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Análise de defeitos musculares esqueléticos em larvas de peixe-zebra por birrefringência e ensaios de resposta de fuga evocada por toque

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DOI:

10.3791/50925

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13 de dezembro de 2013

 ,  , 
1Division of Genetics and Genomics, Manton Center for Orphan Disease Research, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School

Neste artigo

Resumo

O peixe-zebra é agora uma ferramenta estabelecida e poderosa para modelar distrofias musculares, miopatias congênitas e doenças neuromusculares relacionadas. A birrefringência e o comportamento de fuga evocado pelo toque são dois ensaios não invasivos comuns usados para determinar o grau de desorganização muscular e comprometimento locomotor de embriões de peixe-zebra durante o desenvolvimento inicial.

Resumo

O peixe-zebra (Danio rerio) tornou-se uma ferramenta particularmente eficaz para modelar doenças humanas que afetam o músculo esquelético, incluindo distrofias musculares1-3, miopatias congênitas4,5 e interrupções na montagem sarcomérica6,7, devido à alta conservação genômica e estrutural com mamíferos8. A desorganização muscular e o comprometimento locomotor podem ser avaliados rapidamente no peixe-zebra nos primeiros dias após a fertilização. Dois ensaios para ajudar a caracterizar defeitos do músculo esquelético em peixe-zebra são birrefringência (estrutural) e resposta de fuga evocada pelo toque (comportamental).

A birrefringência é uma propriedade física na qual a luz é girada à medida que passa pela matéria ordenada, como a matriz pseudocristalina de sarcômeros musculares9. É uma abordagem simples e não invasiva para avaliar a integridade muscular em larvas translúcidas de peixe-zebra no início do desenvolvimento. O peixe-zebra do tipo selvagem com músculo esquelético altamente organizado parece muito brilhante em meio a um fundo escuro quando visualizado entre dois filtros de luz polarizados, enquanto os mutantes musculares têm padrões de birrefringência específicos para o distúrbio muscular primário que modelam. O peixe-zebra modelando distrofias musculares, doenças caracterizadas por degeneração de miofibras seguidas por repetidas rodadas de regeneração, exibem manchas escuras degenerativas no músculo esquelético sob luz polarizada. As miopatias não distróficas não estão associadas a necrose ou alterações regenerativas, mas resultam em miofibras desorganizadas e fraqueza muscular esquelética. O peixe-zebra miopático normalmente mostra uma redução geral na birrefringência, refletindo a desorganização dos sarcômeros.

O ensaio de escape evocado pelo toque envolve a observação do comportamento de natação de um embrião em resposta à estimulação tátil10-12. Em comparação com as larvas do tipo selvagem, as larvas mutantes freqüentemente exibem uma contração de escape fraca, seguida de natação lenta ou outro tipo de movimento prejudicado que não consegue impulsionar as larvas mais do que uma curta distância12. A vantagem desses ensaios é que a progressão da doença no mesmo tipo de peixe pode ser monitorada in vivo por vários dias e que um grande número de peixes pode ser analisado em um curto espaço de tempo em relação aos vertebrados superiores.

Protocolo

1. Análise in vivo da Estrutura Muscular Esquelética por Birrefringência

  1. Prepare gaiolas de acasalamento separando o(s) macho(s) da(s) fêmea(s) da(s) linha(s) de peixe-zebra desejada(s) no final da tarde, após a alimentação.
    1. Distinguir as fêmeas por sua barriga maior e leve coloração azul/branca, e os machos por sua forma corporal esbelta e tons rosa/amarelo.
    2. O sucesso com cruzamentos em pares (um macho e uma fêmea) pode ser de apenas cerca de 50%. Para uma maior taxa de sucesso, acasale um macho com 2-3 fêmeas.
  2. Remova as divisórias da gaiola na manhã seguinte, logo após o início da luz, e deixe os peixes desovarem sem serem perturbados.
  3. Colete os ovos usando uma peneira quando um número suficiente de ovos fertilizados for colocado no fundo do tanque.
  4. Transfira os embriões para uma placa de Petri funda, enxaguando a peneira com água de peixe e retorne os peixes pais aos seus tanques. Coloque os pratos de embriões em uma incubadora a 28,5 °C.
  5. Limpe os ovos e detritos inviáveis mais tarde naquele dia ou na manhã seguinte e devolva os embriões à incubadora para maior crescimento.
  6. Embriões/larvas atingem a idade apropriada para observar birrefringência em 3-7 dias após a fertilização (dpf), pois os resultados anteriores a 3 dpf podem potencialmente sofrer de contraste limitado. Embriões do tipo selvagem eclodem de seus córions entre 48-60 horas pós-fertilização (hpf), seguido por um endireitamento do eixo do corpo. Embriões selvagens ou mutantes de eclosão tardia podem exigir descorionação manual.
    1. Delicadamente, faça um rasgo no córion com uma pinça afiada e vire-o de cabeça para baixo para que o embrião caia.
    2. Permita que os embriões descorionados se endireitem antes de iniciar o ensaio.
    3. Anestesiar o(s) embrião(ões) com tricaína (0,04% na água dos peixes) para auxiliar no seu correto posicionamento.
  7. Instale um microscópio de dissecação com uma lente polarizada que possa ser girada para ajustar o ângulo da luz polarizada (Figura 1A).
  8. Coloque o(s) embrião(ões) descorionado(s) anestesiado(s) diretamente em cima de uma segunda lente polarizada ao longo do eixo lateral do corpo. A segunda lente deve ser posicionada abaixo da lente superior, no estágio do microscópio (Figura 1B). Não use placas de Petri de plástico em nenhum momento durante o ensaio de birrefringência, pois o plástico não é um meio apropriado para a transmissão de luz refratada.
  9. Gire a lente superior com o embrião de interesse à vista até que os eixos de polarização das duas lentes estejam orientados a 90° um do outro e o fundo fique completamente escuro.
  10. A saída ideal do ensaio depende da orientação do peixe entre duas lentes polarizadas. Mova o peixe para se certificar de que eles estão deitados o mais plano possível.
    1. Se o peixe for curvo, apenas os segmentos com essa orientação plana passarão pela luz polarizada e exibirão birrefringência. Nesses casos, medir a birrefringência nas zonas planas e registar a birrefringência da área correspondente nos peixes selvagens (por exemplo, somitos 1-10 tanto nos peixes selvagens como nos mutantes).
  11. Observe o fenótipo birrefringente do peixe.
    1. Peixes selvagens com músculo esquelético altamente organizado apresentam birrefringência brilhante, pois o índice de refração da luz paralela aos miofilamentos é maior do que a luz polarizada perpendicular a essas estruturas.
    2. Peixes com músculo esquelético desorganizado sugestivo de miopatia não degenerativa ou defeito de desenvolvimento geralmente apresentam uma redução geral na birrefringência.
    3. Peixes com músculo esquelético desorganizado característico de uma distrofia muscular geralmente exibem um padrão semelhante a uma mancha de birrefringência, com áreas escuras representando degeneração muscular entre áreas brilhantes de arquitetura muscular normal.
  12. Quantifique a birrefringência tirando imagens de peixes selvagens e mutantes sob luz polarizada nas mesmas configurações de exposição e ampliação. Salve imagens como arquivos .tiff.
    1. Abra imagens de birrefringência no software ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
    2. Para cada imagem, selecione a área do músculo peixe-zebra desenhando uma linha ao redor do corpo usando a opção "Seleções de polígonos" na barra de ferramentas.
    3. Use "Definir medidas" no menu suspenso "Analisar" para selecionar as estatísticas necessárias para a imagem.
      1. A seleção mínima requer que as caixas "Área", "Valor médio de cinza" e "Valor mínimo e máximo de cinza" estejam marcadas.
      2. Um valor máximo de cinza de >255 indicará saturação de pixels. Portanto, use imagens com valores máximos de cinza inferiores a 255.
    4. Normalize a intensidade média com a área selecionada e repita este mesmo procedimento de quantificação para cada imagem de birrefringência.

2. Ensaio de comportamento de escape evocado por toque

  1. Estabeleça pares de acasalamento da(s) linha(s) de peixe-zebra apropriada(s) e colete embriões conforme descrito acima nas etapas 1.1-1.5.
  2. De 2 a 7 dias após a fertilização, coloque embriões/larvas descorionados individualmente em uma placa de Petri profunda ou nas câmaras de placas de vários poços.
  3. Trabalhando com apenas um embrião de cada vez, centralize o embrião no campo de visão de um estereomicroscópio SMZ1500 Nikon com um sistema de câmera digital SPOT RT3 ou similar e inicie a imagem sequencial.
    1. A mesma frequência de imagem deve ser usada para peixes selvagens e mutantes. Taxas de quadros >30 Hz são recomendadas, pois taxas mais lentas normalmente não serão suficientes para capturar a natação rápida de peixes do tipo selvagem.
  4. Forneça estímulos mecanossensoriais ao embrião tocando a cauda com um alfinete de inseto.
  5. Pare de fazer imagens quando o embrião parar de nadar ou nadar para fora do campo de visão.
  6. Converta imagens sequenciais em um arquivo de vídeo ou analise quadros individuais de imagens de lapso de tempo off-line, usando o software SPOT 5.1 Advanced. Pacotes de software semelhantes incluem Open Lab, NIS Elements ou ImageJ disponível gratuitamente (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
  7. Quantifique o comportamento de natação realizando a resposta evocada ao toque em vários embriões.
    1. Isso pode ser alcançado calculando a média da distância que os embriões são capazes de nadar dentro de um intervalo de tempo fixo usando um software ou uma régua métrica para marcar os pontos inicial e final da luta de natação.
    2. Evite que os embriões se habituem ao estímulo do toque ao longo do tempo, realizando o ensaio com um novo embrião para cada repetição experimental. Comportamentos em modelos mutantes confiáveis e de tipo selvagem tendem a ser altamente reprodutíveis.

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Resultados

A birrefringência pode ser usada como um ensaio eficiente e não invasivo para elucidar o estado da organização dos miófilamentos em embriões vivos de peixe-zebra. São apresentados exemplos de peixes-zebra selvagens, bem como de peixes-zebra com expressão reduzida de genes essenciais para o desenvolvimento e funcionamento do músculo esquelético. Peixes-zebra selvagens com 5 dpf exibem músculos esqueléticos altamente birrefringentes sob luz polarizada, devido à disposição ordenada dos miofilamentos (Figuras 2A-B

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Discussão

Os distúrbios neuromusculares primários são tradicionalmente classificados como processos distróficos ou não distróficos. As distrofias musculares são caracterizadas pela degeneração das miofibras seguida por repetidas rodadas de regeneração, o que acaba levando a um processo de estágio final tipificado por fibrose e substituição por tecido adiposo14. As miopatias não distróficas, por outro lado, não estão associadas a necrose ou alterações regenerativas, mas resultam em miofibras desorganizadas e fraqueza mus...

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Agradecemos a Behzad Moghadaszadeh por sua maravilhosa ajuda na quantificação de imagens de birrefringência. Este trabalho foi financiado pela Associação de Distrofia Muscular dos EUA (MDA201302) e pelo Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticas e de Pele (R01 AR044345), bem como pelo apoio generoso da A Foundation Building Strength, Cure CMD e da AUism Charitable Foundation. O VAG é apoiado pelo K01 AR062601 do Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticas e de Pele, e o LLS é apoiado pelo F31 NS081928 do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tricaine SigmaA5040
Placas de PetriFischer Scientific0875711Z
FórcepsFischer Scientific100189-588
Pino de insetoFischer ScientificS67375
Lentes polarizadasRitz CameraQuantaray Tristar Optics C-PL 72mm
IncubadoraFischer Incubadora Científica Isotemp Modelo 630D
MicroscópioNikon Instruments Inc.SMZ 1500
CâmeraInstrumentos de Diagnóstico Inc.Software de imagem SPOT RT3
Instrumentos de diagnóstico Inc.SPOT 5.1 Avançado

Referências

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  2. Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum. Mol. Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).
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