É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

In vivo Eletroporação pós-natal e tempo-lapso de neuroblasto Migração na aguda fatias do cérebro do rato

13.1K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/50905

⸱

25 de novembro de 2013

 ,  ,  ,  , 
1Wolfson Centre for Age-Related Diseases, King's College London, 2David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Migração neuroblastos é um evento fundamental para a neurogênese pós-natal. Nós descrevemos um protocolo para a rotulagem eficiente de neuroblastos por eletroporação in vivo pós-natal e visualização posterior de sua migração utilizando time-lapse de imagens de fatias cerebrais agudas. Nós incluímos uma descrição para a análise quantitativa da dinâmica neuroblastos por rastreamento de vídeo.

Resumo

A zona subventricular (SVZ) é um dos principais nichos neurogénicos no cérebro pós-natal. Aqui, células progenitoras neurais proliferam e dão origem a neuroblastos, capazes de se mover ao longo do fluxo migratório rostral (RMS) em direcção ao bolbo olfactivo (OB). Esta migração de longa distância é necessário para a maturação posterior dos neurônios recém-nascidos no OB, mas os mecanismos moleculares que regulam este processo ainda não são claras. Investigando as vias de sinalização que controlam a motilidade neuroblasto não só pode ajudar a entender um passo fundamental para a neurogênese, mas também têm potencial regenerativo terapêutico, dada a capacidade desses neuroblastos atacar sites do cérebro afetadas por uma lesão, acidente vascular cerebral, ou degeneração.

Neste artigo descrevemos um protocolo detalhado para eletroporação in vivo pós-natal e posterior de imagens de lapso de tempo de migração neuroblastos na RMS do mouse. Eletroporação pós-parto pode eficientemente transfecção ZSV progenitorcélulas, que por sua vez geram neuroblastos que migram ao longo da RMS. Usando microscopia confocal girando time-lapse disco em culturas fatia agudas do cérebro, a migração neuroblastos pode ser monitorado em um ambiente que se assemelha de perto a condição in vivo. Além disso, a motilidade neuroblasto podem ser rastreados e analisados ​​quantitativamente. Como exemplo, descrevemos como usar in vivo pós-natal eletroporação de um plasmídeo expressando GFP para rotular e visualizar neuroblastos que migram ao longo das RMS. Electroporação de shRNA ou plasmídeos que expressam CRE recombinase em ratinhos knockout condicionais que empregam o sistema LoxP também pode ser utilizado para alvejar genes de interesse. Manipulação farmacológica de culturas de fatias cerebrais agudas pode ser realizada para investigar o papel de diferentes moléculas de sinalização em migração neuroblastos. Ao unir em eletroporação vivo com imagens de lapso de tempo, esperamos compreender os mecanismos moleculares que controlam a motilidade neuroblasto e contribuir para o desenvolvimentomento de novas abordagens para promover a reparação do cérebro.

Introdução

No cérebro de mamíferos, a geração de novos neurónios (neurogénese) ocorre após o nascimento, principalmente em duas regiões, da zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais e a zona subgranular no giro dentado do hipocampo 1. Evidências consideráveis ​​se reuniram nos últimos anos suporta um papel crítico para a neurogênese pós-natal em funções de memória do hipocampo e bulbo olfatório 1-3. É importante ressaltar que a neurogênese pós-natal também tem potencial terapêutico por causa de sua relação com doenças neurológicas degenerativas, bem como a capacidade de neuroblastos para migrar para locais feridos no cérebro 4-6.

A zona subventricular (SVZ) surgiu recentemente como um nicho neurogênico crucial. Neuroblastos ZSV derivados migram para o bulbo olfatório (OB) através do fluxo migratório rostral (RMS), tornando este o processo de migração mais longa do 1,7,8 cérebro pós-natal. A / RMS / sistema OB mamíferos ZSV tornou-se ummodelo útil para estudar os diferentes passos de neurogênese, como proliferação, migração e diferenciação 1,8. Muitos fatores de crescimento e sinais extracelulares regulam a neurogênese ZSV e migração ao longo das RMS, mas os mecanismos moleculares intracelulares estão longe de ser totalmente compreendida 1,9. Migração adequada ao longo das RMS é crucial para a maturação posterior dos neurônios recém-nascidos 10. Além disso, alguns estudos têm mostrado que neuroblastos ZSV derivados podem migrar para fora da RMS para locais de lesão cerebral 4-6,11-13. Assim, investigar a migração neuroblastos mecanismos de sinalização de regulação é fundamental não só para entender a neurogênese, mas também para potenciais aplicações terapêuticas.

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para rotular progenitores neurais SVZ por eletroporação in vivo pós-natal e acompanhar sua migração ao longo das RMS em culturas agudos fatia cérebro usando time-lapse confocal disco giratório microscopiapy. A electroporação é amplamente utilizado em estudos de desenvolvimento embrionário a partir de fases adultas 14-18. É uma ferramenta poderosa para direcionar e manipular progenitores neurais SVZ e representa uma alternativa mais barata e consideravelmente mais rápido a injeção estereotáxica de vetores virais ou geração de modelos transgênicos 1,15,19,20. É um procedimento relativamente simples que não precisa de cirurgia e tem altas taxas de sobrevivência. Eletroporação de shRNA ou CRE plasmídeos expressando recombinase em modelos genéticos de mouse que utilizam o sistema LoxP pode ser usado para alvejar genes de interesse ou para alcançar marcação permanente de progenitores SVZ, representando, portanto, uma ferramenta útil para os estudos de neurogênese adulta 21,22.

Imagem RMS neuroblasto migração no cérebro intacto ainda é um desafio devido a limitações técnicas atuais. No entanto, este processo pode ser monitorado usando disco confocal fiação microscopia de lapso de tempo de fatias cerebrais agudas, que proporcionam um sist adequadolos muito parecidas com a condição in vivo também passível de manipulação farmacológica 23,24. Acoplamento em electroporação pós-natal in vivo com imagiologia de lapso de tempo irá facilitar a compreensão dos mecanismos moleculares que controlam a motilidade neuroblastos e contribuir para o desenvolvimento de novas abordagens para promover a reparação do cérebro.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Este procedimento está de acordo com os Regulamentos do Reino Unido O Home Office (Lei procedimentos científicos animal, 1986). Os cientistas devem seguir as diretrizes estabelecidas e aprovadas pelos organismos reguladores animais institucionais e nacionais.

1. Pós-Natal Eletroporação

1.1. Preparação de capilares de vidro, solução de ADN e Electroporator

  1. Prepare capilares de vidro puxado (OD: 1,5 mm, ID: 0,86 mm) para injeção de DNA. (Configurações indicativos para um extrator capilar Sutter P-97 são: Heat 283; Puxe 50; Velocity 90; Tempo 50). Fazer uma marca no capilar que corresponde a um volume de cerca de 2 ul.
  2. Ajuste a tensão da electroporador para 5 pulsos quadrados, 50 ms / pulso a 100 V, com 850 intervalos ms (100 V, pulso em 50 ms, pulso OFF 850 ​​ms, pulso 5).
  3. Dilui-se de elevada pureza (OD 260/280> 1.80) isenta de endotoxina plasmídeo de DNA para uma concentração final de 1-2 mg / mLcom endotoxina libertar tampão de Tris-EDTA, ou PBS. Recomenda-se adicionar 0,1% de Fast Green para a solução de ADN (o corante deve espalhar no ventrículo quando injectados com sucesso).
  4. Prepare os eletrodos 5-7 mm, o gel do eletrodo e aquecer a almofada de aquecimento.

1.2. Eletroporação

  1. Retirar um dia pós-natal do rato 2 filhote de gaiola e anestesiar lo por inalação de isoflurano (a um caudal de ~ 0,6 L / min).
  2. Após aproximadamente 1 min, determinar o estado de anestesia por meio da resposta pé pitada. Se ocorrer nenhum movimento, continue com injeção intraventricular.
  3. Carregar agulha capilar com 1-2 ul de ADN, utilizando um tubo de aspirador ligado ao capilar.
  4. Com uma fonte de luz fria, segure a cabeça do filhote entre o polegar eo dedo indicador de sua mão menos dominante. Ligeiramente puxar a pele para trás na cabeça para ajudar a identificação do ponto de injeção direita.
  5. Considere uma linha virtual entre o olho ea tele craniométricas marco lambda (Figura 1A). Inserir a agulha capilar em cerca de um terço do comprimento da linha de lambda (cerca de 1 mm a partir do ponto médio linha 15). Insira o capilar de cerca de 2 mm de profundidade, tornando-se de evitar a penetração profunda no cérebro.
  6. Injectar plasmídeo fundindo lentamente através da boca (uma seringa ligada ao capilar também pode ser utilizado). Durante este procedimento, certifique-se de que seus dedos não estão aplicando demasiada pressão sobre o cérebro, pois isso pode evitar injeção de sucesso plasmídeo.
  7. Pare injecção, quando uma quantidade mínima de solução de ADN é deixado no capilar. É aconselhável administrar com menos do que 1 ml para evitar o aumento pernicioso da pressão intracraniana.
  8. O revestimento de gel com os dois eléctrodos e colocá-las com o lado positivo sobre o lado lateral do hemisfério, onde o ADN foi injectada (Figura 1A). Por incorporação de DNA no ZSV rostral, colocar eletrodos levemente rostral aoponto de injeção. Variando posição do eletrodo pode alcançar especificidade regional de eletroporação em diferentes áreas do ZSV 22,25.
  9. Iniciar transferência atual, pressione o pedal de pulso pedal. Quando a eletroporação é completa, verifique a tensão no visor electroporador (valores de tensão não deve ser inferior a 90 V, uma vez que os valores mais baixos de tensão se correlacionam com baixa eficiência eletroporação).
  10. Reanimar o filhote sob oxigênio na almofada de aquecimento por alguns minutos e devolvê-lo à gaiola, colocando-o para longe da mãe. Certifique-se de que a mãe recupera o cachorro e se reúne com o resto da ninhada. Depois de eletroporação, deixe os filhotes com a mãe para 4-7 dias antes da próxima etapa.

2. Preparação das Culturas aguda do cérebro Fatia

2.1. Preparação de soluções e ferramentas

  1. As soluções que se seguem são necessárias (isto é também possível a utilização de DMEM-elevado teor de glicose para dissecar e imagiologia17):
    Dissection Médio (500 ml)
    Mídia equilibrada de Gey - 500ml
    45% de Glicose - 5ml
    Médio Filme (10 ml)
    45% de Glicose - 0.110 ml
    HEPES 1 M - 0,100 ml
    Pen / Strep - 0,100 ml
    FCS - 0.500 ml
    B27 - 0,100 ml
    Glutamina - 0.200 ml
    Dulbecco Modified Eagle Medium (vermelho de fenol-livre) - 8,89 ml
  2. Meio de aquecimento filme a 37 ° C.
  3. Coloque Millicell insere em um prato de cultura de fundo 35 milímetros de vidro contendo 1 ml de meio de filme e colocar num incubador humidificado a 37 ° C / 5% de CO 2.
  4. Prepare vibratome acessórios (chave de fenda, câmara, lâminas de barbear, cola).
  5. Prepare ferramentas de dissecação: tesouras, pequena espátula, pinça retas.
  6. Preparar as ferramentas para lidar com fatias: pincel pequeno ou loop inoculação suave (tamanho: 10 mL), pipetas Pasteur de plástico, uma caixa de gelo e vários pratos de plástico 6 cm.
  7. Pré-resfriar o meio de dissecçãoa 2-4 ° C.

2.2. Preparação de fatias do cérebro

  1. Encha um prato com seis centímetros médio dissecção resfriadas e colocá-lo em gelo (para manter fatias recém-cortadas).
  2. Após deslocamento cervical, use uma tesoura para decapitar o filhote do rato. Remover o couro cabeludo com um bisturi, cortar o crânio, ao longo da sutura sagital médio do OB para o cerebelo e remover suavemente as abas cranianos utilizando fórceps. Certifique-se de todo o cérebro é exposto e dissecar cuidadosamente-lo usando uma espátula, tendo especial cuidado para não danificar o tecido. A dissecção tem de ser feito com cuidado, mas ao mesmo tempo muito rapidamente (menos do que um minuto, se possível). Deslocação cervical é o nosso método preferido porque anestesia terminais com anestésicos drogas / gás pode influenciar as propriedades migratórias dos neuroblastos eo estado de saúde das culturas fatia do cérebro, que precisam ser trabalhada de forma relativamente rápida após o sacrifício de animais.
  3. Hemisect o cérebro com uma razou lâmina (Figura 2). Descarte hemisfério não injectado ou utilizar para outros experimentos.
  4. Coloque um pequeno pedaço de fita adesiva no porta-vibratome e usar a quantidade mínima necessária de cola para fixar o hemisfério cerebral em cima dela (Figura 2). Isso evita danos da superfície do suporte devido a repetidas aplicações de cola.
  5. Deixe a cola secar por alguns segundos.
  6. Coloque o suporte na bandeja do vibratome preenchido com solução dissecção pré-resfriado. O ponto do bolbo olfactivo em direcção da lâmina (Figura 2).
  7. Comece cortando o hemisfério cerebral usando as configurações apropriadas. Os parâmetros a seguir são recomendadas: espessura do corte 300 mm, a velocidade ~ 3-5; freqüência ~ 9. De alta freqüência e baixa velocidade são recomendados para evitar danos à fatia.
  8. Colete fatias usando um pincel pequeno ou um loop inoculação macio. Apenas manter fatias com OB visível (geralmente 2-3 fatias / cérebro). Tipicamente, a fatia contendo a maior parte dos ca RMSn ser encontrada em ~ 300 mm a partir da superfície de fundo.
  9. Verifique fatias sob um microscópio fluorescente padrão para o sinal GFP (certificando-se para lançá-los ao longo de verificar fluorescência em ambos os lados), e escolha os que apresentaram fluorescência ao longo da maioria dos RMS.

2.3. Cultivar fatias do cérebro do

  1. Em uma capa de cultura celular, cortar o terceiro mais caudal da fatia do cérebro e eliminar quaisquer vestígios de cola usando uma pinça reta finas ou um bisturi microdissection.
  2. Delicadamente aspirar a fatia usando uma pipeta Pasteur de plástico (corte a ponta da pipeta para criar uma abertura maior, isso vai evitar danos a fatia) e colocá-lo no centro de um pré-aquecido Millicell inserção.
  3. Certifique-se de lado, com o sinal fluorescente brilhante é colocado em contacto com o Millicell inserir (para imagens com um microscópio invertido).
  4. Remover o excesso de solução de dissecção no topo do inserto com uma pipeta.
  5. Deixe culturas fatia paraestabelecer-se a 37 ° C / 5% de CO2 durante pelo menos 1 hr antes de imagem.

3. Time-lapse de imagens de Migração neuroblasto

  1. Pelo menos 2 horas antes de imagem, ligue o sistema de Perkin Elmer UltraViewVoX disco confocal fiação, invertido Nikon Ti-E microscópio, Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2), arrefecido câmera CCD digital, e sistema de aquecimento (Solent Scientific), fixado em constante temperatura de 37 ° C.
  2. Abra o módulo de aquisição de software Volocity e clique no botão "Viz" e selecione o laser (s) para a imagem latente.
  3. Dentro de 2 horas de cérebro preparação fatia, coloque o prato fundo de vidro que contém a fatia do cérebro na câmara de imagem no palco microscópio.
  4. Utilize uma objectiva Nikon CFI Super Plano Fluor ELWD 20X/0.45 sob a luz fluorescente apropriado para selecionar e focar a área da fatia que vai ser trabalhada (por exemplo, a primeira parte descendente dos RMS logo após o local da injeção, ou o Elbow região das RMS, ou logo após o cotovelo antes neuroblastos entrar no OB).
  5. Configure a imagem time-lapse com as seguintes ações:
    1. No microscópio, clique no botão L100 para permitir a digitalização a laser da amostra.
    2. Em Volocity, abra o UltraView Laser Changer, selecionando o laser adequado (por exemplo, 488 nm laser para GFP).
    3. Ajustar o tempo de exposição (normalmente entre 100-500 ms) e a intensidade do laser (geralmente 20-30%) em função da intensidade do sinal fluorescente.
    4. Ajuste o ganho digital de imagem para melhorar a visualização celular.
    5. Selecione o intervalo de z-stack de imagem dentro da fatia do cérebro (geralmente ao longo de um intervalo de 100-120 mm). Escolha de um intervalo com um número adequado de células isoladas a fim de evitar possível sobrepor tanto quanto possível (isto irá facilitar a análise subsequente de rastreamento).
    6. Seleccione o espaçamento entre cada imagem z pilha (geralmente 2-4 mm) entre.
    7. Escolha o tempo intErval entre cada captura z pilha (por exemplo, 3 min) e a duração de imagem total (por exemplo três horas).
    8. Clique no ícone "salvar" para salvar as alterações nos parâmetros de imagem.
    9. Pressione o botão de gravação para iniciar a imagem.
  6. Imagiologia alternativo de amostras de controlo e experimentais (por exemplo, tratamento do veículo / fármaco ou diferentes plasmídeos electroporadas) ao longo do mesmo dia.

4. Analisando neuroblasto Migração

  1. No módulo Volocity quantificação, abra a biblioteca desejada criado depois de completar um experimento de time-lapse. Selecione "Focus prolongado" da caixa superior esquerdo (Figura 4A, passo 1).
  2. Clique na aba "Medidas" para exibir a janela de medição (Figura 4A, passo 2).
  3. Uma lista de tarefas é visível no canto inferior esquerdo da tela. Arraste "Track" (presente no âmbito do "Diversos" título na parte inferior daa lista) no espaço acima. Isto irá pedir a abertura de uma nova janela chamada "Track" no topo seção esquerda da tela (Figura 4A, etapa 3).
  4. Selecione "Pontos" na guia "Input" na janela Track (Figura 4A, passo 4).
  5. Clique na ferramenta Ponto (Figura 4A, passo 5).
  6. Começar a controlar a migração de neuroblastos, clicando com o mouse sobre a área central do corpo celular e manter o acompanhamento do movimento das células até o último instante do lapso de tempo é atingido (por exemplo ponto número 61 para um filme de longa hr-3) .
  7. Para obter os dados, escolha "Fazer item Medição" no menu Medidas (Figura 4B, os passos 6-7). Uma janela irá aparecer no centro da tela.
  8. Nesta janela, selecione "Um novo item de medição chamado:" e digite um nome (Figura 4C, passo 8). Lembre-se de selecionar a opção "Todos os pontos temporais" antes de pressing OK (Figura 4C, passo 9). Um arquivo de item de medição aparecerá sob o arquivo time-lapse e conterá os parâmetros de análise quantitativa (por exemplo, a distância de migração, velocidade, deslocamento, e de taxa de deslocamento).
  9. Dê um duplo clique no arquivo do item de medição para abri-la como uma janela (Figura 4D, passo 10).
  10. Para visualizar as faixas individuais de células analisadas, escolha "Ponto de rastos" entre as opções "Display" (Figura 4D, etapa 11).
  11. Botão direito do mouse sobre o arquivo do item Medição e exportá-lo como um arquivo de texto, que pode então ser importado em programas como o Excel para analisar parâmetros de migração.
  12. Para medir movimentos entre quadros consecutivos e pausas feitas por cada célula durante o período de filmagens, no arquivo do item de medição selecionar a opção "Exibir" opções "Ponto" ou "populações" e clique no ID (cada faixa tem uma identificação única). Exportar o arquivo resultante de procederção, tal como explicado no passo 4.10.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Etiquetagem de neuroblastos migratórias SVZ derivados podem ser observadas ao longo da RMS, normalmente 4-8 dias depois de um bem sucedido electroporação (Figura 1B). Os pontos de tempo mais longos, também pode ser escolhido, mas menos células serão encontrados na RMS vez que a maioria terá entrado no OB. Os neuroblastos iniciar a aquisição de morfologia típica e características de células granulares maduros no OB de cerca de 2-3 semanas após a electroporação (não mostrado). Depois de cultura para ~ 1 h...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Migração eficiente de progenitores neurais ao longo das RMS garante sua maturação posterior em neurônios funcionais 10. Fluxos importantes de progenitores neurais voltadas para o OB são visíveis na infância humana e são susceptíveis de desempenhar um papel importante no início de pós-natal o desenvolvimento do cérebro humano 27. Além disso, essas células são capazes de atingir locais do cérebro afetadas por lesões e neurodegeneração 4,28. Ser capaz de monitorar em tempo real o efeito de ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

MS e YZ são suportados pelo KCL e KCL-China bolseiros de doutoramento. MO foi financiado por uma Biotecnologia e PhD Ciências Biológicas Research Council studentship. Agradecemos Masaru Okabe e Jun-ichi Miyazaki para o plasmídeo PCX-EGFP e Alain Chedotal e Athena Ypsilanti para conselhos valiosos sobre eletroporação.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
MillicellMilliporePICM0RG50
35 mm Prato de cultura com fundo de vidroMatTekP35G-0-14-C
Mídia balanceada Gey'sSigmaG9779-500ML
Glicose, 45%SigmaG8769-100ML
HEPESSigmaH3375-25G
Pen/ StrepGIBCO15140-122
FCSGIBCO10109-163
suplemento B27Invitrogen Life Technologies17504044
L-GlutaminaInvitrogen Life Technologies25030-081
DMEM (sem fenol vermelho)GIBCO31053-028
Fast GreenSigmaF7252-5G
Capilares de vidro para injeçãoHarvard Apparatus30-0057
Tubo de aspiraçãoSigmaA5177
Sutter P-97 extrator capilarSutter InstrumentoP-97
ECM830 Eletroporador de onda quadradaHarvard Apparatus45-0052
Platinum Tweezertrodes 7 mmHarvard Apparatus45-0488
Pedal Modelo 1250FHarvard Apparatus45-0211
Gel para eletrodosCefar Compex6602048
IsofluranoMerialAP/DRUGS/220/96
VibratomeLeicaVT1000S
ColaRoti collRoti coll 1
UltraViEW VoX sistema de disco giratórioPerkin ElmerConfiguração personalizada (podem ser utilizadas várias fontes de laser) equipado com Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B Câmera CCD
Software VolocityPerkin ElmerMódulos de Aquisição, Quantificação, Visualização Câmara
ambiental para microscopiaSolent Scientific
Microscópio invertido Ti-ENikonA objetiva CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0,45 NA é recomendada para a aplicação descrita neste artigo
feito à medida

Referências

  1. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
  2. Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and. 11, 339-350 (2010).
  3. Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction? Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
  4. Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
  5. Emsley, J. G., Hagg, T. alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain. Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).
  6. Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).
  7. Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).
  8. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
  9. Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
  10. Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
  11. Gotts, J. E., Chesselet, M. F. Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury. J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).
  12. Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury. Brain Res. 996, 213-226 (2004).
  13. Romanko, M. J., et al. Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury. Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).
  14. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  15. Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS One. 3, e1883(2008).
  16. Barnabe-Heider, F., et al. Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation. Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).
  17. Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
  18. Pathania, M., et al. miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons. PloS One. 7, e38174(2012).
  19. dal Maschio, M., M,, et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat. Commun. 3, 960(2012).
  20. Oudin, M. J., et al. Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).
  21. Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, (2010).
  22. Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J. Vis. Exp. (72), e50197(2013).
  23. Nam, S. C., et al. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
  24. James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy. Front. Neurosci. 5, 30(2011).
  25. Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Dev. 6, 13(2011).
  26. Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone. J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).
  27. Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
  28. Tattersfield, A. S., et al. Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington's disease. Neuroscience. 127, 319-332 (2004).
  29. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  30. Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
  31. Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain. J. Vis. Exp. (67), e4061(2012).
  32. Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
  33. Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
  34. Schaar, B. T., McConnell, S. K. Cytoskeletal coordination during neuronal migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).
  35. Valiente, M., Marin, O. Neuronal migration mechanisms in development and disease. Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).
  36. Comte, I., et al. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
  37. Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Eletropora o In VivoCorrente Migrat ria RostralMicroscopia ConfocalRastreamento CelularMarca o com GFPTransfec o de Plasm deosDisco Girat rio
In vivo Eletroporação pós-natal e tempo-lapso de neuroblasto Migração na aguda fatias do cérebro do rato
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.