Avaliação quantitativa de neutrófilos humanos migração através de um Cultivadas bexiga Epitélio

Resumo

Desenvolvemos um modelo in vitro que mimetiza um componente importante da resposta inflamatória aguda durante a infecção da bexiga por Escherichia coli uropatogênica. O ensaio de migração transuroepitelial de neutrófilos permite a avaliação quantitativa da migração de neutrófilos humanos através do epitélio da bexiga, cultivada em suportes permeáveis, em resposta a infecções bacterianas ou substâncias quimioatraentes.

Resumo

O recrutamento de células do sistema imunológico da periferia para o local da inflamação é um passo essencial na resposta imune inata a qualquer superfície mucosa. Durante a infecção da bexiga urinária, os leucócitos polimorfonucleares (PMN; neutrófilos) migram da corrente sanguínea e atravessar o epitélio da bexiga. A incapacidade de resolver a infecção, na ausência de uma resposta neutrofílica demonstra a importância de PMN em defesa da bexiga. Para facilitar a colonização do epitélio da bexiga, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), o agente causador da maioria das infecções do tracto urinário (ITU), atenuar a resposta inflamatória aguda, utilizando uma variedade de mecanismos parcialmente definidas. Para investigar ainda mais a interacção entre o hospedeiro eo agente patogénico bacteriano, foi desenvolvido um modelo in vitro do presente aspecto da resposta imune inata a UPEC. No ensaio de migração de neutrófilos transuroepithelial, uma variação na câmara de Boyden, epith bexiga cultivadasElial células são cultivadas até à confluência na parte inferior de um suporte permeável. PMN são isolados a partir de sangue venoso humano e são aplicados para o lado basolateral das camadas de células epiteliais da bexiga. Migração PMN representando a direcção basolateral-para-apical fisiologicamente relevante, em resposta a uma infecção bacteriana ou moléculas quimioatratantes é enumerada utilizando um hemocitómetro. Este modelo pode ser usado para investigar interacções entre UPEC e células eucarióticas, bem como para interrogar os requisitos moleculares para a passagem do epitélio da bexiga por PMN. O modelo de migração de neutrófilos transuroepithelial irá promover nossa compreensão da resposta inflamatória inicial para UPEC na bexiga.

Introdução

O movimento das células através do corpo, muitas vezes através de longas distâncias, é necessário para o crescimento e desenvolvimento, a cicatrização de feridas, e a resposta imune. A migração celular é complexo e requer coordenação de muitos processos diferentes, incluindo cascatas de sinalização e o rearranjo dos componentes do citoesqueleto. As células podem se mover de forma aleatória (quimiocinese), bem como para gradientes químicos definidos (quimiotaxia). Muitas técnicas têm sido desenvolvidas para estudar a migração celular in vitro. A técnica mais antiga e mais comum, a câmara de Boyden, que consiste num sistema de duas câmaras verticais, onde uma substância quimioatractiva é colocada na câmara inferior e as células de interesse são colocados na parte superior da câmara ^1. O movimento das células através do filtro permeável, com poros de tamanho definido, que separa as duas câmaras é controlada. Outras técnicas têm sido desenvolvidas para investigar a migração de células, incluindo a câmara de Zigmond ² e a câmara de Dunn^3. Estas abordagens coletivas produziram um panorama significativo para o movimento de muitos tipos celulares diferentes.

Além interrogar os princípios básicos da quimiocinese e quimiotaxia, ensaios de duas câmaras têm facilitado a investigação da migração de células através de componentes da matriz extracelular e as duas camadas de células endoteliais e epiteliais. Uma vantagem de sistemas de duas câmaras em relação a outras técnicas é que a membrana porosa pode ser revestida com proteínas tais como colagénio ou fibrinogénio, e a migração de células através de uma barreira de matriz extracelular, como pode ser apreciado. Além disso, as linhas de células cultivadas pode ser cultivada e diferenciado sobre os suportes permeáveis. Para investigar o movimento das células através de uma barreira endotelial, células endoteliais cultivadas são semeadas e cultivadas no reservatório superior dos suportes permeáveis. Células móveis, tais como células do sistema imunológico, são adicionados ao reservatório superior e a migração para dentro do reservatório inferior do outro lado da enbarreira endotelial no sentido fisiológico apical-para-basolateral é observada. Este modelo tem sido inestimável na compreensão de extravasamento de células do sistema imunológico para fora da corrente sanguínea. Em contraste com a migração transendotelial, o movimento das células através de uma barreira epitelial ocorre tipicamente no sentido basolateral-para-apical. A fim de modelar estas eventos in vitro, os investigadores sementes e crescer as células epiteliais cultivadas na parte inferior dos suportes permeáveis. Células móveis são adicionados ao reservatório superior e da migração através da barreira epitelial, que representa a direcção basolateral-para-apical, é monitorado. Tais modelos de migração transepitelial têm contribuído significativamente para a nossa compreensão de respostas inflamatórias na superfície das mucosas, principalmente os de pulmão e intestino ^4,5.

Em contraste, o tráfico de células imunitárias através do epitélio do tracto urinário tem recebido menos atenção. Para reforçar ainda mais a nossa understanding de respostas imune inata no trato urinário durante a infecção com uropatogênica Escherichia coli (UPEC), desenvolvemos um ensaio in vitro, o ensaio de migração de neutrófilos transuroepithelial, que permite a investigação de leucócitos polimorfonucleares (PMN; neutrófilos) o movimento através de uma barreira epitelial da bexiga ^{6 -8.} Tal como com outros modelos de duas câmaras de migração transepitelial, bexiga células epiteliais humanas cultivadas são crescidas na parte inferior de um suporte permeável e formar camadas epiteliais confluentes. Os neutrófilos humanos, isolados a partir de sangue venoso, são aplicados para o lado basolateral da camada epitelial, e migração através do epitélio na direcção basolateral-para-apical fisiologicamente relevante é quantificada em resposta à infecção por diferentes estirpes de E. coli ou a presença de moléculas de quimioatratantes. Muita investigação focou no movimento de neutrófilos, tanto quimiocinese e quimiotaxia, na ausência de tipos de células adicionais. O ensaio de migração de neutrófilos transuroepithelial é vantajosa, uma vez que leva em conta as interações complexas entre as células epiteliais da bexiga e células do sistema imunológico durante a infecção. Este modelo in vitro tratável tem o potencial de permitir a investigação aprofundada das respostas imunitárias em superfícies uroepiteliais.

Protocolo

1. Cultura de 5637 células epiteliais da bexiga

Execute as etapas a seguir em uma capa de cultura de tecidos de fluxo laminar preparada com irradiação UV e limpa com etanol a 70%.

1. Prepare o meio RPMI-1640 contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) [denominado RPMI+], esterilize por filtro usando um filtro de tamanho de poro de 0,22 μm e aqueça a 37 ° C em banho-maria.
2. Descongelar um criovial de 5637 células (American Type Culture Collection HTB-9; derivado de carcinoma de bexiga) em banho-maria a 37 °C. Transferir rapidamente as células descongeladas para um balão de cultura de^{tecidos 2} de 75 cm contendo 20 ml de RPMI+.
3. Incubar o balão a 37 °C numa atmosfera humidificada com 5% de CO₂ até que as células estejam aproximadamente 95% confluentes (~6 x 10⁶ células por frasco), cerca de 4 dias.
4. Para subcultivar as 5637 células:
   1. Retirar o meio do balão. Lave as células com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) à temperatura ambiente.
   2. Adicionar 6 ml de tripsina a 0,05% de tripsina morna (37 °C) e solução de EDTA a 0,02% ao balão e incubar a 37 °C com CO₂ a 5% durante 15 min.
   3. Transferir as células para um tubo cónico de 15 ml e granular por centrifugação a 300 x g durante 5 min. Retirar a solução de tripsina/EDTA.
   4. Ressuspender as células em 6 ml de RPMI+ (10⁶ células/ml) e transferir 1 ml (10⁶ células) para um novo balão de 75 cm² contendo 20 ml de RPMI+.
5. Repita a etapa 1.4 para subcultivar células a cada 4 dias ou quando as células atingirem 95% de confluência.

2. Semeando e Cultivando 5637 Células em Suportes Permeáveis

Execute as etapas a seguir em uma coifa de cultura de tecidos usando técnica asséptica. Para obter os melhores resultados, use 5637 células que passaram por menos de 10 subculturas.

1. Usando uma pinça estéril, inverta os suportes permeáveis em uma placa de cultura de tecidos estéreis de 25 mm de profundidade.
2. Tripsinizar um balão de 75 cm² de 5637 células a 95% de confluência, de acordo com os passos 1.4.1-1.4.3.
3. Usando uma pipeta de 1.000 μl, ressuspenda suavemente as células em ~ 2 ml de RPMI + a uma concentração de 3 x 10⁶ células / ml, determinada pela contagem de células usando um hemocitômetro.
4. Aplique 50 μl da suspensão celular (1,5 x 10⁵ células) em cada suporte permeável sem tocar na membrana. Tampe o prato e coloque-o cuidadosamente a 37 °C com 5% de CO₂ por no máximo 16 horas.
5. Usando uma pinça estéril, coloque os suportes permeáveis em uma placa de 24 poços contendo 0,6 ml de RPMI+ por poço. Adicionar 0,1 ml de RPMI+ ao reservatório superior de cada suporte permeável. Incubar a 37 °C com 5% de CO₂.
6. Substitua o meio a cada 2 dias. Primeiro, aspirar o meio do reservatório superior seguido do reservatório inferior e, em seguida, aplicar RPMI+ fresco na ordem inversa, no reservatório inferior (0,6 ml) e depois no reservatório superior (0,1 ml).
7. Sete dias após a semeadura dos suportes permeáveis com 5637 células, avaliar a confluência das células. Encha o reservatório superior com RPMI+ (~0,35 ml). As células são suficientemente confluentes quando o meio não se equilibra entre os reservatórios superior e inferior.

3. Preparação do Inóculo Bacteriano

1. Adicionando 20 ml de caldo de cultura adequado a um balão de 250 ml com tampa, utilizando uma técnica asséptica. Use o caldo Luria-Bertani (LB) para culturas de E. coli e adicione antibióticos ao caldo quando apropriado.
2. Usando um loop de inoculação estéril, inocule o caldo com bactérias de um estoque de glicerol ou de uma placa de listra. Para cepas UPEC, incubar a cultura bacteriana a 37 °C por aproximadamente 16 horas, sem agitar (para promover a produção de pili tipo 1).
3. Transfira a cultura bacteriana para um tubo de centrífuga. Pulverize as bactérias por centrifugação a 8.000 x g por 10 min.
4. Decantar o sobrenadante e ressuspender as bactérias em PBS a OD₆₀₀ = 1.000, equivalente a ~10⁹ UFC/ml.
   1. Para gerar um estímulo bacteriano morto pelo calor, incubar uma alíquota (por exemplo, ~ 1,5 x 10⁸ UFC em 150 μl) das bactérias ressuspensas a 55 ° C por 30 min. Coloque uma alíquota da suspensão morta pelo calor para confirmar a morte bacteriana.
5. Imediatamente antes do uso, dilua as bactérias ressuspensas (vivas ou mortas pelo calor) 10 vezes para 10⁸ UFC / ml em RPMI sem soro quente [denominado RPMI-] em um tubo de microcentrífuga.

4. Isolamento de neutrófilos humanos do sangue periférico

A coleta de sangue de voluntários adultos requer revisão prévia e aprovação de um conselho de revisão institucional. Use equipamento de proteção individual adequado e descarte adequadamente os materiais perigosos para evitar a exposição ao sangue humano.

1. Aproximadamente 25 ml de sangue venoso de um voluntário adulto saudável devem ser aspirados para 3 tubos estéreis de coleta de sangue contendo heparina sódica por uma equipe treinada em flebotomia.
   1. Enrole firmemente um torniquete de borracha ao redor do braço, acima do cotovelo.
   2. Desinfete o local de entrada, a fossa antecubital, usando um lenço estéril com álcool 70%.
   3. Prenda um suporte de tubo de plástico a um sistema de agulha borboleta alada.
   4. Insira a agulha em uma veia antecubital em um ângulo de 30° ou menos, chanfrado voltado para cima. A agulha perfurou a veia quando um jato de sangue aparece no tubo de plástico.
   5. Insira um tubo de coleta de sangue no suporte do tubo de plástico. Quando o primeiro tubo de coleta estiver cheio, substitua pelo segundo tubo de coleta. Repita com o terceiro tubo.
   6. Quando o terceiro tubo de coleta estiver aproximadamente meio cheio, remova o torniquete.
   7. Cubra o local da punção com uma bola de algodão estéril e retire lentamente a agulha da veia. Deslize o escudo protetor sobre a agulha e coloque em um recipiente para objetos cortantes de risco biológico.
   8. Aplique pressão no local da punção. Cubra o local da punção e a bola de algodão com um curativo adesivo.
   9. Inverta suavemente os tubos de coleta de sangue para dispersar a heparina.

Execute as etapas a seguir em uma capa de cultura de tecidos usando técnica asséptica.

2. Usando uma pipeta de 10 ml, transfira suavemente o sangue para um tubo cônico fresco e estéril de 50 ml. Adicione um volume equivalente de 3% (p / v) de dextrano em 0,9% de NaCl e misture por inversão. Incube o tubo na vertical em temperatura ambiente por 20 min.
3. Sem perturbar a camada inferior, aspirar cuidadosamente a camada superior e transferi-la para um novo tubo cónico de 50 ml. Pulverize as células por centrifugação a 300 x g por 10 min. Descarte o sobrenadante.
4. Ressuspenda o pellet celular em um volume de 0,9% de NaCl equivalente ao volume inicial de sangue.
5. Colocar 10 ml de solução de centrifugação por densidade sob a suspensão celular, preservando a interface entre as duas fases. Centrifugue a 400 x g por 30 min sem freio. Descarte o sobrenadante.
6. Para lisar os glóbulos vermelhos restantes, ressuspenda o pellet celular em 10 ml de NaCl frio a 0,2%. Incube por 30 segundos e, em seguida, adicione imediatamente 10 ml de NaCl frio a 1,6% para restaurar a isotonicidade.
7. Pulverizar as células por centrifugação a 300 x g durante 6 min. Rejeitar o sobrenadante.
8. Repita as etapas 4.6-4.7 até que o pellet celular pareça estar livre de glóbulos vermelhos, normalmente 3 rodadas de lise.
9. Usando uma pipeta de 1.000 μl, ressuspenda o pellet celular, principalmente PMN, em RPMI- quente (37 ° C) até uma concentração de 10⁷ células / ml, determinada por contagem de células usando um hemocitômetro. Mantenha as células a 37 °C até ao uso. Normalmente, a viabilidade e a pureza do PMN são >99%, conforme avaliado pela exclusão do azul de tripano e visualização da morfologia nuclear após a coloração, respectivamente.

5. Ensaio de migração transuroepitelial de neutrófilos

Execute as etapas a seguir em uma coifa de cultura de tecidos usando técnica asséptica. Use apenas suportes permeáveis com camadas de células 5637 confluentes, conforme determinado na etapa 2.7. As placas de 24 poços contendo RPMI- podem ser preparadas com antecedência e mantidas a 37 °C com 5% de CO₂ até o uso.

1. Alíquota de 1 ml de RPMI quente por alvéolo numa placa de 24 poços; preparar 3 alíquotas por suporte permeável.
2. Aspirar o meio dos reservatórios superior e inferior dos suportes permeáveis.
3. Usando uma pinça estéril, transfira os suportes permeáveis para a placa de 24 poços preparada na etapa 5.1. Lave os suportes permeáveis três vezes, transferindo-os de um poço para outro.
4. Se for utilizado um inóculo bacteriano, inverter os suportes permeáveis numa placa de cultura de tecidos estéreis de 25 mm de profundidade. Se um quimioatraente (por exemplo, N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) ou IL-8) for usado, prossiga para a etapa 5.6.
5. Para experimentos com estímulos bacterianos vivos ou mortos, inocular o lado apical de cada suporte permeável com 60 μl de RPMI- (infecção simulada) ou com o inóculo bacteriano (6 x 10⁶ UFC) preparado na etapa 3.5. Tampe o prato e incube a 37 °C com 5% de CO₂ por 1 hora.
6. Adicione 0,6 ml de RPMI- por alvéolo a uma placa de baixa fixação de 24 poços; prepare 1 poço por suporte permeável. Prepare 3 alvéolos contendo 0,5 ml de RPMI- para enumerar a entrada de PMN.
   1. Se um quimioatraente estiver sendo usado no lugar de bactérias, adicione o quimioatraente a 0,6 ml de RPMI- na placa de 24 poços preparada na etapa 5.6.
7. Direita os suportes permeáveis na placa de fixação baixa de 24 poços.
8. Adicionar 0,1 ml de PMN (10⁶ PMN), preparado no passo 4.9, ao reservatório superior (lado basolateral) de cada suporte permeável. Adicionar 100 μl de PMN directamente aos alvéolos contendo 500 μl de RPMI-. Incubar a 37 °C com 5% de CO₂ durante 1 hora.
9. Usando uma pinça estéril, raspe suavemente a membrana do suporte permeável contra a borda do poço para remover o PMN adicional do lado apical e, em seguida, descarte o suporte.
10. Colete o PMN raspando suavemente o fundo de cada poço com a ponta da pipeta de 1.000 μl e transfira as suspensões de PMN para tubos de microcentrífugas.
11. Enumere o PMN usando um hemocitômetro.
12. Para calcular o número total de PMN no reservatório inferior, multiplique o número de PMN em 1 mm² (100 nl) por 6.000. Os dados podem ser relatados como uma porcentagem do PMN de entrada ou como números de PMN normalizados para 10⁶ PMN de entrada.

Resultados

O ensaio de migração transuroepitelial de neutrófilos permite a avaliação quantitativa da migração de PMNs humanos através de camadas cultivadas de células epiteliais da bexiga em resposta a diversos estímulos (Figura 1B). Embora o protocolo seja simples, existem diversas variáveis que podem influenciar a migração de PMNs e, consequentemente, afetar a reprodutibilidade deste ensaio. Medidas devem ser tomadas durante o preparo dos suportes permeáveis e dos PMNs para reduzir a variabilidade entre réplicas ...

Discussão

Usando uma linhagem de células epiteliais da bexiga cultivada e PMN humano recém-isolado, estabelecemos um modelo in vitro de migração transuroepitelial de neutrófilos. Este modelo tem sido fundamental para começar a dissecar as complexidades da resposta imune inata durante a infecção do trato urinário (ITU), uma infecção bacteriana extremamente comum tipicamente causada por UPEC⁹. Durante a infecção da bexiga, ou cistite, o recrutamento de PMN para o lúmen da bexiga é essencial para a depuração bacte...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Inserções Transwell (i.e.  suportes permeáveis)	Corning	3472	6,5 mm, 3 μ m poro, inserção de membrana de poliéster
Tubos de coleta de sangue BD Vacutainer	Becton, Dickinson and Company (BD)	366480	Tubos de tampa verde de 16 mm x 100 mm x 10 ml contendo heparina sódica
Conjunto de coleta e infusão de sangue BD Safety-Lok	Becton, Dickinson and Company (BD)	367281	21 G x 0,75 pol agulha x 12 pol tubo
BD Vacutainer uso único, suporte não empilhável	Becton, Dickinson and Company (BD)	364815
Dextran	Sigma-Aldrich	D4876	De Leuconostoc mesenteroides
Ficoll-Paque Solução de centrifugação de densidade PLUS	GE Healthcare	17-1440-02
	Corning	3473	24 poços, fundo
plano transparenteN-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)	Sigma-Aldrich	F3506	Reconstituído em DMSO para 10 mM
Humano Recombinante CXCL8/IL-8	R& D Systems	208-IL	Reconstituído em PBS para 100 μ g/ml

Placas de fixação ultrabaixa