Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) | Gold Biotechnology | 12481C100 | 1 M em água (para placas de RNAi) |
| HSO4 | J.T. Baker | 9681-03 | |
| Metanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Hexano | Fisher | Scientific H302-4 | |
| diamindinofenilindol (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| VectaShield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Frasco de vidro | Corning | 4980-2L | |
| Garrafas de vidro autoclaváveis com barras de agitação | Fisherbrand | FB-800 | |
| Cilindro graduado de vidro autoclavável | Fisherbrand | 08-557 | |
| Placa de agitação | VWR | 97042-642 | |
| Banho-maria a 55+ ° C | Precision Scientific Inc. | 66551 | |
| Frasco de vidro marrom com tampa de rosca | Sun SRI | 200 494 | |
| Tanque | |||
| Auxiliar de pipeta automatizado | Pipeta-Aid | P-90297 | |
| Pipetas sorológicas estéreis (25 ml) | Bico de Bunsen Corning | 4489 | |
| VWR | 89038-534 | ||
| Microscópio de dissecção | Leica | ||
| Tubo de vidro silanizado | Thermo Scientific | STT-13100-S | para derivitização FAMEs |
| PTFE Tampas de rosca | Kimble-Chase | 1493015D | |
| Centrífuga de mesa clínica | IEC | ||
| GC Crimp Vial | SUN SRi | 200 000 | |
| GC Inserção do frasco | SUN SRi | 200 232 | |
| GC Tampa do frasco | SUN SRi | 200 100 | |
| Cromatógrafo Gasoso | Agilent | 7890A | |
| Detector de Espectrometria de Massa | Coluna Agilent | 5975C | |
| para cromatografia gasosa | Suppelco | SP 2380 | 30 m x 0,25 mm coluna capilar de sílica fundida |
Referências
- Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).
- de Lorgeril, M., Salen, P. New insights into the health effects of dietary satu....
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Reimpressões e permissões
