Artigo de método

Análise quantitativa e caracterização das lesões ateroscleróticas no seio aórtico murino

DOI:

10.3791/50933

⸱

7 de dezembro de 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University, 2Thrombosis and Atherosclerosis Research Institute, McMaster University

Neste artigo

Resumo

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Descrevemos procedimentos para quantificar e caracterizar lesões ateroscleróticas em modelos de camundongos usando secção de precisão do seio aórtico e da aorta ascendente combinada com análise histoquímica e imuno-histoquímica.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A aterosclerose é uma doença das grandes artérias e uma das principais causas subjacentes de infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral. Vários modelos diferentes de camundongos foram desenvolvidos para facilitar o estudo da fisiopatologia molecular e celular desta doença. Neste manuscrito descrevemos técnicas específicas para a quantificação e caracterização de lesões ateroscleróticas no seio aórtico murino e na aorta ascendente. A vantagem desse procedimento é que ele fornece uma medida precisa da área de secção transversa e do volume total da lesão, que pode ser usada para comparar a progressão aterosclerótica em diferentes grupos de tratamento. Isso é possível através do uso dos folhetos valvares como marco anatômico, juntamente com o ajuste cuidadoso do ângulo de secção. Também descrevemos métodos básicos de coloração que podem ser usados para começar a caracterizar a progressão aterosclerótica. Estes podem ser modificados para investigar antígenos de interesse específico para o pesquisador. As técnicas descritas são geralmente aplicáveis a uma ampla variedade de modelos dietéticos e geneticamente induzidos existentes e recém-criados

Introdução

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Nas últimas duas décadas, o desenvolvimento e o uso de modelos de camundongos propensos à aterosclerose por meio de manipulação dietética e/ou genética aumentaram significativamente nossa compreensão dos mecanismos moleculares e celulares envolvidos no desenvolvimento da lesão aterosclerótica1-3. Grande parte do nosso conhecimento e compreensão da aterogênese vem de estudos realizados em camundongos deficientes em apolipoproteína (Apo)-E4 camundongos, nos quais lesões ateroscleróticas se desenvolvem espontaneamente e deficientes em receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDLR)5 camundongos, nos quais a aterosclerose é induzida pela dieta. Uma vantagem importante desses modelos é que eles permitem o estudo de um número relativamente grande de animais geneticamente definidos sob condições dietéticas e ambientais controladas. Além disso, as lesões ateroscleróticas avançadas que se desenvolvem em algumas dessas cepas de camundongos parecem ser muito semelhantes às observadas em seres humanos, contendo núcleos necróticos cheios de lipídios e capas fibrosas. A aterosclerose se desenvolve rapidamente nesses modelos de camundongos, tornando muito viável estudar o desenvolvimento de lesões, desde a faixa gordurosa até a placa avançada, em questão de semanas. Além disso, fatores de risco conhecidos para doenças cardiovasculares em humanos, incluindo diabetes6, dislipidemia7, obesidade8, hipertensão9, fumaça de cigarro10 e um ambiente sedentário11 demonstraram acelerar ainda mais o desenvolvimento de lesões.

Na maioria, senão em todos os modelos de camundongos propensos à aterosclerose, o desenvolvimento da lesão pode ser detectado pela primeira vez no seio aórtico. O tempo de início depende da cepa e da dieta do camundongo. À medida que as lesões aumentam de tamanho, elas tendem a crescer na aorta ascendente. Em camundongos ApoE-/- e LDLR-/-, o desenvolvimento subsequente de lesões pode ser detectado em bifurcações aórticas no arco aórtico, na aorta descendente e em outras artérias maiores12-14. A Dra. Beverly Paigen e colegas, além de desenvolver alguns dos primeiros modelos de aterosclerose induzida por dieta, também estabeleceram um ensaio para a quantificação de lesões ateroscleróticas no seio aórtico que se tornou o padrão de medição de lesões em modelos de camundongos15. Ao longo dos anos, essa técnica foi refinada e descrita em detalhes16. Aqui apresentamos uma versão modificada do "método de Paigen" para a quantificação e caracterização de lesões ateroscleróticas em um camundongo. A análise de cortes transversais da aorta seriados de uma região vascular específica e em uma orientação definida e fixa, facilita a coleta precisa de dados e permite a detecção precisa de variações no desenvolvimento da lesão em diferentes grupos de tratamento. Os métodos apresentados aqui baseiam-se nas técnicas anteriores. Especificamente, descrevemos como a caracterização da lesão em termos de área, volume, conteúdo necrótico e celular é possível por meio do exame de cortes seriados usando uma combinação de histoquímica e imuno-histoquímica.

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Protocolo

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O Conselho de Ética em Pesquisa Animal da Universidade McMaster pré-aprovou todos os procedimentos aqui descritos.

1. Colhendo Coração e Aorta

  1. Anestesiar o rato e abrir cuidadosamente a cavidade torácica para revelar o coração e a aorta proximal.
    1. Extraia o sangue do camundongo por pontuação direta do ventrículo direito do coração.
      Nota: O sangue pode ser armazenado e usado para a análise de lipídios plasmáticos e outros fatores transmitidos pelo sangue.
  2. Eutanasiar o camundongo por luxação cervical.
  3. Enxágue a vasculatura com 5 ml de soro fisiológico.
    Nota: Isso é realizado por perfusão por gravidade através de uma punção com agulha no ventrículo esquerdo. Para permitir a drenagem, é feita uma pequena incisão no átrio direito. Após o enxágue da vasculatura, amostras de tecido de fígado, músculo e tecido adiposo podem ser coletadas, congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 ºC para análise futura.
  4. A vasculatura é fixada por perfusão por gravidade no ventrículo esquerdo com formol tamponado neutro a 10%
    Nota: Uma vez iniciada a perfusão, o fluxo de formalina tamponada neutra a 10% é ajustado para um gotejamento lento para que o processo demore 1-2 min. Órgãos e tecidos que foram fixados por perfusão podem ser usados para o estudo da expressão de proteínas por meio de imunofluorescência ou histoquímica, mas geralmente não podem ser usados como amostras para western blotting ou para o estudo da expressão gênica.
  5. Extrair cuidadosamente o coração e aproximadamente 2 mm de aorta proximal da carcaça. Outros tecidos, incluindo a aorta descendente, podem ser coletados e armazenados para análise posterior.
    Nota: A aorta descendente (para a bifurcação ilíaca) também pode ser usada para examinar a aterosclerose.
  6. Faça um corte transversal com bisturi no coração removido de forma perpendicular à aorta ascendente.
    Nota: Isso é facilitado pelo uso de um microscópio de dissecação e pode ser feito com eficácia cortando ao longo de uma linha reta que une as pontas inferiores dos átrios direito e esquerdo (Figura 1).
  7. Armazene a parte apical (superior) do coração em um de incorporação e mergulhe-o em formalina tamponada neutra para processamento.

2. Preparação da Aorta

  1. Coloque o com o tecido dissecado no processador de tecidos.
  2. Amostras de tecido de processo.
    Nota: Geralmente, os processadores de tecidos são programados para trabalhar durante a noite devido à duração da operação e às soluções envolvidas nesse processo. As amostras são processadas seguindo um protocolo estabelecido:
    1. Formol tamponado neutro a 10% por 1 hora a 42 ºC.
    2. Formol tamponado neutro a 10% por 1 hora a 42 ºC.
    3. Etanol 70% por 30 min a 40 ºC.
    4. Etanol a 85% por 30 min a 40 ºC.
    5. Etanol 100% por 45 min a 40 ºC.
    6. Etanol 100% por 45 min a 40 ºC.
    7. Etanol 100% por 45 min a 40 ºC.
    8. Xileno durante 1 hora a 40 ºC.
    9. Xileno durante 1 hora a 40 ºC.
    10. Xileno durante 1 hora a 40 ºC.
    11. Cera de parafina por 45 min a 63 ºC.
    12. Cera de parafina por 45 min a 63 ºC.
    13. Cera de parafina por 45 min a 63 ºC.
    14. Cera de parafina por 45 min a 63 ºC.
  3. Derreter a cera de parafina durante a noite a 62 ºC (Figuras 1D-E). Estimar a quantidade total de cera de parafina a ser utilizada com base nos gramas de cera de parafina necessários para preencher um molde histológico e no número de blocos a serem preparados.
    Nota: Um molde de histologia profunda é preferível ao molde raso porque fornece um ângulo de rotação potencial mais amplo ao seccionar. Um único molde de histologia profunda requer 11 g de cera de parafina.
  4. Coloque cada tecido processado em um molde de histologia profunda e, em seguida, despeje a cera de parafina derretida para preencher completamente o molde (Figura 1F). Cubra o molde com um de plástico rotulado (Figura 1G).
  5. Resfrie o molde preenchido no gelo ou em uma superfície fria (Figura 1H), a fim de criar o bloco sólido e separar o bloco do molde (Figuras 1I-J).
    Nota: Ao colocar o coração dissecado no molde, certifique-se de que a face interna do coração esteja tocando a base do molde e, em seguida, preencha o bloco com parafina derretida. Um de plástico rotulado cobre o molde antes de solidificar, a fim de fornecer uma base para lidar com o bloco. Depois de resfriado, o molde é removido e os blocos de parafina podem ser armazenados indefinidamente em temperatura ambiente.

3. Secção da Aorta

  1. Posicione o bloco com o coração no suporte da amostra do micrótomo para que possa ser seccionado de dentro para cima do coração (Figura 2)
  2. Ajuste o micrótomo para cortar uma espessura de corte de 10 μm e prossiga para seccionar o coração.
  3. Colete seções em uma lâmina de vidro e examine sob um microscópio de luz para determinar a posição e a orientação.
  4. Quando 1 ou 2 válvulas do seio aórtico se tornarem evidentes, ajuste o ângulo do bloqueio conforme necessário (Figura 3A).
    Nota: O seio deve aparecer como três bases de válvulas bipartidas com folhetos anexados. Se apenas um ou dois folhetos da válvula forem observados, o ângulo de corte deve ser ajustado de acordo.
  5. Ajuste o micrótomo para cortar a 4-5 μm e colete as seções em lâminas de vidro revestido.
    Nota: Embora o procedimento possa ser variado, recomenda-se uma abordagem sistemática, pela qual as primeiras 10 seções, do seio aórtico avançando para a aorta ascendente, são coletadas na parte superior de uma lâmina de vidro rotulada (lâminas rotuladas de 1 a 10). Os cortes subsequentes são coletados seguindo o mesmo padrão: #11-20, #21-30, #31-40 até que as lesões ateroscleróticas não sejam mais observadas (Figura 3B). Desta forma, as lesões ateroscleróticas podem ser examinadas e caracterizadas em locais precisos ao longo da aorta ascendente. Por exemplo, o slide 1 contém as seções 1, 11, 21, 31, 41 e 51, representando lesões ateroscleróticas do seio aórtico até a aorta ascendente. Lâminas adicionais, rotuladas de 11 a 20, podem ser incluídas se a lesão for grande, para coletar mais seções distais seguindo o mesmo padrão.
  6. Continuar a coletar cortes até que nenhuma lesão aterosclerótica seja observada.
    Nota: As lâminas podem ser armazenadas em temperatura ambiente por meses, antes de uma análise mais aprofundada.

4. Coloração e quantificação de lesões ateroscleróticas

As lesões ateroscleróticas podem ser analisadas de muitas maneiras diferentes usando uma variedade de técnicas. A análise mais básica envolve a determinação da área de secção transversa da lesão. Para comparar com precisão a área da lesão, é importante que o ponto de partida para a medição da lesão seja consistente de amostra para amostra. Isso é facilitado pelo uso dos folhetos da válvula para orientação. Para facilitar a identificação e quantificação precisas da área da lesão, seções transversais selecionadas são coradas com hematoxilina e eosina. Isso envolve a imersão das lâminas em uma série de soluções por tempos especificados, que irão desparafinizar/manchar o tecido.

Protocolo para coloração de hematoxilina e eosina:

  1. Coloque as lâminas no secador de ar por 8 min e depois desparafinize as seções lavando 4× em xileno, por 3 min por lavagem.
  2. Lave as lâminas em etanol 100% 3× por 3 min cada.
  3. Lave 3× em etanol a 70% por 3 min cada e depois 2× em etanol a 50% por 3 min cada.
  4. Enxágüe com água destilada e depois mergulhe na Hematoxilina de Mayer por 15 min.
  5. Lave em água corrente da torneira por 5 min e depois lave em água destilada por 5 min.
  6. Mergulhe em Eosin Y por 1-5 min.
  7. Lave em água destilada 3× por 5 min cada, lave em etanol 50% 2× por 2 min cada, depois etanol 70% 3× por 2 min cada.
  8. Lave em etanol 100% 3× por 2 min cada e depois lave em xileno 4× por 2 min cada.
  9. Monte seções usando meio de montagem à base de xileno e capture imagens usando uma câmera digital montada em um microscópio óptico.
  10. Identifique e quantifique a área da lesão usando um software de imagem.
    Nota: A área da lesão pode ser determinada a distâncias específicas do seio aórtico em intervalos de 40-50 μm (dependendo da espessura de cada seção). Um gráfico dessas medidas de área versus distância fornece um perfil da lesão aterosclerótica (Figura 4). A área sob a curva representa uma estimativa do volume total da lesão aterosclerótica. A caracterização adicional da lesão pode incluir a determinação da área necrótica. O núcleo necrótico (nc) de uma lesão avançada é formado por células espumosas apoptóticas. Com a prática, isso pode ser determinado pelo exame das regiões acelulares dos cortes corados com hematoxilina e eosina (Figura 4A). As lesões precoces tendem a ter muito pouca necrose, enquanto as lesões mais avançadas têm áreas necróticas aumentadas que podem contribuir para a instabilidade da placa. Cortes seriados da mesma aorta devem ser examinados para confirmar a presença de uma região necrótica.

5. Caracterização adicional da lesão aterosclerótica

Detalhes específicos sobre o estágio de desenvolvimento aterosclerótico podem ser determinados pela coloração com anticorpos direcionados contra tipos ou marcadores celulares específicos. A imuno-histoquímica em cortes de parafina é uma técnica padrão usada para identificar tipos ou marcadores celulares específicos no contexto do tecido não corado circundante. A detecção de antígenos geralmente é obtida usando um substrato de peroxidase de rábano.

A coloração por imunofluorescência envolve o uso de anticorpos conjugados com fluoróforo e requer um microscópio de fluorescência e filtros apropriados para detecção. Esta técnica permite a coloração simultânea de dois (ou mais) antígenos.

Protocolo Geral para Coloração Imuno-Histoquímica:

  1. Coloque as lâminas no secador de ar por 8 min.
  2. Desparafinize as seções em 4 mudanças de xileno, 3 min each.
  3. Lave em etanol 100% 3× por 3 min cada para remover o xileno.
  4. Lave 3× em etanol a 70% por 3 min cada, depois 2× em etanol a 50% por 3 min cada.
  5. Lave em água destilada por 5 minutos cada e depois lave 3× em PBS por 5 minutos cada.
  6. Realize a recuperação do antígeno. Isso pode ser feito usando o método de Recuperação de Epítopos Induzidos por Calor (HIER) em uma panela de pressão de micro-ondas e solução de recuperação de antígeno (tampão citrato 10 mM, pH 6,0).
    Nota: O processo de fixação da formalina pode mascarar os antígenos de interesse. Em nossa experiência, o HIER melhora significativamente o desempenho de alguns anticorpos, mas não é necessário para outros. Além disso, existem outras alternativas disponíveis ao método HIER de recuperação de antígenos.
  7. Quando a panela de pressão esfriar, coloque as lâminas no PBS por 15 min.
  8. Incube seções em soro normal (da mesma espécie da qual o anticorpo secundário foi derivado) por 30 min. NÃO LAVE AS LÂMINAS - DRENE O SORO.
  9. Incubar com anticorpo primário diluído em soro de bloqueio normal durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
  10. Lave com PBS 3× por 5 min cada.
  11. Incubar as secções com o anticorpo secundário biotinilado que foi diluído em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente.
  12. Incube as lâminas com estreptavidina peroxidase de rábano por 30 min e depois lave com PBS 3× por 5 min cada.
  13. Reação cromogênica - incubar lâminas em DAB fresco (3,3'-diaminobenzidina) por 5-30 min. Esta reação deve ser monitorada usando um microscópio. Pare a reação lavando as lâminas em água da torneira.
  14. Contra-coloração com hematoxilina por 1 min. Lave com água da torneira por 5 min e depois lave em água destilada 3× por 5 min cada.
  15. Repita as etapas 4.7-4.9 para montagem de slides.

6. Protocolo Geral para Coloração de Imunofluorescência

Um protocolo semelhante, com pequenas alterações, pode ser seguido para a coloração por imunofluorescência.

  1. Coloque as lâminas no secador de ar por 8 min e depois desparafinize as seções em 4 trocas de xileno, 3 min cada.
  2. Lave em etanol 100% 3× por 3 min cada para remover o xileno.
  3. Lave 3× em etanol a 70% por 3 min cada, depois 2× em etanol a 50% por 3 min cada.
  4. Lave em água destilada por 5 min cada e depois lave em PBS 3× por 5 min cada.
  5. Realize a recuperação do antígeno. Isso pode ser feito usando o método de Recuperação de Epítopos Induzidos por Calor (HIER) em uma panela de pressão de micro-ondas e solução de recuperação de antígeno (tampão citrato 10 mM, pH 6,0).
    Nota: O processo de fixação da formalina pode mascarar os antígenos de interesse. Em nossa experiência, o HIER melhora significativamente o desempenho de alguns anticorpos, mas não é necessário para outros. Além disso, existem outras alternativas disponíveis ao método HIER de recuperação de antígenos.
  6. Quando a panela de pressão esfriar, coloque as lâminas no PBS por 15 min.
  7. Incube seções em soro normal (da mesma espécie da qual o anticorpo secundário foi derivado) por 30 min. NÃO LAVE AS LÂMINAS - DRENE O SORO.
  8. Incubar com anticorpo primário diluído em soro de bloqueio normal durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
  9. Lave com PBS 3× por 5 min cada.
  10. Adicione anticorpo conjugado com fluoróforo secundário que é diluído em soro bloqueador normal (ou PBS). Incube por 1,5 hora em temperatura ambiente.
  11. Lave com PBS 3× por 5 min cada.
  12. Contra-coloração com DAPI.
  13. Lave em PBS 3× por 5 min cada.
  14. Aplique uma lamínula usando mídia de montagem antidesbotamento.

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Resultados

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Camundongos LDLR-/- de cinco semanas de idade foram alimentados com uma dieta padrão ou uma dieta rica em gordura por dez semanas. Os camundongos foram sacrificados e perfundidos com formalina conforme descrito acima. Cortes transversais do seio aórtico foram preparados e corados com hematoxilina e eosina para determinar a área e o volume da lesão (Figura 4). Quando os camundongos são alimentados com uma dieta padrão de ração, o desenvolvimento aterosclerótico é muito limitado e pode não ser detectável ...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A aterosclerose é uma doença crônica complexa das grandes artérias musculares que é uma das principais causas subjacentes de infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral. A progressão da doença envolve a interação de muitos tipos diferentes de células dentro da parede da artéria, com células sanguíneas circulantes, partículas de lipoproteínas e outros fatores transmitidos pelo sangue que estamos apenas começando a entender. Muito do nosso conhecimento atual sobre o desenvolvimento e progressão da aterosclerose veio ...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa foi financiada por uma bolsa operacional dos Institutos Canadenses de Ciências da Saúde e da Associação Canadense de Diabetes. A DEV é apoiada por uma bolsa de estudos da Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT, Chile).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Camundongos com deficiência de LDLR ( D2.129S7(B6)-Ldlrtm1Her/J)The JacksonLaboratory stock #002207
FormalinaSigma-AldrichHT5011
Moldes de HistologiaTed Pella Inc27195
ParafinaParamat19286-10
Lâminas revestidasFisher12-550-15
Recipientes de solventeTissue Tek II4457
MicrótomoLeicaRM22S5
Banho-mariaVWR80086-982
MicroscópioOlympusBX41TF
CâmeraOlympusDP72
ImageJNIHwww.rsbweb.nih.gov/ij/
ProcessadorSakura FinetekVIP6-A1
de processamentoVWR18000-134
Preassure CookerNordic Ware
CoverslipFisher12-545-M
PBSSigma-AldrichP3813
Lâmina de micrótomoThermo Scientific30-518-35
Meio de montagem antidesbotamentoSigma-AldrichF-4680
Montagem de xileno médio Sigma-Aldrich44581
Meio de montagem aquosoSigma-AldrichI1161
Mac-3 anbodyBD Pharmingen553322
DAPISigma-AldrichD9542
F4 / 80 anticorpoAbcamAb6640
Alpha actinaSanta Cruz BiotechnologySC-32251
Mayer’ s HematoxilinaSigma-AldrichE4382
Eosina YSigma-AldrichMHS16
DAB (3,3'-Diaminobenzidina)DakoK3468

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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