Artigo de método
Foram utilizadas técnicas de microscopia e processamento de imagem com lapso de tempo para observar e analisar a compactação de gel mediada por fibroblasto e o realinhamento da fibra fibrina em um bioreator ambientalmente controlado durante um período de 48 horas.
Células embutidas em géis de colágeno e fibrina ligam e exercem forças de tração sobre as fibras do gel. Essas forças podem levar à reorganização local e global e ao realinhamento da microestrutura de gel. Esse processo prossegue de forma complexa e dependente, em parte, da interação entre a localização das células, a geometria do gel e as restrições mecânicas do gel. Para entender melhor como essas variáveis produzem padrões globais de alinhamento de fibras, usamos microscopia de contraste diferencial de impacto de lapso de tempo (DIC) juntamente com um bioreator ambientalmente controlado para observar o processo de compactação entre explantas geométricas espaçadas (clusters de fibroblastos). As imagens são então analisadas com um algoritmo de processamento de imagem personalizado para obter mapas da cepa. As informações obtidas a partir desta técnica podem ser usadas para sondar a mecanobiologia de várias interações de matriz celular, o que tem implicações importantes para a compreensão de processos em aplicações de cicatrização de feridas, desenvolvimento de doenças e engenharia de tecidos.
Uma ferramenta importante para estudar as interações entre células e matrizes é o gel de colágeno povoadocelular 1,2. O gel fornece um ambiente 3D mais próximo do caráter in vivo do tecido e mais adequado para entender o comportamento celular do que é oferecido pelas culturas 2D tradicionais3. Estudos iniciais nos quais os fibroblastos foram distribuídos de forma homogênea dentro de um gel de colágeno descobriram que as células consolidam rapidamente as fibras de colágeno e compactam o gel4,5. Os fibroblastos contratuais em géis flutuantes livres então transitam para um estado quiescente logo após o gel ter atingido totalmente....
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1. Preparação de estêncil
Prepare um estêncil no Parafilm para layout da localização de cada explanta, seguindo a geometria desejada (Figuras 1A e 1B). Espaço cada explante aproximadamente 1-2 mm de distância. Essa distância corresponde a um espaçamento ideal para gerar alinhamento de fibras entre explantas. Fixar o estêncil sob a área da tampa onde a amostra será preparada com fita.
2. Esterilização
Limpe completamente todos os componentes do bioreator usando 70% de etanol e esterilize por 2-3 horas sob luz UV antes da experimentação. Se ....
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A remodelagem tecidual é um processo complexo que é impulsionado em parte por interações físicas recíprocas entre as células e a matriz circundante. As células reorganizam as fibras circundantes e geram tensão na rede de fibras. O alinhamento das fibras e do ambiente mecânico, por sua vez, controla o comportamento celular, de modo que tanto as células quanto a matriz globalmente se reorganizam para produzir tecido remodelado. Neste experimento, as células das explanações, inicialmente redondas em morfologia, começaram a .......
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Este protocolo foi desenvolvido com o objetivo de observar e quantificar a mecânica envolvida na remodelação do ECM mediado por células. Tais processos estão por trás de uma série de fenômenos biológicos e têm implicações importantes para os tecidos de engenharia2,22, reduzindo a cicatriz1,23, e entendendo a remodelação do tecido patológico12,24. O uso de microscopia DIC de lapso de tempo permite resolver e quantificar o deslocamento e o alinhamento das fibras fibrinas que ocorrem como re.......
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Nenhum conflito de interesses declarado.
Agradecemos a George Giudice e Steven Eliason por doarem fibroblastos dérmicos humanos e Ramesh Raghupathy por ajuda com o algoritmo de rastreamento de cepas. O apoio a este trabalho foi fornecido por um Departamento de Educação do Departamento de Educação dos EUA em Áreas de Bolsa de Necessidade Nacional (GAANN P200A120071).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sigma-Aldrich | F8630 | ||
| Sigma-Aldrich | T4648 | ||
| Gibco | 11965-092 | ||
| Gibco | 15140-122 | ||
| Sigma-Aldrich | A2942 | ||
| Sigma-Aldrich | H0887 | ||
| Sigma-Aldrich | 223506 | ||
| Gibco | 25200-056 | ||
| Invitrogen | 3000 | ||
| Lonza | DE14-701F | ||
| Sondas Moleculares | F8858 | ||
| GIBCO | A10483-01 | ||
| GIBCO | 11430-030 | ||
| Fisher-Scientific | SS264-1 | ||
| Sigma-Aldrich | A3428-25MG | ||
| Biotense Bioreactor | ADMET | ||
| Ti-Eclipe Microscópio | Nikon | ||
| # 0 35 mm Placa de Petri com Fundo de Vidro | MatTek | P35G-0-20-C | |
| # 0 35 mm Placa de Petri com Tampa de Vidro | MatTek | P35GTOP-0-20-C | |
| Conexões Luer de plástico, tubulação de PVC com extremidades Luer | Cole-Parmer | 30600-65 |
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