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Artigo de método

High-throughput Citometria de Fluxo Ensaio Celular para detectar anticorpos em N-metil-D-aspartato ou dopamina-2 Receptor em Soro Humano

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DOI:

10.3791/50935

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23 de novembro de 2013

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1Institute for Neuroscience and Muscle Research, The Kids Research Institute at the Children's Hospital at Westmead, The University of Sydney, 2Flow Cytometry Centre, Westmead Millennium Institute for Medical Research

Neste artigo

Resumo

Ao longo dos últimos anos, os ensaios baseados em células vivas têm sido utilizados com sucesso para detectar anticorpos contra antigénios de superfície e de conformação. Aqui, descrevemos um método que utiliza o fluxo de alto rendimento citometria permitindo a análise de grandes grupos de pacientes. Detecção de novos anticorpos irá melhorar o diagnóstico e tratamento de distúrbios mediados pela imunes.

Resumo

Ao longo dos últimos anos, os anticorpos contra a superfície de conformação e proteínas envolvidas na neurotransmissão foram detectados em doenças auto-imunes do sistema nervoso central em crianças e adultos. Estes anticorpos têm sido usados ​​para ajudar no diagnóstico e tratamento. Os ensaios baseados em células têm melhorado a detecção de anticorpos no soro do paciente. Eles baseiam-se na expressão de antigénios de superfície do cérebro em células eucarióticas, que são, em seguida, incubadas com soro de paciente diluído seguido de anticorpos secundários conjugados com fluorocromo. Após a lavagem, o anticorpo secundário de ligação é então analisada por citometria de fluxo. O nosso grupo desenvolveu um fluxo de alto rendimento citometria de ensaio baseado em células vivas para detectar com fiabilidade os anticorpos contra receptores de neurotransmissores específicos. Este método de citometria de fluxo é para a frente, quantitativa, eficiente, e a utilização de um sistema de amostragem de alto rendimento permite grandes grupos de pacientes para ser facilmente testada num curto espaço de tempo. Além disso, esta célula baseada em quantodizer pode ser facilmente adaptado para a detecção de anticorpos para vários alvos antigénicos diferentes, tanto do sistema nervoso central e na periferia. Descobrindo biomarcadores romance anticorpos adicionais permitirá o diagnóstico rápido e preciso e melhorar o tratamento de doenças imunomediadas.

Introdução

Nos últimos anos, as formas auto-imunes do sistema nervoso central, doenças (CNS) tem sido identificado. Tem sido demonstrado que estas doenças estão associadas e definida pela presença de auto-anticorpos. Estes anticorpos ligam-se a receptores neuronais ou proteínas sinápticas envolvidas na neurotransmissão 1,2. Antigénios diferentes foram detectados, tal como o receptor de N-metil-D-aspartato (NMDAR) 3-5, receptor γ-aminobutírico, o B (GABA B) do receptor 6, α-amino-3-hidroxi-5-metil-4- ácido isoxazolopropiónico (AMPA) receptor 7, canal de potássio voltagem-dependentes (CPVD) proteínas associadas: leucina-rico uma proteína ativada por glioma (LGL-1) e associada à contactina proteína 2 (capsr2) receptor 8,9, glutamato 5,10 , e a dopamina-2 receptor (D2R) 11. No passado, estas desordens auto-imunes do sistema nervoso central (principalmente chamados encefalite) eram frequentemente não diagnosticada e não tratada. Estes biomarcadores de anticorpos novela, por exemplo,Anticorpo NMDAR ou anticorpo D2R, melhoraram substancialmente o diagnóstico e consciência, e abriram as opções de tratamento para os pacientes. Na verdade, o tratamento precoce com immunotherapies se associa à melhora resultado 11,12.

Os métodos tradicionais para a detecção de anticorpos, tais como o ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) e Western blot foram utilizados para a detecção de anticorpos no soro. No entanto, eles não são facilmente permitir o reconhecimento de epitopos extracelulares ou de superfície e, em vez disso, pode revelar imunorreactividade contra o epitopo intracelular. Além disso, os anticorpos que se ligam ao domínio extracelular de proteínas importantes envolvidas na neurotransmissão são susceptíveis de ser 2,3,7,13,14 patogénico. Portanto, o desenvolvimento de ensaios precisos e sensíveis para descobrir superfície celular relevante ou alvos de anticorpos extracelulares em pacientes é fundamental. O método padrão de ouro no domínio baseia-se na utilização de células vivas, em chamada "célula-baensaios sed ". Este método envolve a expressão de um antigénio na superfície de células de mamíferos (mais frequentemente nos rins (293) células embrionárias humanas HEK293) na sua forma nativa por transfecção de vectores contendo a sequência de cDNA completa do antigénio de interesse. Nonpermeabilized células vivas são então incubadas com o soro diluído do paciente e seguido por fluorocromo-conjugados com anti-imunoglobulina humana (Ig), o anticorpo secundário. A intensidade ou o nível de fluorescência é detectada e é associado ao nível de ligação de auto-anticorpos. Esta técnica é específica, uma vez que apenas um antígeno é sobre-expresso em células. O mais usado "read-out" tem sido a análise de microscopia confocal após imunocitoquímica 4,5,8-10. No entanto, a citometria de fluxo ensaios baseados em células têm sido usados ​​com sucesso para detectar anticorpos em pacientes com doenças desmielinizantes 15-17. Em particular, 15 Waters et al. Comparado a detecção do anticorpo usando uma panelael das técnicas de detecção de anticorpos, incluindo ensaios com células seguidas por microscopia ou citometria de fluxo analisa e mostrou citometria de fluxo ensaio baseado em célula a ser o método mais sensível, preciso e confiável. Portanto, citometria de fluxo ensaio baseado em células é vantajoso, pois é quantitativa, não dependente de investigador, e não envolve qualquer uso de material radioativo. Também é conveniente, uma vez que permite que grandes grupos de pacientes a serem ensaiadas em um curto espaço de tempo.

Mais recentemente, temos um fluxo otimizado de alto rendimento citometria de ensaio baseado em células para detectar anticorpos NMDAR e D2R anticorpo em pacientes com doenças auto-imunes do SNC 11. O nosso grupo detectados recentemente nos soros de anticorpos NMDAR paciente utilizando citometria de fluxo de ensaio de base celular. Estes soros de anticorpos positivos NMDAR foram previamente analisados ​​por meio de microscopia confocal e também foram encontrados para ser positivo 11. Este protocolo descreve uma citometria de fluxo de ensaio à base de células para a detecção de canticorpo CNS onformation sensível no soro do paciente, utilizando um amostrador automático de alto rendimento.

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Protocolo

1. Subclonagem Estratégia Construir pIRES2-EGFP Vector Codificação D2R ou NMDAR

  1. Obter full-length cDNA clone de D2R humano ou NMDAR subunidade 1 (NR1).
  2. Escolher um vector de expressão, tal como pIRES2-EGFP, o que é adequado para a expressão de proteínas de transmembrana com uma proteína verde fluorescente melhorada (GFP) repórter sob o controlo de um local de entrada de ribossoma interno (IRES), permitindo que ambos os antigénios e GFP para ser co-expressas em células separadamente.
  3. Subclone cDNA humano dentro pIRES2-EGFP vetor.
    1. Para subclonar cDNA, utilizar enzimas de restrição adequadas (por exemplo NheI e XhoI para humano D2R cDNA).
    2. CDNA corte ligadura inserir dentro restrito vetor pIRES2-EGFP.
    3. Seqüência ligado pIRES2-EGFP D2R ou NMDAR vetor para verificar se o vetor contém a seqüência correta.
    4. Purificar e amplificar pIRES2-EGFP D2R ou NMDAR vetor para uso posterior na transfecção.
itle "> 2. HEK293 transfecção celular para Expressão da Neuronal Antígeno

  1. Células de cultura HEK293 em tecidos frascos de cultura com Meio Eagle Modificado fresco por Dulbecco (1x) (DMEM) completo com 4,5 g / L de D-glucose, L-glutamina e 110 mg / piruvato de sódio L suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), GlutaMAX 2 mM, e 50 ug / ml de gentamicina.
  2. Retire células HEK293 usando tripsina e transferir para um tubo cônico.
    1. Lave as células por centrifugação a 250 xg durante 6 minutos e ressuspender o sedimento de células em meio DMEM completo fresco.
  3. Contar as células e as sementes em placas de 6 poços a cerca de 8 x 10 5 células / poço e cultura durante a noite em DMEM 2 ml a 37 ° C e 5% de CO 2 num incubador.
  4. Uma vez que eles tenham atingido cerca de 70% de confluência, transfecção as células HEK293 com pIRES2-EGFP NR1 (células HEK293 NMDAR +), pIRES2-EGFP D2R (células HEK293 D2R +) e (células HEK293 CTL, controle vetorial) pIRES2-EGFP como segue.Mantenha algumas células HEK293 untransfected de indemnização mais tarde.
    1. Prepare o volume requerido da mistura de transfecção compreende de 2,5 ug de ADN, 200 ul de cloreto de sódio a 0,9% e 4 ug / ml de polietilenimina / poço (contendo cada um 2 ml de DMEM completo fresco).
    2. Vortex imediatamente a mistura para 10 seg e incubar à temperatura ambiente (RT) durante 10 minutos, antes da adição do volume da mistura de transfecção para os poços apropriados.
    3. Cubra o prato, embrulhe os lados com Parafilm e centrifugar a 280 xg por 5 min para ajudar transfecção celular.
    4. Remover o Parafilm e depois colocar na incubadora a cultura a 37 ° C.
    5. Substitua os meios de cultura de 18 horas depois, com DMEM completo fresco e manter em cultura por outra 72 horas.
    6. Opcional: 72 horas pós-transfecção, as células transfectadas podem ser seleccionadas por cultura em meio DMEM completo suplementado com 250 ug / ml de geneticina, de modo a obter um policlonal transfectante estável.
3. Citometria de Fluxo Ensaio Celular para Detecção de Anticorpos para Antígenos de Superfície Neuronal

  1. Separar HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R +, e células HEK293 CTL por incubação com 500 ul / poço Versene durante aproximadamente 5 min a 37 ° C.
    1. Ressuspender em 2ml/well de PBS (-Ca 2 + /-Mg 2 +) suplementado com 2% de FBS (PBS / FBS) e transferência para a 15 ml ou 50 ml de tubo cónica.
    2. Lavar as células por centrifugação a 250 xg durante 6 minutos e ressuspender o sedimento de células em 15-50 ml de PBS / FBS. Repita lavagem 2x.
    3. Contar as células e em seguida ressuspender em PBS / FBS a 1 x 10 6 células / ml.
  2. Conceber o molde de 96 cavidades para a aquisição de citometria de fluxo, uma vez que as células HEK293 D2R + ou HEK293 NMDAR +, bem como células HEK293 CTL terá de ser incubada com cada amostra de doente ou anticorpo primário.
  3. Células de sementes em uma placa de 96 poços de fundo em V a 50.000 células / nósll acordo com a citometria de fluxo modelo de aquisição.
  4. Agregar as células por centrifugação a placa de 96 poços a 450 g durante 5 min e suavemente remover o sobrenadante utilizando uma pipeta multi-canal electrónico ou manual, inclinando a placa sobre um ângulo e tendo cuidado para não aspirar o sedimento celular.
  5. Incubar HEK293 D2R +, HEK293 NMDAR +, e células HEK293 CTL durante 1 h à TA no escuro, com:
    1. Diluições em série de anticorpo primário, a fim de avaliar a expressão do antigénio de superfície.
    2. As amostras dos pacientes, a fim de detectar anticorpos.
  6. Use fluxo apropriado citometria controles de compensação, por exemplo. células HEK293 não transf ectadas não coradas, GFP + células HEK293 (AF647 -), e AF647 + células HEK293 não transf ectadas (GFP).
  7. Lavar as células por centrifugação a 450 xg durante 5 min e ressuspender o sedimento de células em 170 ul de PBS / FBS. Repita o passo de lavagem mais duas vezes.
  8. Incubar as células durante 1 hr à TA no escuro, com uma diluição de 1:100 de anticorpo secundário conjugado com AF647 (IgG anti-humano para o soro do paciente e anti-IgG de ratinho a anticorpos primários anti-NR1 ou anti-D2R).
  9. Lave as células três vezes, tal como no passo 3.7, e voltar a suspender em 35 ul de PBS / FBS por citometria de fluxo de células de aquisição.
  10. Configure o amostrador de alto rendimento (HTS) no citômetro de fluxo (BDLSRII).
  11. Adquirir 10.000 eventos / poço de acordo com o modelo de aquisição de citometria de fluxo.
  12. Export e, em seguida, analisar os dados para a análise usando uma citometria de fluxo de pacotes de software, como FlowJo v7.5:
    1. Primeiro, porta as células HEK293 vivos, com base para a frente (tamanho) e lateral (granularidade), espalha.
    2. Além disso portão células HEK293 ao vivo com base na alta GFP-positividade para analisar apenas as células transfectadas.
    3. Determinar a intensidade média de fluorescência (MFI) do canal AF647 nas células GFP positivas vivas.
    4. Exportar dados para o Excel ou prisma de análise:
      1. Lote concentrations de anticorpo primário (anti-NMDAR ou anticorpo anti-D2R) versus o MFI obtido a partir das células incubadas com estes anticorpos.
      2. Para cada amostra de doente e de controlo, determinar o ΔMFI subtraindo o MFI das células HEK293 CTL do MFI do células HEK293 NMDAR + HEK293 D2R + ou, respectivamente.
      3. Calcular o limiar de positividade por adição de três desvios padrão acima da média ΔMFI do grupo de controlo.
      4. Amostras individuais de plotagem agrupados de acordo com seu tipo de soro em um gráfico e representam o limite como uma linha.

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Resultados

Células vivas HEK293 D2R + e HEK293 CTL foram adquiridas no citômetro de fluxo utilizando um amostrador de alto rendimento. Durante a análise, as células foram fechado com base na dispersão para a frente (tamanho) e (granularidade) parâmetros (Figuras 1A e 1D) dispersão lateral. Células HEK293 transfectadas expressa a molécula repórter, a GFP, no citoplasma, e as células não transfectadas foram excluídos da análise (Figuras 1B e 1E).

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Discussão

Este artigo descreve uma nova aplicação da citometria de fluxo ensaio baseado em células vivas para detectar anticorpos que visam as proteínas neuronais específicos na superfície celular utilizando um amostrador de alto rendimento. Usando esta técnica, informamos que um subgrupo de pacientes afetados com doenças auto-imunes do sistema nervoso central têm anticorpos séricos para a superfície ou à superfície NMDAR D2R.

Passos essenciais para a detecção de anticorpo óptima utilizando este fluxo...

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Divulgações

Conflito de interesse: A patente foi arquivada por FB e RCD (Universidade de Sydney) alegando D2R como alvo para auto-anticorpos.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo australiano Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica, Fundação Científica Star (Austrália), Síndrome de Tourette Association (EUA), A esclerose múltipla Trish Fundação de Pesquisa e Pesquisa da Esclerose Múltipla Austrália, Fundação Petre (Austrália), a Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Austrália). Agradecemos a todos os pacientes e familiares que forneceram amostras para o nosso estudo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Clontech6029-1vetor de pIRES2-EGFP
(D2R) T Centro de Recursos de cDNADRD020TN00
Subunidade Humana 1 do NMDAR (NR1) cDNAPresente do Prof A. Vincent  (Oxford, Reino Unido)
Anticorpo anti-NR1 humano de camundongo purificado monoclonal (clone: 54.1)BD Pharmingen556308
IgG anti-DRD2 monoclonal purificado de camundongo (clone: 1B11)Sigma-AldrichWH0001813M1-50UG
Alexa Fluor 647 burro anti-mouse IgG (H + L)InvitrogenA31571
Alexa Fluor 647 cabra anti-humano IgG (H + L)InvitrogenA21445
Dulbecco' s Meio Eagle Modificado (1x) 4,5 g/L D-glicose, L-Glutamina e 110 mg/L de piruvato de sódioInvitrogen11995-065
Soro bovino fetalInvitrogen10099-141
GentamicinaInvitrogen15710-072
GlutaMAXInvitrogen35050-061
Penicilina-estreptomicinaInvitrogen15140-122
GeneticinInvitrogen10131-035
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (1x) (-Ca2+/-Mg2+)Invitrogen14190-144
TrypLE Express (1x) com Fenol VermelhoInvitrogen12605-028
0,9% Cloreto de sódioBaxterAHF7975
PolietileniminaPolysciences Inc9002-98-6
VerseneInvitrogen15040-066
XhoIRoche10899194001
Purificação PCR Roche
JetQuick Gel Extraction Spin KitGenomed420050
Plasmídeo  Mais  Maxi KitQiagen12963
Nome do Equipamento/Software Número deCatálogoda EmpresaModelo/Versão
Citômetro de fluxo com sistema de amostragem de alto rendimentoBD BiosciencesBDLSRII com HTS
Microscópio invertidoOlympusCKX41 (com lâmpada de mercúrio e fonte de alimentação U-RFLT50)
Pipeta eletrônica multicanal (15-300 μ l)Eppendorf613-2240P12 canais Xplorer Plus
ExcelMicrosoft2010
PrismGraphPad Software, Inc.v4
FlowJoTreestarv7.5
Tubos cônicos de polipropileno de 50 mlBD Biosciences352070
Placa de 6 poçosBD Biosciences353046
Balão de cultura de tecidos (T75)BD Biosciences353136
ParafilmPechiney Plastic PackagingPM-992
V-bottom 96 poços placaCorning651180

cDNA Missouri S& do receptor humano da HA-dopamina-2 de do Kit de 10885843001 PureLink Invitrogen K3100-01 T4 DNA Ligase Roche 10481220001

Referências

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