Artigo de método

High-throughput Citometria de Fluxo Ensaio Celular para detectar anticorpos em N-metil-D-aspartato ou dopamina-2 Receptor em Soro Humano

DOI:

10.3791/50935

⸱

23 de novembro de 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Neuroscience and Muscle Research, The Kids Research Institute at the Children's Hospital at Westmead, The University of Sydney, 2Flow Cytometry Centre, Westmead Millennium Institute for Medical Research

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ao longo dos últimos anos, os ensaios baseados em células vivas têm sido utilizados com sucesso para detectar anticorpos contra antigénios de superfície e de conformação. Aqui, descrevemos um método que utiliza o fluxo de alto rendimento citometria permitindo a análise de grandes grupos de pacientes. Detecção de novos anticorpos irá melhorar o diagnóstico e tratamento de distúrbios mediados pela imunes.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ao longo dos últimos anos, os anticorpos contra a superfície de conformação e proteínas envolvidas na neurotransmissão foram detectados em doenças auto-imunes do sistema nervoso central em crianças e adultos. Estes anticorpos têm sido usados ​​para ajudar no diagnóstico e tratamento. Os ensaios baseados em células têm melhorado a detecção de anticorpos no soro do paciente. Eles baseiam-se na expressão de antigénios de superfície do cérebro em células eucarióticas, que são, em seguida, incubadas com soro de paciente diluído seguido de anticorpos secundários conjugados com fluorocromo. Após a lavagem, o anticorpo secundário de ligação é então analisada por citometria de fluxo. O nosso grupo desenvolveu um fluxo de alto rendimento citometria de ensaio baseado em células vivas para detectar com fiabilidade os anticorpos contra receptores de neurotransmissores específicos. Este método de citometria de fluxo é para a frente, quantitativa, eficiente, e a utilização de um sistema de amostragem de alto rendimento permite grandes grupos de pacientes para ser facilmente testada num curto espaço de tempo. Além disso, esta célula baseada em quantodizer pode ser facilmente adaptado para a detecção de anticorpos para vários alvos antigénicos diferentes, tanto do sistema nervoso central e na periferia. Descobrindo biomarcadores romance anticorpos adicionais permitirá o diagnóstico rápido e preciso e melhorar o tratamento de doenças imunomediadas.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos últimos anos, as formas auto-imunes do sistema nervoso central, doenças (CNS) tem sido identificado. Tem sido demonstrado que estas doenças estão associadas e definida pela presença de auto-anticorpos. Estes anticorpos ligam-se a receptores neuronais ou proteínas sinápticas envolvidas na neurotransmissão 1,2. Antigénios diferentes foram detectados, tal como o receptor de N-metil-D-aspartato (NMDAR) 3-5, receptor γ-aminobutírico, o B (GABA B) do receptor 6, α-amino-3-hidroxi-5-metil-4- ácido isoxazolopropiónico (AMPA) receptor 7, canal de potássio voltagem-dependentes (CPVD) proteínas associadas: leucina-rico ....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Subclonagem Estratégia Construir pIRES2-EGFP Vector Codificação D2R ou NMDAR

  1. Obter full-length cDNA clone de D2R humano ou NMDAR subunidade 1 (NR1).
  2. Escolher um vector de expressão, tal como pIRES2-EGFP, o que é adequado para a expressão de proteínas de transmembrana com uma proteína verde fluorescente melhorada (GFP) repórter sob o controlo de um local de entrada de ribossoma interno (IRES), permitindo que ambos os antigénios e GFP para ser co-expressas em células separadamente.
  3. Subclone cDNA humano dentro pIRES2-EGFP vetor.
    1. Para subclonar cDNA, utilizar enzimas de restrição adequadas (por exemplo NheI e ....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Células vivas HEK293 D2R + e HEK293 CTL foram adquiridas no citômetro de fluxo utilizando um amostrador de alto rendimento. Durante a análise, as células foram fechado com base na dispersão para a frente (tamanho) e (granularidade) parâmetros (Figuras 1A e 1D) dispersão lateral. Células HEK293 transfectadas expressa a molécula repórter, a GFP, no citoplasma, e as células não transfectadas foram excluídos da análise (Figuras 1B e 1E).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo descreve uma nova aplicação da citometria de fluxo ensaio baseado em células vivas para detectar anticorpos que visam as proteínas neuronais específicos na superfície celular utilizando um amostrador de alto rendimento. Usando esta técnica, informamos que um subgrupo de pacientes afetados com doenças auto-imunes do sistema nervoso central têm anticorpos séricos para a superfície ou à superfície NMDAR D2R.

Passos essenciais para a detecção de anticorpo óptima utilizando este fluxo.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Conflito de interesse: A patente foi arquivada por FB e RCD (Universidade de Sydney) alegando D2R como alvo para auto-anticorpos.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelo australiano Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica, Fundação Científica Star (Austrália), Síndrome de Tourette Association (EUA), A esclerose múltipla Trish Fundação de Pesquisa e Pesquisa da Esclerose Múltipla Austrália, Fundação Petre (Austrália), a Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Austrália). Agradecemos a todos os pacientes e familiares que forneceram amostras para o nosso estudo.

....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Clontech6029-1vetor de pIRES2-EGFP
(D2R) T Centro de Recursos de cDNADRD020TN00
Subunidade Humana 1 do NMDAR (NR1) cDNAPresente do Prof A. Vincent  (Oxford, Reino Unido)
Anticorpo anti-NR1 humano de camundongo purificado monoclonal (clone: 54.1)BD Pharmingen556308
IgG anti-DRD2 monoclonal purificado de camundongo (clone: 1B11)Sigma-AldrichWH0001813M1-50UG
Alexa Fluor 647 burro anti-mouse IgG (H + L)InvitrogenA31571
Alexa Fluor 647 cabra anti-humano IgG (H + L)InvitrogenA21445
Dulbecco' s Meio Eagle Modificado (1x) 4,5 g/L D-glicose, L-Glutamina e 110 mg/L de piruvato de sódioInvitrogen11995-065
Soro bovino fetalInvitrogen10099-141
GentamicinaInvitrogen15710-072
GlutaMAXInvitrogen35050-061
Penicilina-estreptomicinaInvitrogen15140-122
GeneticinInvitrogen10131-035
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (1x) (-Ca2+/-Mg2+)Invitrogen14190-144
TrypLE Express (1x) com Fenol VermelhoInvitrogen12605-028
0,9% Cloreto de sódioBaxterAHF7975
PolietileniminaPolysciences Inc9002-98-6
VerseneInvitrogen15040-066
XhoIRoche10899194001
Purificação PCR Roche
JetQuick Gel Extraction Spin KitGenomed420050
Plasmídeo  Mais  Maxi KitQiagen12963
Nome do Equipamento/Software Número deCatálogoda EmpresaModelo/Versão
Citômetro de fluxo com sistema de amostragem de alto rendimentoBD BiosciencesBDLSRII com HTS
Microscópio invertidoOlympusCKX41 (com lâmpada de mercúrio e fonte de alimentação U-RFLT50)
Pipeta eletrônica multicanal (15-300 μ l)Eppendorf613-2240P12 canais Xplorer Plus
ExcelMicrosoft2010
PrismGraphPad Software, Inc.v4
FlowJoTreestarv7.5
Tubos cônicos de polipropileno de 50 mlBD Biosciences352070
Placa de 6 poçosBD Biosciences353046
Balão de cultura de tecidos (T75)BD Biosciences353136
ParafilmPechiney Plastic PackagingPM-992
V-bottom 96 poços placaCorning651180

cDNA Missouri S& do receptor humano da HA-dopamina-2 de do Kit de 10885843001 PureLink Invitrogen K3100-01 T4 DNA Ligase Roche 10481220001

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
  2. Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS:....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Detec o de AnticorposAmostrador de Alto RendimentoC lulas HEK 293Rep rter GFPIntensidade M dia de Fluoresc nciaAnticorpo Secund rio

Artigos relacionados