Crescer a partir de células-tronco neurais convencionais e não convencionais Regiões do cérebro adulto de roedores

Resumo

Células-tronco neurais colhidas a partir do cérebro de adultos estão aumentando utilizado em aplicações que vão desde a pesquisa básica do desenvolvimento do sistema nervoso para explorar potenciais aplicações clínicas em medicina regenerativa. Isso faz com que o controle rigoroso das condições de isolamento e cultivo utilizados para cultivar essas células críticas a soar os resultados experimentais.

Resumo

Trabalho recente mostra que o sistema nervoso central (SNC) de regeneração e tumorigénese envolve as populações de células estaminais (SCS) residentes no cérebro adulto. No entanto, os mecanismos dessas células normalmente quiescentes empregar para garantir o bom funcionamento das redes neurais, bem como o seu papel na recuperação de lesões e mitigação de processos neurodegenerativos são pouco compreendidos. Estas células residem nas regiões referidas como "ameias" que fornecem um ambiente de sustentação envolvendo os sinais de modulação de ambos os sistemas vasculares e imunológicas. O isolamento, manutenção e diferenciação de SCs do SNC em condições de cultura definidas que excluem fatores desconhecidos, torna acessíveis ao tratamento por meios farmacológicos ou genéticos, proporcionando, assim, uma visão sobre o seu comportamento in vivo. Aqui oferecemos informações detalhadas sobre os métodos de geração de culturas de SCs do SNC a partir de regiões distintas do cérebro adulto e abordagens para avaliar a sua dpotencial ifferentiation em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos, in vitro. Esta técnica produz uma população homogénea de células como uma cultura em monocamada, que pode ser visualizado para estudar SCs indivíduo e da sua descendência. Além disso, pode ser aplicado através de vários sistemas de modelos animais e amostras clínicas, sendo utilizado anteriormente para prever respostas regenerativos no sistema nervoso adulto danificado.

Introdução

O dogma central da neurobiologia, previsto pelas observações fundamentais da citoarquitetura cerebral feita por Ramón Cajal Y. mais de um século atrás, considerou que a neurogênese era improvável após a adolescência, dada a complexidade das redes neurais encontrados no SNC ^1. Apesar do trabalho de Altman em 1960, e mais tarde Kaplan, demonstrando que ³ H-timidina poderia ser encontrado em neurônios maduros, indicando que, de fato, os neurônios estavam sendo geradas em áreas distintas do cérebro adulto, o dogma continuou a deter ^{2, 3.} Evidência continuou a montar com a pesquisa de Nottebohm descrevendo as mudanças sazonais no número de neurônios presentes no cérebro aves canoras ^4. Não foi até 1999, quando Gould et al trabalho. Publicado na geração de neurônios no hipocampo aumenta com o desempenho de tarefas de aprendizagem associativa em ratos, bem como as observações de Kornack e Rakic ​​demonstraçãoting continuou a neurogênese no macaco adulto que o conceito de um cérebro mais plástico menos rígido, foi reconhecido ^{5, 6.}

A pesquisa para a fonte celular para estes neurónios gerados de novo levar à descoberta de uma população particular de células estaminais (SCS), que residem em áreas do cérebro conhecida como nichos ^7. A zona subventricular e zona granular sub do hipocampo são consideradas como as duas principais regiões de origem neural ^8,9. As células isoladas a partir destes locais exibir a característica clássica de SCs derivados embrionárias ou fetais, a auto-renovação e diferenciação. No caso de células estaminais neurais (NSCs), que podem ser diferenciadas em neurónios, astrócitos e oligodendrócitos. Além disso, estes SCs coloração positiva para os marcadores NSC fetais, tais como o intermediário nestina proteína de filamento ^10. Os trabalhos mais recentes destaca que SCs não pode ser limitado a estes two áreas, e são, de facto, localizada em todo o cérebro como uma grande população de células quiescentes fortemente associadas com a vascularização ^11.

As observações de que a CT são mobilizados em resposta a uma lesão sugere a possibilidade de ser capaz de utilizar estas células para fins regenerativos para ajudar na recuperação da doença neurodegenerativa e acidente vascular cerebral ^{12, 13.} Este não é, ao contrário do papel que as células estaminais mesenquimais (MSCs) desempenhar na cicatrização dos tecidos conjuntivos, os quais são encontrados como células perivasculares que têm o potencial para se tornar osteoblastos, condrócitos e células adiposas ^14. No entanto, NSC não podem ser colhidas da mesma forma que as MSCs de medula óssea por aspiração de rotina e técnicas de centrifugação de gradiente de densidade e subsequentemente utilizado em terapias à base de células autólogas. Em consequência, outras fontes de células, tais como o uso de NSC fetais ou precursores neuronais derivadas embcélulas-tronco ryonic foram amplamente exploradas na doença animal e modelos de lesão com variados graus de sucesso ^15. Tecnologias de células-tronco pluripotentes induzidas, utilizando fontes de células somáticas oferecer uma outra avenida potencial para a produção de terapias baseadas em células terapeuticamente úteis para uma ampla gama de aplicações, superando a disponibilidade limitada e preocupações éticas sobre o uso de células embrionárias e tecidos fetais ^16. No entanto, a tradução clínica destes resultados tem provado ser uma tarefa difícil, como demonstrado nas lutas do tratamento de várias condições neurológicas com terapêutica baseada-SC aborda ^17,18, bem como um caminho tortuoso para aprovação das autoridades regulatórias. Como uma abordagem alternativa, a introdução de tratamentos farmacológicos específicos pode modular números NSC e facilitar a recuperação em modelos de doença de Parkinson e derrame ^19. Seja qual for a estratégia pode ser, a compreensão de como manipular eficazmente estas célulasrequer um sistema acessível in vitro.

Culturas de NSC pode ser realizada tanto como culturas agregadas, também conhecido como neurospheres, ou como uma monocamada ^8,20. Ambas as técnicas têm sido amplamente utilizados, o que permite o estabelecimento de condições de cultura definidos, ou seja, a utilização do Factor de Crescimento Epidérmico (EGF) ou o Factor de Crescimento de Fibroblastos básico (bFGF) como uma fonte de mitogénio, que fornecem para a expansão de precursores multipotenciais. Enquanto as culturas de neuroesferas podem ser mais adequados para estudar a capacidade de propagação clonal de um tipo de célula isolada, o sistema tem sido mostrado para produzir uma população mista de células durante a expansão ^21. Além disso, a estrutura fechada das neuroesferas faz manipulação farmacológica das células impraticável, e a interpretação da influência destes factores pode ter poderia ser confundidos devido ao microambiente estabelecida dentro do próprio neuroesfera. Culturas em monocamada, por outro lado, pode serutilizado em telas de elevada capacidade de bibliotecas de moléculas pequenas, proporcionando uma poderosa ferramenta para explorar os mecanismos de transdução de sinais que regulam o crescimento e diferenciação, SC, e abre a oportunidade de descobrir novos compostos que visam especificamente esta população de células.

Como consequência, a capacidade de gerar de forma reprodutível culturas de NSC adultas a partir de diferentes regiões de interesse no cérebro pode ser utilizado em um amplo espectro de aplicações de pesquisa, variando a partir de estudos de desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC), para explorar novas abordagens de medicina regenerativa . O protocolo aqui apresentado demonstra como a dissecar e avaliar o potencial de diferenciação das SCs SNC isolada a partir do cérebro do roedor adulto.

Protocolo

O trabalho adere à Declaração de Helsinski ea Demonstração animal ARVO. Os animais foram utilizados para a coleta de tecido e todos os métodos relevantes foram seguidos de acordo com as instruções do biotério da Universidade de Dresden. Os animais foram manipulados e alojados de acordo com as diretrizes federais alemães para o uso e cuidado de animais de laboratório, eo estudo foi aprovado pelo Landesdirektion Dresden. Favor consultar com política veterinária da sua instituição (IACUC ou outro board) sobre a eutanásia metodologia apropriada.

Ação específica e as concentrações de trabalho de reagentes podem ser encontrados nas Tabelas de reagentes que acompanham esse protocolo.

1. Preparação Cultura Dish

1. Pratos de revestimento com um volume suficiente de 75 ug / ml de poli-L-ornitina (isto é, 2 ml / poço de uma placa de 6 poços) durante a noite na incubadora de cultura celular, 2 dias antes da data marcada dissecção.
2. Aspirar o poli-L-ornitina no dia seguinte e lavar cada poço 2x com 3 ml de PBS durante 5 min.
3. Retirar a lavagem final, em seguida, adicionar a fibronectina (diluído 1:250, 4 ug / ml em PBS) para a placa e colocar os pratos na incubadora durante a noite.
4. Aspirar a fibronectina no dia da dissecção e lavar os pratos 2x com PBS. Retorne as placas ainda contendo o PBS de lavagem final para a incubadora até que o tecido dissociado está pronto para cultura. Naquele tempo, retire a PBS antes de chapeamento do tecido.
5. Armazenar as placas revestidas com poli-L-ornithinein incubadora durante até 3 semanas. As placas revestidas com fibronectina pode ser armazenado durante até 1 semana. Fibronectina revestimento pode ser realizado em menos de 2 horas, se urgente. A fibronectina é suscetível a desnaturação, não agitar a solução ou deixar secar os pratos.

2. Dissecção / chapeamento

1. Este protocolo é aplicável à utilização de três ratos adultos (3-6 meses de idade).
2. Chill cérebro seccionamento bloco em gelo antes da eutanásia dos ratos.
3. Coloque um tubo Falcon de 15 ml, que contém 5 ml de meio N2 com bFGF adicionado em gelo.
4. Eutanásia os ratos de acordo com a política veterinária da sua instituição.
5. Remover o cérebro do crânio, fazendo uma incisão abaixo da linha média da cabeça. Use uma pinça para descascar o osso permitindo o cérebro para ser cuidadosamente extraído.
6. Coloque o cérebro em um prato de 10 centímetros de Petri contendo PBS gelado. Isto irá remover qualquer cabelo residual e sangue. (Figura 1A)
7. Coloque o cérebro para o bloco de corte refrigerados. (Figura 1B)
8. Insira uma nova lâmina de barbear limpa para o bloco como mostrado na Figura 1C.
9. Inserir uma segunda mm caudal de barbear limpo lâmina 3 para o primeiro, tal como ilustrado na figura 1D.
10. Retire cuidadosamente as lâminas do bloco, levando com eles a seção de interesse.
11. Passe o secção ao largo da lâmina de imersão em PBS. (Figura 1E)
12. Colheita de tecido da área de interesse (neste exemplo usamos a comissura anterior, (anterior) ACA, Figura 1F) usando # 5 fórceps e recolher em um tubo de 15 ml contendo 1 ml de meio de N2 contendo bFGF.
13. Movimentar o tubo em uma capa de cultura de célula de fluxo laminar, continuando o restante do protocolo em condições estéreis.
14. Mecanicamente dissociar o tecido usando uma ponta de pipeta 1 ml ligado a uma pipeta P1000. Pipeta cima e para baixo várias vezes (cerca de 20x, a uma taxa de 1 ciclo de pipetagem por segundo), enquanto pressiona a abertura da ponta da pipeta contra o fundo do tubo cónico (Figuras 1G 1-3). Pare de trituração quando a solução torna-se homogênea.
15. Deixar a solução descansar por 2 minutos para permitir que qualquer tecido nondissociated maior para liquidar o fundo. (Figura 1G 4)
16. Recolher o homogenEOU sobrenadante e colocar num tubo cónico contendo 8,5 ml de meio de N2 + 20 ng / ml de bFGF, 500 ng / ml Dll4, 500 ng / ml de Ang2, e 200 nMJAK inibidor.
17. Placa-os em três poços de uma placa de 6 poços, usando 3 ml de solução diluída de células / poço.
18. Colocar a placa num incubador humidificado de células a 37 ° C, 5% CO _2, 5% O _2.

3. Cuidados diários

1. Substituir o meio das placas de cultura com Meio N2 contendo bFGF, Ang2, Dll4, e inibidor de JAK 24 h após o plaqueamento.
2. Adicionar um bolus de bFGF, Dll4, Ang2, e inibidor de JAK, no dia seguinte.
3. Continue esse processo alternado de mudanças de mídia e adições fatores para um total de 10-14 dias.

4. Indução de Diferenciação

1. Retire bFGF, Dll4, Ang2 e JAK inibidor contendo meio e substituí-lo por meio de N2 que não contém quaisquer outros fatores.
2. Mude o meio cada segundo dia.
3. Fixar as células depois de 10 dias e realizar imunocitoquímica.

5. Detecção imunocitoquímica

1. Aspirar o meio e fixar placas de cultura de células com 2 ml de paraformaldeído a 4% durante 20 min.
2. Lavar 2x com 3 ml de PBS durante 5 min cada.
3. Aspirar PBS, depois permeabilizar as células e bloquear por adição de 2 ml de PBS contendo 5% de soro normal de burro (NDS) e 0,1% de Triton X-100 durante 20 min.
4. Preparar a mistura de anticorpo primário em PBS contendo 5% de NDS. Anticorpo anti-nestina pode ser utilizado para a identificação de SCs, enquanto TUJ1 (classe III β-tubulina), anticorpos de GFAP, e CNPase podem ser utilizados em conjunto para uma coloração tripla de marcadores de diferenciação.
5. Aspirar a solução de bloqueamento e adicionar 1,5 ml da mistura de anticorpo primário em cada poço. Incubar à temperatura ambiente durante 90 min.
6. Remover os anticorpos primários e lavar 2x com 3 ml de PBS, e 1x com 3 ml de PBS contendo 5% de NDS durante 5 min cada.
7. Prepare os anticorpos secundários em PBS contendo 5% de NDS.
8. Aspirar a lavagem final e adicionar 1,5 ml de solução de anticorpo secundário em cada poço. Incubar no escuro durante 40 min à temperatura ambiente.
9. Remover a solução de anticorpo secundário e adicionar 2 ml de uma mancha DAPI recentemente preparada (500 ng / ml em PBS). Incubar durante 3 min.
10. Aspirar a solução DAPI depois lavar 3x com 3 ml de PBS durante 5 min cada. As células podem agora ser visualizadas com um microscópio de fluorescência.

Resultados

A identificação da região de interesse a partir da qual a colheita de células estaminais neurais é o primeiro passo crítico e irá definir a quantidade de tempo que demora a obter uma placa confluente de células. Por exemplo, o SVZ é uma área neurogénica clássica e, por conseguinte, tem uma proporção relativa mais elevada de células estaminais neurais. No entanto, a técnica aqui apresentada pode ser utilizada com outras regiões não frequentemente reconhecidas como tendo um potencial neurogénica robusta durante a vida adu...

Discussão

Muitos dos passos críticos para o isolamento bem sucedido, expansão e diferenciação de células estaminais neurais do cérebro adulto são partilhados em comum com as técnicas de cultura de tecidos padrão. O objetivo de ter em mente é que NSCs isolados do cérebro adulto deve manter como muitas de suas características in vivo quanto possível (Figura 2J). Muitas vezes, um equilíbrio entre a necessária cautela e velocidade apropriada precisa ser atingido. O cuidado com o isolamento do cérebro do crân...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de cultura de tecidos de 6 poços	BD Biosciences	353934
Poli-L-ornitina	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml solução estoque preparada em água bidestilada (estável por vários meses a -20 ° C). Concentração de trabalho 0,5 mg/ml em água (estável por 1 mês a 4 " C).
Fibronectina	R& D Systems	1030-Fn	Não agite a solução de estoque
Aparelho de filtração	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	Veja a nota abaixo para a preparação completa do meio N2
Apo-transferrina	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulina	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescina	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M solução estoque em ddH2O (Estável a 20 > C por 6 meses)
Selenita de Sódio	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µ M solução estoque em ddH2O (Estável a -20 > C por 6 meses)
Progesterona	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µ M solução estoque em etanol (Estável a -20° C por 6 meses)
Penicilina/Estreptomicina	Invitrogen	15140-122
Solução salina tamponada com fosfato	Mediatech	21-040-CV
Fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF)	R& D Systems	233-FB	Concentração de trabalho 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R& D Systems	1389-D4	Concentração de trabalho  500 ng/ml
Angiopoetina 2 (Ang2)	R& D Systems	623-AN	Concentração de trabalho  500 ng/ml
Inibidor de JAK	Calbiochem	420099	Concentração de trabalho 200 nM
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	A-2058
Tubos cônicos de 15 e 50 ml	Corning Life Sciences	430053, 430829
Outros itens necessários incluem: Instrumentos de dissecção geral, incluindo lâmina de barbear e fórceps, Rato adulto (3-6 meses de idade; Sprague-Dawley ou Long Evans), câmara de intoxicação CO2, capela de fluxo laminar para cultura de células e incubadora Incubadora (umidificada, 37 &graus; C, 5% CO2, 5% O2). Nota: Para a preparação completa do meio N2, a um frasco de DMEM/F-12 (500 ml) adicione 0,05 g de apotransferina, 0,0125 g de insulina (recém-pré-dissolvida em 1 ml de NaOH 10 mM), 50 μ l de putrescina, 30 μ l de selenito de sódio, 100 μ l de estoques de progesterona e 5 ml de solução de penicilina/estreptomicina.  Ajuste o pH para 7,2, se necessário. Filtre-esterilize e armazene a 4 &graus; C por até 3 semanas e proteger da luz.
Tabela de Reagentes de Imunofluorescência
Paraformaldeído	Microscopia Eletrônica Sciences	15719
Soro de Burro Normal (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml estoque solução em metanol
Tabela de anticorpos primários
Nestin	Chemicon	MAB353	Fator de diluição: 1:400 Espécie: Camundongo IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Fator de diluição: 1:100 Espécie: Coelho IgG
Sox2 R	& D Systems	MAB2018	Fator de diluição: 1:100 Espécie: Camundongo IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Fator de diluição: 1:200 Espécie: camundongo IgG1
β-tubulina III (TUJ1)	R& D Systems	MAB1195	Fator de Diluição: 1:500 Espécie: Proteína
Glial Fibrilar Ácida (GFAP) Glial Fibrilar de Camundongo	Dako North America	Z0334	Fator de Diluição 1:500 Espécies: Coelho
Tabela de Anticorpos Secundários
Alexa    568	Invitrogen	A-21124	Fator de diluição: 1:200 Espécie: Cabra anti-rato IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Fator de diluição: 1:200 Espécie: Cabra anti-rato IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Fator de diluição: 1:200 Espécie: Cabra anti Coelho