Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

Resumo

Estabelecimento de modelos humanos da barreira sangue-cérebro (BBB) ​​pode beneficiar de pesquisa em condições cerebrais associadas com insuficiência certificação. Descrevemos aqui uma técnica melhorada para a preparação de um modelo de certificação de contacto, o que permite coculturing de astrócitos e células endoteliais cerebrais sobre os lados opostos de uma membrana porosa.

Resumo

A barreira sangue-cérebro (BBB) ​​compreende impermeáveis ​​mas adaptáveis ​​capilares do cérebro que controlam o ambiente fortemente cérebro. A falha da certificação tem sido implicada na etiologia de várias patologias cerebrais, criando uma necessidade de desenvolvimento de humano em modelos in vitro de BBB para ajudar na investigação clinicamente relevante. Entre os numerosos modelos de BBB, até agora descritos, uma estático (sem fluxo), contactar modelo certificação, em que os astrócitos e as células endoteliais do cérebro (CEBs) são co-cultivadas nos lados opostos de uma membrana porosa, emergiu como um sistema ainda autêntica simplificado para simular o BBB com capacidade de rastreio de alto rendimento. No entanto, a geração de tal modelo apresenta alguns desafios técnicos. Aqui, descrevemos um protocolo para a elaboração de um modelo de certificação contato humano, utilizando uma nova combinação de BECs humanos primários e astrócitos humanos imortalizados. Especificamente, detalhamos um método inovador para a célula-semeadura em inserções invertidas, bem como especificar insert técnicas de coloração e exemplificar como usamos o nosso modelo de investigação relacionada com a certificação.

Introdução

A certificação é uma interface especializada entre a circulação de sangue periférico e o sistema nervoso central, fundamentalmente responsável para a manutenção da homeostasia do cérebro. Ele compreende células distintas cerebrais microvasculares endoteliais (BEC), que são funcionalmente influenciada por alguns componentes celulares e acelulares (abaixo) para formar uma passagem apertada e dinâmico para o cérebro. Sob condições fisiológicas, a certificação restringe a passagem de células do sangue, componentes do plasma e de substâncias nocivas, todos potencialmente neurotóxicos, no cérebro. Em paralelo, a certificação troca selectivamente iões e nutrientes essenciais (glucose e aminoácidos) e produtos residuais do metabolismo entre o cérebro e a circulação de manter com precisão o ambiente cerebral ^1,2. Em anos recentes torna-se evidente que a falha da certificação ocorre numa variedade de patologias cerebrais crónicas, tais como as doenças neurodegenerativas ou inflamatórias relacionadas com (por exemplo, doença de Alzheimer e multiple esclerose, respectivamente) ^3, bem como em condições agudas, como acidente vascular cerebral isquémico ^4.

As propriedades únicas BBB de células endoteliais cerebrais (CEBs) são largamente induzida pelo ambiente cerebral ^5, e em particular por astrócitos ^6,7. Existe um consenso crescente de que outros tipos de células, tais como pericitos ^8, neurónios e microglia ^1,3, bem como a membrana de base ^9, suportar BEC e formam em conjunto uma unidade funcional denominada "unidade neurovascular" (NVU) que simultaneamente casais neuronal demandas metabólicas aos seus capilares que abastecem ^10.

O envolvimento do BBB em situações patológicas subjaz inúmeras tentativas de desenvolver em modelos in vitro de BBB para ajudar na investigação relacionada com a certificação ^11,12. Estes modelos pretendem imitar o mais próximo possível in vivo de BBB características de acordo com o princípio NVU. In vitro modelos de BBB geralmente dependem de uma monocamada de BECs tight-formadoras de junção (principalmente de bovinos ^13, humano ^{14, 15} rato, rato ¹⁶ e suínos ^17,18 origens), cultivadas em uma membrana porosa, juntamente com astrócitos apoio (extensivamente revistos por Deli et al., 2005 ^11).

Os astrócitos podem ser cultivadas em condições de não-contacto na parte inferior de uma cultura de tecidos bem, separado BEC (cultivadas na superfície superior da membrana) pelo meio de cultura ainda comunicar com CEBs através factores solúveis ^16. Em modelos mais avançados que melhor se assemelham à estrutura anatómica do BBB in vivo, os astrócitos são mantidas em condições de contacto e cultivadas directamente no lado oposto da membrana em estreita proximidade com CEBs ^13,15,17 (Figura 1). Esta configuração permite o contato físico entre BEC e astrócitos, criado quando o projeto astrócitosseus processos, através da membrana porosa. É importante ressaltar que para um verdadeiro contato para ocorrer os poros devem ser ≥ 1 Hm de diâmetro, desde astrocitárias finais pés não podem passar por poros menores (ou seja, 0,4 mM) ^14,15. Notavelmente, os sistemas de contato de BBB são demonstradas em alguns estudos a ser superiores aos seus equivalentes não-contato em relação à sua resistência elétrica trans-endotelial (TEER) e valores de permeabilidade endoteliais de vários traçadores ^13,17,18. Uma dimensão adicional de fluxo de meio foram adicionadas recentemente em um certo número de modelos in vitro de BBB para aplicar forças de cisalhamento ao endotélio para a simulação mais próxima da vasculatura cerebral ^12,19.

Um dos obstáculos técnicos que superada quando a gerar um modelo de contacto certificação é a semeadura de astrócitos contra a gravidade na superfície abluminal da membrana porosa. ^13,20 protocolos anteriores, em que os astrócitos foram simplesmente semeadas numa gota de meios no topo de uma eminserção convertida, permitiu vezes só curto semeadura (isto é, 10 min ¹³ ou 2 horas ²⁰⁾ que foram encontrados em nossas mãos para ser insuficiente para a fixação das células adequado. Usando este método básico, um período mais longo apego astrocyte requer monitoramento constante das inserções de abertura freqüente da incubadora (causando flutuações de temperatura, pH e umidade) e também é propenso a semeadura de células irregulares devido a fugas de meios através dos poros, especialmente se poros maiores do que 1 mícron são empregues.

Aqui, nós descrevemos um protocolo geral para a elaboração de um modelo de certificação contato. Nosso procedimento inclui um método alternativo para a célula-semeadura em inserções invertidos, que trata das limitações acima mencionadas. O método permite a adesão sem perturbações dos astrócitos na superfície abluminal membrana, num incubador equilibrado, por um período de tempo prolongado. Como resultado, uma sementeira uniformes de astrócitos é alcançada o que aumenta a qualidade de barreirae minimiza as variações de permeabilidade basais entre inserções.

Como o uso de células humanas é importante para a investigação humana relevante ^21, que adicionalmente demonstrar neste artigo a utilização específica de uma nova combinação de BECs humanos primários e imortalizado astrócitos humanos para a criação de um modelo de certificação contato humano com uma capacidade de rastreio de alto rendimento . Desde a visualização de células em membranas porosas podem ser difíceis, nós também técnicas de coloração de detalhes que podem ajudar na determinação da confluência e morfologia das células nas membranas porosas. Finalmente, exemplificam como nosso modelo de certificação humano pode ser utilizado para examinar o efeito do tipo de ativador do plasminogênio tecidual (t-PA) - uma enzima coágulo rebentando que serve como uma opção de tratamento único para o AVC isquêmico agudo - no BBB.

Protocolo

1. Cultura de Células (3-7 dias antes da Assembleia-BBB)

1.1. Células Cérebro humano microvascular endoteliais primárias (BEC)

CEBs foram obtidos comercialmente. As células foram produzidas por dissociação de dispase de tecido do córtex cerebral humano normal e forneceu congeladas a passagem 3 (<12 duplicações da população).

1. Substrato: vasos Brasão de cultura de tecidos com "Fator de Fixação" de acordo com as instruções do fabricante.
2. Manutenção celular: Manter BECs em meio completo contendo soro. Para a experimentação, a cultura CEBs em meio isento de soro completo. Manter as células numa atmosfera húmida de 5% de CO _2, 21% de O ₂ incubadora a 37 ° C
   Observação: Como uma alternativa aos reagentes especializados, 0,1% (w / v), soluções de gelatina pode servir como um reagente de revestimento ao mesmo tempo DMEM/F-12 suplementado com HEPES 15 mM, 10% (v / v) de soro fetal de vitelo (FCS), 2 mM de L-glutamina, 50 ug/ Ml de gentamicina, 20 ug / ml de heparina e 20 ug / ml de suplemento de crescimento de células endoteliais pode ser utilizado para a manutenção BEC.
3. Sub-cultura de experimentação: CEBs confluentes divididos na proporção de 1:03 - 01:06, dependendo do tempo pretendido para a utilização seguinte (3-7 dias). Altere o meio de manutenção a cada 3 dias. Use BECs até 15 passagens.

1.2. SVG Human Fetal astroglial-line celular

SVG células gliais fetais humanas ²² foram originalmente derivadas de culturas primárias de cérebro fetal humano transformada com o vírus símio 40 deficiente em replicação.

1. Manutenção: células Cultura SVG em meio mínimo essencial com solução salina equilibrada de Earle suplementado com 20% (v / v) FCS (mesma percentagem de soro utilizado para manter as células primárias progenitoras ^22), 2 mM de L-glutamina, 50 U / ml de penicilina e 50 ug / ml de estreptomicina. Manter as células numa atmosfera húmida de 5% de CO _2, 21% _de O2 incubadora a 37 ° C.
2. Sub-cultura de experimentação: SVGs confluentes Dividir a uma proporção de 1:5 a 1:10, dependendo do tempo pretendido para a utilização seguinte (3-7 dias). Remoção de tripsina não é necessário, devido ao alto teor de soro no meio. Troca da mídia a cada 3 dias. Use SVGs até 20 passagens.

2. Montagem e Coculturing da In vitro BBB Modelo Humano (Dia 0)

Comentário: O ser humano em contato modelo BBB vitro é preparado de acordo com protocolos publicados ^13,23, com modificações.

2.1. Revestimento de inserções

1. Coloque inserções de cultura de tecidos (6,5 mm de diâmetro, com poliéster membrana porosa, de 3 um de tamanho dos poros) nos poços da placa de 24 poços fornecidas. Revestir a superfície luminal das inserções durante a noite numa incubadora humidificada a 37 ° C com colagénio I de rato (20 g / cm ^2, 50 ul de 132 ug/ Ml de colagénio I, em 0,02% de ácido acético em água Milli-Q (MQH ₂ O)). Lavar as inserções uma vez (tanto do lado abluminal e luminal) com MQH ₂ O para remover o ácido residual.
   Nota: A membrana basal dos capilares do cérebro não contém colágeno I, mas principalmente lamininas, isoformas de colágeno tipo IV, nidogens e proteoglicanos de heparan sulfato ^9. Por este motivo, alguns pesquisadores utilizam agentes de revestimento como o colágeno IV, fibronectina ^13, ou Matrigel (BD Biosciences) ¹⁶ para uma modelagem BBB mais autêntica.

2.2. SVGs Sementeira na parte de baixo (abluminal) superfície da membrana

1. Inverta a inserção e ajustar suavemente em torno da borda da membrana porosa a uma curta peça de tubagem de silicone elástico ("tubo externo", 8 mm de diâmetro interno ~ 10 mm de comprimento, 1,6 mm de parede), criando essencialmente um novo bem acima da superfície abluminal (Figura 2A).
2. A parte inferior da inserção needs para ser selado para evitar vazamento de mídia. Em primeiro lugar, preparar um bujão (Figura 2A e 2B), feita de um tubo de silicone (denominado "tubo interno"; ~ 8 mm de comprimento, 3,2 mm de diâmetro interno, parede de 1,6 milímetros; Figura 2B), selado numa das extremidades, com um cone de vedação de plástico (~ 3 mm de comprimento; preparado pelo corte da parte inferior de uma reacção em cadeia com 0,2 ml de polimerase (PCR) do tubo e a figura 2B). Este cone não só sela o lúmen dos tubos internos, mas também aumenta a sua aresta para encaixe apertado dentro do inserto. Em seguida, utilizando um fórceps estéril, inserir a ficha de silicone na cavidade luminal e avançar até que ele chegue até a ~ 1-2 mm a partir da membrana (Figura 2A).
3. Em seguida, as sementes 4 x 10 ⁴ células SVG em 200 mL SVG meio de manutenção (SEcção 1.2.2 acima) directamente para o silicone bem acima da superfície da membrana abluminal (Figura 2A). Permitir SVGs a aderir por pelo menos 4 horas na incubadora.
   Nota: Para manter a esterilidade transportar as inserções montadas entre duas placas de 6 poços (uma placa invertida sobre a outra; Figura 2C), para minimizar a exposição ao ar não filtrado, durante o procedimento. Os tubos de silicone e os tampões são lavadas em etanol e autoclavado para uso posterior.
   Nota: Utilize plugs (seção 2.2.2) apenas para pastilhas com poros da membrana com tamanho superior a 1 mícron. As membranas com poros de diâmetro de 1 um ≤ raramente vazar e requerem apenas a montagem do tubo de silicone externa (secção 2.2.1). Além disso, alguns outros do que o colágeno agentes de revestimento I (ver nota a seção 2.1) pode impedir leakiness mesmo através de 3 mM poros. Determinar esta empiricamente.
4. A fim de monitorar o estado adesão de seus astrócitos, semear em paralelo emde 96 cavidades de um volume idêntico padrão da célula-suspensão dos astrócitos. Este poço tem a mesma área de superfície que a inserção 6,5 milímetros (0,33 cm ²⁾ e permite a fácil visualização das células por microscopia de contraste de fase do que a membrana de inserção. Quando se verificar a adesão suficiente dos astrócitos no controlo de 96 poços, os astrócitos foram aderidas adequadamente também a inserção da membrana.
5. Quando astrócitos têm suficientemente respeitado no controle de 96 poços, transferir os conjuntos de inserção para a capa de cultura de tecidos (ver nota acima) e retire cuidadosamente o tubo de silicone externa e plugues. Retornar inserções para a orientação normal (ou seja, na vertical) nas cavidades fornecidas contendo 800 ul / poço de meio de manutenção BEC (secção 1.1.2, supra).

2.3. Sementeira do BEC para a Câmara Luminal acima dos astrócitos

Semente 2x10 ⁴ BECs em 200 mL até a superfície luminal da revestido de colágeno e voltar a insegurançarts na incubadora.

2.4. Coculturing

Co-cultura das inserções SVG / BEC-semeados durante 3 dias em meio BEC sem mudança mídia antes de experimentação.

3. Experimentação com o modelo de certificação Humano (Dia 3)

1. Para estimular as células in vitro de BBB primeira lavagem, substituindo os meios de comunicação abluminais e luminais com 600 mL e 100 mL de meio BECs sem soro, respectivamente.
2. Aspirar o meio do lúmen de novo e substituir com 100 ul de meio isento de soro, com agentes estimulantes.
   Nota: Se a estimulação da câmara abluminal é necessária (para ativar o in vitro a certificação do compartimento astrocitária), aspirar o meio abluminal e substituir com 600 ul de meio sem soro com agentes estimulantes.
3. Teste cada grupo experimental em triplicado (daí, se a estimulação luminal é realizada, o que requer 3 x 100 mL, recomendamos diluir o re Os agentes para as suas concentrações finais em 350 ul de meio isento de soro em cada grupo para minimizar erros de pipetagem entre poços).
4. Realizar paracelular padrão e / ou ensaios de permeabilidade transcelular dos marcadores marcados ^16,24 (para o último usamos isotiocianato de fluoresceína (ITCF) conjugadas com albumina) e / ou medição de TEER ^13,16,25 como descrito anteriormente.

Para ter em conta as flutuações na permeabilidade da linha de base entre os experimentos, analisar alterações na permeabilidade em relação a uma inserção de revestimento sem células (que serve como uma referência para a permeabilidade máxima) e para o grupo tratado com o veículo utilizando a fórmula: permeabilidade (% de máximo) = ( valor de permeabilidade de inserção experimental - valor médio permeabilidade do grupo do veículo) / (valor de permeabilidade do inserto em branco - valor médio permeabilidade do grupo do veículo) X 100.

4. A visualização de células em membranas porosas

nt "> Comentário: células não coradas em membranas de inserção são difíceis de observar por contraste de fase ou de contraste de interferência diferencial microscopia (DIC) desde a membrana é bastante opaca e interfere com a transmissão de luz para lidar com esta questão, desenvolvemos vários procedimentos de coloração de células em. pastilhas, que melhoram grandemente a aparência de células sobre a membrana. Geralmente, manchar as membranas de inserção enquanto ainda ligados à inserção, nas cavidades. As membranas devem ser removidos apenas no fim do procedimento de coloração para fins de montagem.

4.1. Coloração Hematoxilina

1. Fix inserções com gelado a 4% (w / v) de paraformaldeído (PFA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS; NaCl 130 mM, 10 mM de Na ₂ HPO _4, 10 mM de NaH ₂ PO _4, pH 7,2) durante 20 min. Lavar uma vez com PBS.
2. Mergulhe a inserção em solução de hematoxilina 0,1% de Mayer por 2 min.
3. Delicadamente, lave a inserção com água da torneira (submergindo as insert em um copo contendo água da torneira e cuidado pipetando o excesso de água). Transferir a solução para inserção de Scott água de torneira (2 g / l de _NaHCO3, 20 g / L de MgSO ₄₎ para ~ 20 segundos até que a cor azul desejada desenvolve. Lave a inserção de novo com água da torneira (seção 4.1.3). Uma mancha de eosina opcional pode ser introduzida aqui por imersão em solução a inserção eosina 1% durante 10 segundos seguido por uma lavagem com água da torneira.
4. Ar seco a membrana de inserção. Usando um bisturi (corte ao redor da borda da membrana) remover a membrana e montá-lo em uma lâmina de vidro para imagens de campo claro
   Nota: Se o di-N-butylphthalateinxylene (DPX) o meio de montagem é utilizada a inserção lavar com etanol a 100% seguido de xileno antes da remoção e a montagem da membrana.

4.2. Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV)

1. Fix inserções com gelado a 4% (w / v) de PFA em PBS durante 20 min. Lavar três vezes em PBS.
2. Pós-fixar as membranas durante 30 min em 1% (w / v) De tetróxido de ósmio em ₂ O. MQH
3. Lavar as inserções em água (secção 4.1.3) e desidratar em um gradiente crescente de etanol (50%, 70%, 90% durante 5 min cada, em seguida 3x com etanol a 100% durante 10 min cada intervalo).
4. Trate inserções desidratadas com uma mistura de hexametildisilazano (HMDS): etanol (1:2, em seguida, 02:01 por 5 min).
5. Trate inserções com 100% de HMDS para 5 min, ar seco e armazenar em condições dessecadas.
6. Retirar a membrana utilizando um bisturi (corte em torno do bordo da membrana). Examine as membranas por microscopia eletrônica de varredura.

4.3. Imunofluorescência

1. Fix inserções com gelado a 4% (w / v) de PFA em PBS durante 20 minutos, lavar uma vez em solução salina tamponada com Tris (TBS, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, NaCl 154 mM, 0,22 um filtrado).
2. Realizar imunocoloração das células na membrana de inserir tal como previamente descrito ^26.
3. Retirar a membrana utilizando um bisturi (corte em torno do bordo da membrana) e montá-lo em agslides moça com fluorescência meio de montagem. Examinar membrana por microscopia fluorescente.

Resultados

A fim de estabelecer um ser humano, o modelo de contato BBB tínhamos de cultivar SVGs e BEC em membranas porosas com um 3 mM poros de tamanho, mostrado para permitir a passagem de astrócitos finais pés para o contato com as células endoteliais ^14,15,27,28. Uma representação esquemática do modelo de contacto completa está ilustrada na figura 1 (figura da esquerda). O principal desafio técnico apresentado por um sistema de contacto é a necessidade de semear astrócitos contra a gravidade na supe...

Discussão

A investigação médica em patologias do cérebro sofre muita dificuldade translacional. Na área de acidente vascular cerebral isquêmico agudo, por exemplo, muitas drogas que mostrou uma grande promessa em modelos animais falharam na clínica ^38,39. As razões para estes resultados decepcionantes são diversas e incluem infidelidade dos sistemas de testes pré-clínicos com o cenário traçado humana e sobreavaliação dos resultados obtidos a partir de estudos com animais ^21. Uma estratégia para melhorar o va...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fator de Ligação	Cell-Systems Corporation	4Z0-210
Células endoteliais microvasculares cerebrais (BECs), primárias, humanas	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Meio completo	Cell-Systems Corporation	4Z0-500	Suplementado com CSC JetFuel
Meio completo sem soro	Cell-Systems Corporation	SF-4Z0-500	Suplementado com CSC RocketFue
DMEM/F-12 com 15 mM HEPES	Life Technologies	11330-032
Suplemento de crescimento de células endoteliais (de origem bovina)	Sigma-Aldrich	E2759-15MG
Tubo externo de silicone	Watson-Marlow	913.A080.016	Marca Pumpsil, diâmetro interno de 8 mm, parede de 1,6 mm
Soro fetal para bezerros	Lonza	14-501F
Sulfato de gentamicina	Life Technologies	15750-060
Heparina sódica	Pfizer		1.000 U/ml
Hexametildisilazano (HMDS)	Sigma-Aldrich	H4875
Células endoteliais microvasculares do cérebro humano	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Tubo interno de silicone	Watson-Marlow	913.A032.016	Marca Pumpsil, diâmetro interno de 3,2 mm, parede de 1,6 mm
L-Glutamina	Life Technologies	25030
Mayer' s solução de hematoxilina	Amber Scientific	MH
Meio essencial mínimo com Earle' s solução salina balanceada	HyClone Laboratories	SH30244.01
Penicilina/Estreptomicina	Life Technologies	15140
Colágeno de rato I	Trevigen	3440-100-01	Marca Cultrex
Inserções de cultura de tecidos	Corning Life Sciences	3472	Marca Transwell, 6,5 mm de diâmetro, com membrana porosa de poliéster, 3 µ m tamanho de poro