Células-tronco neurais colhidas a partir do cérebro de adultos estão aumentando utilizado em aplicações que vão desde a pesquisa básica do desenvolvimento do sistema nervoso para explorar potenciais aplicações clínicas em medicina regenerativa. Isso faz com que o controle rigoroso das condições de isolamento e cultivo utilizados para cultivar essas células críticas a soar os resultados experimentais.
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Artigo de método
Crescer a partir de células-tronco neurais convencionais e não convencionais Regiões do cérebro adulto de roedores
Neste artigo
Resumo
Resumo
Trabalho recente mostra que o sistema nervoso central (SNC) de regeneração e tumorigénese envolve as populações de células estaminais (SCS) residentes no cérebro adulto. No entanto, os mecanismos dessas células normalmente quiescentes empregar para garantir o bom funcionamento das redes neurais, bem como o seu papel na recuperação de lesões e mitigação de processos neurodegenerativos são pouco compreendidos. Estas células residem nas regiões referidas como "ameias" que fornecem um ambiente de sustentação envolvendo os sinais de modulação de ambos os sistemas vasculares e imunológicas. O isolamento, manutenção e diferenciação de SCs do SNC em condições de cultura definidas que excluem fatores desconhecidos, torna acessíveis ao tratamento por meios farmacológicos ou genéticos, proporcionando, assim, uma visão sobre o seu comportamento in vivo. Aqui oferecemos informações detalhadas sobre os métodos de geração de culturas de SCs do SNC a partir de regiões distintas do cérebro adulto e abordagens para avaliar a sua dpotencial ifferentiation em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos, in vitro. Esta técnica produz uma população homogénea de células como uma cultura em monocamada, que pode ser visualizado para estudar SCs indivíduo e da sua descendência. Além disso, pode ser aplicado através de vários sistemas de modelos animais e amostras clínicas, sendo utilizado anteriormente para prever respostas regenerativos no sistema nervoso adulto danificado.
Introdução
O dogma central da neurobiologia, previsto pelas observações fundamentais da citoarquitetura cerebral feita por Ramón Cajal Y. mais de um século atrás, considerou que a neurogênese era improvável após a adolescência, dada a complexidade das redes neurais encontrados no SNC 1. Apesar do trabalho de Altman em 1960, e mais tarde Kaplan, demonstrando que 3 H-timidina poderia ser encontrado em neurônios maduros, indicando que, de fato, os neurônios estavam sendo geradas em áreas distintas do cérebro adulto, o dogma continuou a deter 2, 3. Evidência continuou a montar com a pesquisa de Nottebohm descrevendo as mudanças sazonais no número de....
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Protocolo
O trabalho adere à Declaração de Helsinski ea Demonstração animal ARVO. Os animais foram utilizados para a coleta de tecido e todos os métodos relevantes foram seguidos de acordo com as instruções do biotério da Universidade de Dresden. Os animais foram manipulados e alojados de acordo com as diretrizes federais alemães para o uso e cuidado de animais de laboratório, eo estudo foi aprovado pelo Landesdirektion Dresden. Favor consultar com política veterinária da sua instituição (IACUC ou outro board) sobre a eutanásia metodologia apropriada.
Ação específica e as concentrações de trabalho de reagentes podem ser encontrados nas Tabelas de r....
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Resultados
A identificação da região de interesse a partir da qual a colheita de células estaminais neurais é o primeiro passo crítico e irá definir a quantidade de tempo que demora a obter uma placa confluente de células. Por exemplo, o SVZ é uma área neurogénica clássica e, por conseguinte, tem uma proporção relativa mais elevada de células estaminais neurais. No entanto, a técnica aqui apresentada pode ser utilizada com outras regiões não frequentemente reconhecidas como tendo um potencial neurogénica robusta durante a vida adu.......
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Discussão
Muitos dos passos críticos para o isolamento bem sucedido, expansão e diferenciação de células estaminais neurais do cérebro adulto são partilhados em comum com as técnicas de cultura de tecidos padrão. O objetivo de ter em mente é que NSCs isolados do cérebro adulto deve manter como muitas de suas características in vivo quanto possível (Figura 2J). Muitas vezes, um equilíbrio entre a necessária cautela e velocidade apropriada precisa ser atingido. O cuidado com o isolamento do cérebro do crân.......
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Divulgações
Não temos nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado (em parte) pelo Helmholtz Alliance ICEMED - Imagem e curar doenças metabólicas Ambiental, através do Fundo Iniciativa e Rede da Associação Helmholtz, uma concessão do Else Kroener-Fresenius Foundation, e uma bolsa da Deutsche Forschungsgemeinschaft ( SFB 655: células em tecidos).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placas de cultura de tecidos de 6 poços | BD Biosciences | 353934 | |
| Poli-L-ornitina | Sigma-Aldrich | P-3655 | 5 mg/ml solução estoque preparada em água bidestilada (estável por vários meses a -20 ° C). Concentração de trabalho 0,5 mg/ml em água (estável por 1 mês a 4 " C). |
| Fibronectina | R& D Systems | 1030-Fn | Não agite a solução de estoque |
| Aparelho de filtração | Corning Life Sciences | 430769 | |
| DMEM/F-12 | Mediatech | 10-090-CV | Veja a nota abaixo para a preparação completa do meio N2 |
| Apo-transferrina | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
| Insulina | Sigma-Aldrich | I-0516 | |
| Putrescina | Sigma-Aldrich | P-5780 | 1 M solução estoque em ddH2O (Estável a 20 > C por 6 meses) |
| Selenita de Sódio | Sigma-Aldrich | S-5261 | 500 µ M solução estoque em ddH2O (Estável a -20 > C por 6 meses) |
| Progesterona | Sigma-Aldrich | P-8783 | 100 µ M solução estoque em etanol (Estável a -20° C por 6 meses) |
| Penicilina/Estreptomicina | Invitrogen | 15140-122 | |
| Solução salina tamponada com fosfato | Mediatech | 21-040-CV | |
| Fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF) | R& D Systems | 233-FB | Concentração de trabalho 20 ng/ml |
| Delta4 (Dll4) | R& D Systems | 1389-D4 | Concentração de trabalho 500 ng/ml |
| Angiopoetina 2 (Ang2) | R& D Systems | 623-AN | Concentração de trabalho 500 ng/ml |
| Inibidor de JAK | Calbiochem | 420099 | Concentração de trabalho 200 nM |
| Albumina de soro bovino | Sigma-Aldrich | A-2058 | |
| Tubos cônicos de 15 e 50 ml | Corning Life Sciences | 430053, 430829 | |
| Outros itens necessários incluem: Instrumentos de dissecção geral, incluindo lâmina de barbear e fórceps, Rato adulto (3-6 meses de idade; Sprague-Dawley ou Long Evans), câmara de intoxicação CO2, capela de fluxo laminar para cultura de células e incubadora Incubadora (umidificada, 37 &graus; C, 5% CO2, 5% O2). Nota: Para a preparação completa do meio N2, a um frasco de DMEM/F-12 (500 ml) adicione 0,05 g de apotransferina, 0,0125 g de insulina (recém-pré-dissolvida em 1 ml de NaOH 10 mM), 50 μ l de putrescina, 30 μ l de selenito de sódio, 100 μ l de estoques de progesterona e 5 ml de solução de penicilina/estreptomicina. Ajuste o pH para 7,2, se necessário. Filtre-esterilize e armazene a 4 &graus; C por até 3 semanas e proteger da luz. | |||
| Tabela de Reagentes de Imunofluorescência | |||
| Paraformaldeído | Microscopia Eletrônica Sciences | 15719 | |
| Soro de Burro Normal (NDS) | Sigma-Aldrich | D-9663 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-8787 | |
| 4,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D-8417 | 5 mg/ml estoque solução em metanol |
| Tabela de anticorpos primários | |||
| Nestin | Chemicon | MAB353 | Fator de diluição: 1:400 Espécie: Camundongo IgG1 |
| Hes3 | Santa Cruz | sc-25393 | Fator de diluição: 1:100 Espécie: Coelho IgG |
| Sox2 R | & D Systems | MAB2018 | Fator de diluição: 1:100 Espécie: Camundongo IgG2a |
| CNPase | Chemicon | MAB326 | Fator de diluição: 1:200 Espécie: camundongo IgG1 |
| β-tubulina III (TUJ1) | R& D Systems | MAB1195 | Fator de Diluição: 1:500 Espécie: Proteína |
| Glial Fibrilar Ácida (GFAP) Glial Fibrilar de Camundongo | Dako North America | Z0334 | Fator de Diluição 1:500 Espécies: Coelho |
| Tabela de Anticorpos Secundários | |||
| Alexa 568 | Invitrogen | A-21124 | Fator de diluição: 1:200 Espécie: Cabra anti-rato IgG1 |
| Alexa 488 | Invitrogen | A-21131 | Fator de diluição: 1:200 Espécie: Cabra anti-rato IgG2a |
| Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 59883 | Fator de diluição: 1:200 Espécie: Cabra anti Coelho |
Referências
- Cajal, R. Y. Comparative Study of Sensory Areas of the Human Cortex. , Harvard University. (1899).
- Altman, J., Das, G. D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. J. Comp. Neurol. 124, 319-335 (1965).
- Kaplan, M. S.....
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Reimpressões e permissões
