Um dispositivo simples para Estimulador Evocando Ponto-como estímulos táteis: A Searchlight para LFP a Spike Transitions

Resumo

Para elucidar o complexo de transição locais Campo Potenciais (LFPs) para picos um estimulador adequado para estímulos periféricos mecânicos leves foi construído. Como uma aplicação, as atividades spiking gravados a partir de córtex somatosensorial foram analisados ​​por uma estratégia de otimização multi-objetivo. Os resultados demonstraram que o estimulador proposto foi capaz de entregar estímulos táteis com milissegundo e precisões milimétricas.

Resumo

Investigação neurofisiológica atual tem o objetivo de desenvolver metodologias para investigar a rota do sinal de neurônio para neurônio, ou seja, nas transições de picos para locais de Campo Potenciais (LFPs) e de LFPs de spikes.

LFPs têm uma dependência complexa sobre a atividade de pico e sua relação ainda é pouco compreendida ^1. A elucidação dessas relações sinal seria útil tanto para o diagnóstico clínico (por exemplo, paradigmas de estimulação para Estimulação Cerebral Profunda) e para uma compreensão mais profunda das estratégias de codificação neural em condições normais e patológicas (por exemplo, epilepsia, doença de Parkinson, dor crônica). Para tal, é preciso resolver questões técnicas relacionadas a dispositivos de estimulação, paradigmas de estimulação e análises computacionais. Portanto, um dispositivo de estimulação feito sob medida foi desenvolvido a fim de entregar estímulos bem regulados no espaço e no tempo que não incorrem em ressonância mecânica. Subsequentemente,como uma exemplificação, um conjunto de relações LFP-pico de confiança foi extraído.

O desempenho do dispositivo foi investigada por gravações extracelular, spikes conjunta e respostas LFP aos estímulos, a partir do rato córtex somatosensorial primário. Em seguida, por meio de uma estratégia de otimização multi-objetivo, foi estimado um modelo preditivo para a ocorrência de pico com base em LFPs.

A aplicação deste paradigma mostra que o dispositivo está devidamente adaptado para oferecer alta estimulação tátil freqüência, superando atuadores piezoelétricos comuns. Como uma prova da eficácia do dispositivo, os seguintes resultados foram apresentados: 1) o tempo e a fiabilidade das respostas LFP bem corresponder as respostas pico, 2) LFPs são sensíveis à história estimulação e capturar não só a resposta média, mas também o teste-a-teste flutuações na actividade de pico e, finalmente, 3), utilizando o sinal LFP é possível estimar uma gama of modelos preditivos que capturam diferentes aspectos da atividade do ponto.

Introdução

No contexto do sinal de processamento da resposta de impulso proporciona uma caracterização fundamental do comportamento de um sistema dinâmico.

Embora o estímulo impulso ideal não é praticamente possível, é possível obter uma aproximação razoável de que através da utilização de um elemento actuador que gera deslocamentos de alta frequência. Este tipo de estimulação tátil-vibratória luz é conhecido por alvo tanto de pele profunda (por exemplo, de resposta rápida, rápida adaptação corpúsculos de Pacini) ² e receptores superficiais (por exemplo, baixo limiar lentamente adaptando Merkel estruturas discóides) ^2.

Aparelhos de estimulação atuais, atuadores piezoelétricos principalmente, são acusados ​​de uma série de inconvenientes, não menos importante, ressonâncias e pequenos deslocamentos. Para superar essas falhas, uma implementação alternativa de estimulação impulso-como é proposto, usando uma ponta embotada (uma dica cactus suavizada no nosso caso) verticalmentemontado sobre o centro da membrana de um alto-falante de cone de gama média. Isto proporciona a vantagem de deslocamentos maiores e mais amplo espectro de frequências.

Uma aplicação eficaz de um tal dispositivo é o estudo do problema neurofisiológicos relevante do LFPs a picos de dependência. Por causa da associação temporal sutil entre esses eventos elétricos era necessário um dispositivo finamente reguladas para a entrega de estímulos periféricos. Os estímulos teve que ser mais rápido e espacialmente selectiva quanto possível, a fim de reduzir o "ruído de fundo" e aguçar os sinais de interesse. Para esta finalidade, o dispositivo de estimulação e o protocolo de entrega de estímulo foram optimizados em conjunto para a tarefa. Neste trabalho, descrevemos a técnica e apresentar alguns resultados representativos.

Um protocolo de estimulação com base em pulsos-aleatória pareada foi projetado e otimizado, a fim de evitar a habituação. Este protocolo oferece a vantagem de par clássicoed pulsos e reduziu a possibilidade de bloqueio espúria entre estímulos e explosões periódicas espontâneas de atividade neuronal.

Ao utilizar este randomizados pulso emparelhado foi possível obter LFP e Spike respostas rápidas e confiáveis ​​e para capturar a característica especial dessas respostas relacionadas com a dependência de ambos os LFPs e picos sobre a história estimulação. Com efeito, a partir das respostas LFP-primas, um conjunto de três LFP apresenta (a própria LFP LFP primeira derivada e fase da primeira derivada) fortemente correlacionando-se com a resposta média de pico, também foi extraído.

Poucos métodos têm sido propostos para ajustar modelos que prevêem picos de LFPs ^3,4. Em geral, um ponto crítico do processo de montagem do modelo, comum também para a previsão de eventos de pico do sinal de estímulo, é constituída pela escolha apropriada da função objetivo para maximizar / minimizar. Enquanto uma série de funções objetivo foi propord (por exemplo, correlação e coerência) ⁵ nenhum deles capta em conjunto toda a complexidade das respostas spike. Assim, é introduzido um quadro romance baseado em otimização multi-objetivo. Mostramos que, usando a proposta concebida e este quadro computacional, é possível estimar um conjunto de modelos de previsão com base em forte LFP a espiga relacionamentos.

Protocolo

Declaração de ética

Para estudar como estímulos sensoriais são representados pela atividade neuronal, não há alternativa para o uso de animais eo uso de uma abordagem em vivo. Todos os animais foram tratados ao longo das Leis italianas e europeias sobre o tratamento de animais em Pesquisa Científica (Comitê Italiano de Bioética, o Decreto-Lei sobre o tratamento de animais em pesquisa, 27 de janeiro de 1992, n º 116). O Conselho Nacional de Pesquisa, onde os experimentos foram realizados, adere ao Comitê Internacional de Laboratório de Ciência Animal (ICLAS), em nome da Organização das Nações Unidas para a Educação, a Ciência ea Organizações Culturais (UNESCO), o Conselho de Organizações Internacionais de Ciências Médicas (CIOMS ) e da União Internacional de Ciências Biológicas (IUBS). Como tal, não há aprovação específica do protocolo foi necessário. A aprovação do Ministério da Saúde, é classificado como "Biella 1, 3/2011" nos arquivos do Comitê de Ética daUniversidade de Milão.

1. Preparação dos animais experimentais

1. Escolha ratos machos aproximadamente 300-400 g em tamanho.
2. Anestesiar os ratos para a preparação experimental.
   1. Injectar por via intraperitoneal uma solução de barbitúrico (pentobarbital, 50 mg / kg por indução, 10 mg / kg para manutenção).
   2. Verifique o nível de anestesia por baixo limiar e alto limiar estímulos mecânicos sobre uma pata garantindo que nenhum reflexo de retração ocorre.
   3. Prepare a pele do crânio raspando a calota craniana com precisão e, em seguida, fazer uma incisão para expor a superfície craniana.
   4. Canular a traqueia, por uma cânula traqueal (diâmetro interno de 2 mm, e diâmetro externo de 2,5 mm) fixando-o por ligação cirúrgica em torno da própria traqueia.
   5. Lateralmente ao segmento traqueal expor a veia jugular e canular que a inserção de uma cânula (PE10), ligada a uma seringa de fixação por ligação cirúrgica em torno do navio.
3. Monte o rato em um aparelho estereotáxico.
   1. Proteja corpo rato e coloque em uma posição supina.
   2. Fixe a cabeça por barras de ouvido e bloquear o focinho. Coloque uma ou duas gotas de anestésico local (lidocaína) no ouvido do rato antes de colocar barras de ouvido.
4. Regular a temperatura do bloco estereotáxico por uma almofada de aquecimento controlado electronicamente, mantendo a temperatura a 37,5 ° C.
5. Conecte o tubo traqueal ao aparelho de anestesia respiratório.
   1. Coloque o aparelho de anestesia respiratória em um acidente vascular cerebral / s entregar isoflurano (2,5% 0,4-0,8 L / min) e O ₂ (0,15-0,2 L / min).
6. Limpe cuidadosamente a calota craniana por um anti-séptico tópico iodopovidona.
7. Tomar um bisturi estéril e cortar longitudinalmente na linha média a partir da base da cabeça até o ângulo do osso occipital.
   1. Divaricate as fronteiras da ferida por um afastador e corrigi-los por dois pequenos fórceps cocker aplicado to das fronteiras da ferida.
   2. Identificar o periósteo, apontando uma luz sobre um cofre de crânio observando a superfície translúcida. Raspe cuidadosamente o cofre osso remoção do periósteo e expondo a superfície óssea.
   3. Fornecer hemostasia com uma ponta de algodão ou esponja cirúrgica sobre a superfície do osso se hemorragias focais aparecer sobre o osso.
8. Com uma caneta de ponta fina, identificar o ponto bregma estereotáxica no ponto de intersecção das suturas mediosagittal e coronal.
   1. Sob o controlo do microscópio cirúrgico, identificar a área de estereotaxia (S1HL) sobrepondo o córtex somatossensorial contralateral à pata posterior utilizado na experiência (bregma, AP -0,5 a 1,2 mm, LL -2,3 a 2,5 mm).
9. Com uma caneta de ponta fina desenhar o perímetro quadrado que delimita o buraco a ser perfurado.
   1. Fure a 9 mm ² furo no quadrado azul previamente identificados remoção da telha do osso.
   2. Limpe e absorver sangramentos osso potenciais.
   3. Remova cuidadosamente a dura-máter e cobrir a superfície cortical com uma esponja cirúrgica embebido no líquido cefalorraquidiano artificial mantida em 37,5 º C.
10. Corrigir a matriz eletrodo a um detentor conectado a um micromanipulador eletrônico.
    1. Conecte o chefe da matriz para o pré-amplificador por um microconector.
    2. Dirija manualmente a matriz de eletrodo (sob controle de microscópio cirúrgico) até a superfície cortical (sem tocá-lo).
    3. Ligue os amplificadores com sinal auditivo.
    4. Dirija, pelo controle eletrônico, a matriz de eletrodo para tocar a superfície cortical até que o contato seja alcançado, sinalizado por um ruído mudança som claro.
    5. Puxe para baixo a matriz de eletrodo por passos controlados eletronicamente (2 m / passo) até uma profundidade de 350-400 mM é alcançado (camada cortical IV).
    6. Verificar a capacidade de resposta dos neurônios por leves toques na pata posterior contralateral.
    7. Ajuste a profundidade de algumas novas medidas até que uma resposta clara spiking é observado.
    8. Paralisar o rato por thriethiodide Galamina intravenosa (20 mg / kg / hr). Use doses refratadas ao longo da experiência para manter os níveis de curarização (0,2 ml / 1 hr).

2. Tratamento de Sinais

1. Defina o filtro de banda software para [0,1 6000] Hz.
   1. Anote os sinais neuronais da matriz de microeletrodos 8 canais amostrados a 32 kHz.
2. Após a aquisição termina, exportar os sinais gravados em um formato binário adequado para pós-processamento.
   1. Execute o procedimento de pico de classificação por meio da caixa de ferramentas Wave_clus ^11.

3. Fabricação e configuração do dispositivo de estimulação

1. Montar uma haste cactus (com ponta embotada) ortogonal à superfície de um alto-falante mid-range colagem base talo para a tampa.
2. Programa umamicrocontrolador para fornecer pulsos de voltagem a um circuito de driver para o alto-falante.
   1. Programar o microcontrolador para entregar dois pulsos pareadas de corrente por segundo (Figura 1C).
3. Monte o alto-falante e do microcontrolador por meio de um L293D h-ponte com componentes passivos básicos (ver Figura 1A).
4. Ligue o microcontrolador para uma bateria recarregável 12 V.

4. Estimulação Protocolo

1. Cole o aspecto dorsal do hind-pata de uma estrutura sólida, expondo a superfície volar e evitando torções articulares.
2. Coloque a ponta do dispositivo de estimulação para o cargo de membro / pata desejado.
3. Ligar o aparelho de estimulação.

Desconectado etapas:

5. Avaliação das respostas de Spike

1. Para cada neurônio gravado, calcular a informação mútua Shannon (MI) do estímulo evocado atividade spiking (estímulo category é 1, estímulo, ou 0, sem estímulo).
   1. Estimar a probabilidade condicional resposta p (r | s) onde s representa a categoria estímulo e r representa o número de pontos emitidos dentro de uma janela de tempo fixo.
   2. Corrigir a estimativa MI usando o procedimento descrito baralhar ^9.

6. Avaliação das respostas LFP

1. Filtrar o sinal gravado no intervalo de frequência [0,1 100] Hz, a fim de obter o sinal LFP
2. Computar LFPSNR, uma medida da capacidade de resposta LFP, como explicado na referência ^10.

7. Modelo de estimativa

1. Gerar um modelo da forma
   
   onde os argumentos x representam três características diferentes (LFP x ₁ o próprio LFP, < in> ₂ x o seu derivado e x ₃ a fase de Hilbert de um seu derivado) e F é expressa como se segue
   
   os coeficientes de g são pesos de uma combinação linear e f é um operador que leva tanto o valor absoluto, o poder ou o valor original de cada x _i.
2. Use o algoritmo NSGAII para estimar os parâmetros e operadores de modelo usando os três objetos seguintes: i) um local, de tentativa de contra-relógio base, medida de ajuste , Em que N e N _{sp r} representam, respectivamente, os picos de contagem geral e o comprimento do vector de resposta; ii) uma medida global de ajuste com base na resposta média"largura =" ad/50941/50941eq4.jpg 205 "/> em que N representa _{respectivamente} o comprimento da resposta média, iii) uma medida de complexidade do modelo (ver também) ¹⁰ .

8. A confirmação histológica

1. Sacrifique o rato.
   1. No final de gravações experimentais, colocar o animal sob anestesia profunda gasoso (isoflurano a 2%, 4 L / min) e administrar por via intravenosa uma overdose de barbitúrico (> 50 mg / kg, com pentobarbital).
   2. Espere a parada cardíaca.
   3. Desmontar o rato a partir do aparelho estereotáxico
2. Perfusão.
   1. Coloque o rato que coloca sobre uma grade em uma bacia para recolher o sangue e fluidos de perfusão.
   2. Abra o tórax dissecando o esterno separando as inserções das costelas.
   3. Bloquear o processo xifóide do esterno com uma pinça cocker e derrubando cranially do esterno e das costelas divaricate sobre o coração.
   4. Identificar o ventrículo esquerdo e do átrio direito, coloque um calibre nove embotada ponta de agulha (conectado à cânula de perfusão) para o ventrículo e abrir com uma tesoura fina cirúrgicos no átrio direito.
   5. Iniciar a perfusão com frio (4 ° C) solução fisiológico heparinizado (250 ml) seguido pela perfusão de uma solução de formalina a 4% (250 ml).
3. Extraia o cérebro do crânio, abrindo a caixa craniana com uma pinça adequada e colocar o cérebro em uma solução de formol a 10%.
4. Depois de uma semana, preparar os cortes histológicos por um micrótomo (10 mM de espessura).
5. Mancha as seções coronal e sagital do cérebro com solução cresil violeta.

Resultados

Características de excursão Dica

Para caracterizar as propriedades dinâmicas do dispositivo de estimulação proposto, uma série de experimentos foram instalados. Um dispositivo específico que consiste em um arsenieto de gálio díodo emissor de infravermelhos acoplado a um fototransistor de silício foi utilizado para avaliar o deslocamento da ponta, a duração do deslocamento e as possíveis atrasos de deslocamento. Por meio deste interruptor interruptor óptico, foi colocado na ponta do estimulador ...

Discussão

Este trabalho, em primeiro lugar apresentou uma nova, simples e de baixo custo dispositivo que permite entregar os estímulos sensoriais de ponto como rápidos e espacialmente. Em seguida, um par protocolo randomizado estimulação de pulso e um conjunto de análises computacionais foram validados. O objetivo geral foi o de estabelecer um quadro para a estimativa das relações LFP-pico em registros eletrofisiológicos durante a estimulação tátil.

O dispositivo, o protocolo ea abordagem analítica co...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microstepper	AB Transvertex (Estocolmo, Suécia)		O microstepper usado para puxar para baixo a matriz de eletrodos
Cheetah System	Neuralynx de 32 canais (MT, EUA)		O sistema de registro eletrofisiológico
L293D h-bridge	RS Components (Cinisello Balsamo, Itália)		A ponte usada para conectar o microcontrolador ao alto-falante
H21A3 Optical Interrupter Switch	Fairchild Semiconductor Corporation (San Jose, Califórnia)		O fototransistor usado para estabilizar o deslocamento da ponta
Arduino Uno	Arduino (Duemilanove, Itália)		O microcontrolador usado para fornecer pulso de corrente ao alto-falante
Microeletrodo Matrices GB1	FHC
Isoflurano	Rhodia Organique Fine Ltd.		O anestésico usado para preparar animais
Aparelho estereotáxico	Narishighe (Tóquio, Japão)
Ratos machos Sprague-Dawley	Charles River (Calco, LC, Itália)
Trietiodeto de gallamina	Sigma-Aldrich		O composto usado para curarizar os animais Violeta
Cresyl	Sigma-Aldrich
Anti-sépticos tópicos (Betadine 10%)	Meda Pharma (Milão, Itália)
Heparina	Sigma-Aldrich
Reagentes de Formaldeído	Carlo Erba (Pomigliano Milanese, Milão, Itália)